CN111826339A - 一株Vero单克隆细胞系及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株Vero单克隆细胞系及其应用，属于病毒培养和疫苗制备领域。本发明的Vero单克隆细胞系Vero‑TB对PRRSV极其敏感，后者在Vero‑TB中的增殖效率远高于在Marc‑145中的增殖效率。将Vero‑TB培养的PRRSV可用于制备PRRS疫苗，其安全性和有效性俱佳。总之，本发明的细胞系具有十分良好的应用前景。

Description

一株Vero单克隆细胞系及其应用
技术领域
本发明属于病毒培养和疫苗制备领域，特别是涉及一株Vero单克隆细胞系及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRSV(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV)引起的以母猪发热、厌食、流产、死产、木乃伊胎及弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高病死率为特征的传染病。2006年，我国暴发了高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，给我国养猪业造成了严重的经济损失。目前，该病呈世界性分布，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。现已被国际兽疫局(OIE)列为B类传染病，我国将其列为二类传染病。
PRRS疫苗是预防、控制PRRS爆发和蔓延的重要工具。现有的疫苗按照抗原类型不同，主要分为重组蛋白疫苗、活病毒减毒疫苗、灭活疫苗等。灭活疫苗和活疫苗是以灭活病毒/活性病毒为抗原，其生产工艺相对简单，产能较大，是目前防控PRRSV的主流疫苗类型。
PRRS灭活疫苗的生产依赖病毒的人工培养增殖，以产生足够多的抗原。 PRRSV增殖条件要求苟刻，人工培养只能在猪肺泡巨噬细胞(PAM)、Marc-145、 CL-2621及CRL等少数细胞中增殖；而猪的肺和呼吸道上皮细胞、心肾的内皮细胞、鸡胚细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、MDCK细胞等均不能支持PRRSV 的增殖(王隆柏，PRRSV灭活疫苗安全性与免疫原性的测定及其RT-PCR鉴别检测方法的建立，福建农林大学，2009)。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种新的可支持PRRSV大量增殖的细胞系。
本发明的技术方案如下：
一株Vero单克隆细胞系，所述细胞系于2020年03月31日被保藏于湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：C202054，分类命名为：非洲绿猴肾细胞克隆株VERO-TB。
一种PRRSV的培养方法，所述方法是将前述细胞系作为病毒宿主对 PRRSV进行培养。
如前述的培养方法，所述培养包括对所述细胞系附着于微载体进行悬浮培养。
如前述的培养方法，所述PRRSV为CH-1a株。
如前述的培养方法，所述PRRSV为JXA1-R株或TB-PX株。
前述的细胞系或培养方法在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的用途。
如前述的用途，所述疫苗是灭活疫苗。
如前述的用途，所述疫苗的抗原为PRRSV的CH-1a株。
如前述的用途，所述疫苗是活疫苗。
如前述的用途，所述疫苗的抗原为PRRSV的JXA1-R株或TB-PX株。
本发明的细胞系对PRRSV具有比传统体外培养PRRSV用的Marc-145细胞更高的敏感性，可提高PRRSV体外效率，进而提高PRRSV活疫苗或灭活疫苗的生产效率，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：PRRSV接种Vero-TB细胞镜检图；A：Vero-TB未接种PRRSV； B：Vero-TB接种PRRSV产生CPE；C：对应D白光；D：Vero-TB接种PRRSV 荧光观察。
图2：PRRSV接种Marc-145和Vero-TB细胞增殖病毒拷贝数结果。
图3：PRRSV接种Marc-145和Vero-TB细胞增殖病毒的病毒含量结果。
图4：PRRS灭活疫苗(CH-1a株)免疫仔猪后攻毒的体温变化图；BBT-1：表示攻毒前一日仔猪的体温；BBT-2表示攻毒当日仔猪的体温。
图5：PRRS活疫苗(JXA1-R株)对仔猪安全性检验的体温变化图。
具体实施例
实施例1 Vero-TB单克隆细胞系的构建
1 Vero细胞单克隆筛选
制备Vero细胞悬液：用含体积浓度为10％胎牛血清的OMEM培养基将无外源病毒污染的Vero细胞培养长满培养瓶瓶底。用质量体积浓度为0.25％的胰蛋白酶液将Vero细胞消化成单个细胞，铺于96孔板，标记只含有一个细胞的孔，共标记到6孔Vero单克隆细胞。待标记的Vero单克隆细胞长满后消化扩大培养，进行冻存。
2 Vero-TB单克隆细胞系筛选
2.1细胞复苏及病毒接种
将冻存的6株克隆细胞复苏，连续扩传3代，待细胞生长稳定后，将其按照一定数量(4×105个)接种至6孔板，同时设立阴性对照组，37℃5％CO2培养箱培养，待细胞长成致密单层后，PBS清洗细胞1次(2mL/孔)，接种 PRRSV(JXA1-R株)于6孔板中(接毒剂量为体积比1％，混匀于无血清 OMEM中)，轻微混匀病毒培养液使其覆盖细胞表面，37℃5％CO2培养箱孵育1h，用移液器吸取病毒液并弃去，补入病毒繁育培养基2mL(含体积浓度为0.5％胎牛血清的OMEM培养基)，置于37℃5％CO2培养箱中培养，观察细胞病变，结果显示其中一株细胞接种PRRSV后能产生CPE，故将该细胞命名为Vero-TB细胞(图1A和B)。
2.2细胞株的鉴定
将Vero-TB细胞培养至6孔板中，待细胞长满单层后接种PRRSV (JXA1-R株)，孵育1h后补加病毒繁育培养基(含体积浓度为0.5％胎牛血清的OMEM培养基)置于37℃5％CO2培养箱中培养24h后进行间接免疫荧光试验(IFA)，结果显示PRRSV可以在Vero-TB细胞上增殖(图1C和D)。
3 PRRSV(JXA1-R株)在Vero-TB细胞上的增殖曲线
3.1荧光定量PCR方法检测PRRSV(JXA1-R株)样品
将Vero-TB细胞和Marc-145细胞培养至T25细胞方瓶中，待细胞长满单层后接种PRRSV(按体积比1％)，孵育1h后弃掉病毒液补加病毒维持液(含体积浓度为0.5％胎牛血清的OMEM培养基)置于37℃5％CO2培养箱中培养，于接毒后24h、36h、48h、60h、72h和84h收获病毒液。将收获的病毒液取0.15ml利用试剂盒提取RNA，进行反转录后进行PRRSV-QPCR检测PRRSV病毒拷贝数变化，结果如图2。
3.2病毒含量的测定
将收获的病毒液用无血清DMEM细胞培养液稀释，取10-5、10-6、10-7、 10-84个稀释度，分别接种于已长成良好单层、弃去培养液的96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照组。置37℃、含5％CO2培养箱中吸附1小时后，每孔补加含4％胎牛血清的DMEM细胞培养液0.1ml。置37℃、含5％CO2培养箱中培养观察5日，根据Reed-Muench 法计算TCID50结果如图3。
本实施例的结果表明，Vero-TB细胞对PRRSV具有很高的敏感性，比 Marc-145细胞更适于作为体外培养PRRSV的宿主。
Vero-TB细胞于2020年03月31日保藏于湖北省武汉市武昌区八一路299 号武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C202054。
实施例2 Vero-TB细胞在猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(CH-1a株)中的应用
1细胞复苏及传代
从液氮罐中取出1支Vero-TB细胞管置37℃水浴中迅速融，经1000rpm 离心5分钟，弃冻存液用5mL含10％胎牛血清OMEM培养基重新悬浮细胞后加入细胞培养瓶中，置37℃，含5％的CO2培养箱中进行培养。待复苏细胞于培养瓶中长满单层时，用含0.25％胰酶的消化液消化细胞，将消化后的细胞用含10％胎牛血清OMEM培养基生长液重悬细胞，按1∶3～1∶4的比例传代培养。
2 PRRSV(CH-1a株)的增殖
将15L转瓶中生长良好的Vero-TB细胞单层，倒掉培养液，加入0.25％胰酶的消化液消化细胞。然后再将消化的细胞悬液加入准备好的生物反应器(BC-7L)中进行微载体(Cytodex I)细胞悬浮培养，培养体积为3L，其中微载体的浓度为3g/L，pH＝7.2，溶氧为40％，转速为40转/分钟，温度为37℃。待细胞在生物反应器中培养4日后，进行接毒，将细胞生长液全部替换成细胞维持液(含灭活胎牛血清0.5％)，接毒量为0.2MOI。接毒后，每日观察2 次，记录细胞病变(CPE)情况，如出现污染，即应废弃。在接毒后72小时，当微载体上细胞的CPE达到80％以上时，收获抗原，置于-20℃条件下保存。
3病毒含量的测定
将收获的抗原液，用DMEM细胞维持液进行10倍系列稀释，取10-5、 10-6、10-7和10-8等4个稀释度分别接种已生长良好的Marc-145细胞单层的 96孔细胞培养板上(接种前弃去生长液)，每个稀释度作6个孔，200μl/孔。同时设正常细胞对照，置于37℃含5％CO2培养箱中进行培养，每日观察细胞病变，5日后计算TCID50，病毒含量为2×108.0TCID50/ml。
4抗原的灭活及灭活检验
将2中收获的3L抗原，加入BEI溶液，BEI的终浓度为3mM，37℃，灭活24小时，每2小时摇动1次，然后置2～8℃下保存备用。将灭活的抗原液按细胞培养液量的1％接种生长良好的Marc-145单层细胞上，37℃吸附1 小时，倾去抗原液，加入与细胞生长液量相同的细胞维持液，置于37℃培养，培养观察5日；取上述已培养5日的细胞悬液，反复冻融2次，取1ml再次接种到已生长良好的Marc-145单层细胞上，培养5日，观察细胞病变。未观察到细胞病变，说明灭活检验合格，可进行下一步试验。
5灭活疫苗的制备
将Marcol-52白油、司本-85、吐温-85按照体积比为90∶7∶3的比例充分混合，搅拌均匀后，再进行小量分装后，再121℃灭菌30分装，置2～8℃备用，作为油相。灭活检验合格的抗原作为水相。然后将上述水相与油相按质量比1∶2混合进行乳化。无菌分装于灭菌的疫苗瓶中，100ml/瓶。
6灭活疫苗的常规检验
上述乳化好的疫苗外观为乳白色，剂型为油包水型。稳定性、粘度、无菌检验均符合要求。
7对仔猪的安全检验
将上述灭活疫苗颈部肌肉接种28～35日龄的仔猪5头，颈部肌肉分点注射灭活疫苗4ml，观察3周，均未观察到不良反应，说明Vero-TB细胞增殖的PRRSV(CH-1a株)抗原经过一系列的工艺处理后，制备的灭活疫苗对仔猪安全。
8对仔猪的效力检验
取28～35日龄健康易感仔猪5头，每头颈部肌肉注射灭活疫苗2ml，免疫21日后，连同对照组3头一起用105.0TCID50/ml的PRRS VR2332株进行攻毒，每头滴鼻2ml，观察21日。结果表明对照组3头全部发病，免疫组5 头仔猪全部保护，体温分别见图4。
本实施例的结果表明，通过Vero-TB细胞制备得到的PRRS灭活疫苗安全有效。
实施例3 Vero-TB细胞在高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株) 中的应用
1细胞复苏及传代
从液氮罐中取出1支Vero-TB细胞管置37℃水浴中迅速融，经1000rpm 离心5分钟，弃冻存液用5mL含10％胎牛血清OMEM培养基重新悬浮细胞后加入细胞培养瓶中，置37℃，含5％的CO2培养箱中进行培养。待复苏细胞于培养瓶中长满单层时，用含0.25％胰酶的消化液消化细胞，将消化后的细胞用含10％胎牛血清OMEM培养基生长液重悬细胞，按1∶3～1∶4的比例传代培养。
2PRRSV(JXA1-R株)的增殖
将15L转瓶中生长良好的Vero-TB细胞单层，倒掉培养液，加入0.25％胰酶的消化液消化细胞。然后再将消化的细胞悬液加入准备好的生物反应器 (BC-7L)中进行微载体(Cytodex I)细胞悬浮培养，培养体积为3L，其中微载体的浓度为3g/L，pH＝7.4，溶氧为40％，转速为40转/分钟，温度为37℃。待细胞在生物反应器中培养4日后，进行接毒，将细胞生长液全部替换成细胞维持液(含胎牛血清0.5％)，接毒量为0.1MOI。接毒后，每日观察2次，记录细胞病变(CPE)情况，如出现污染，即应废弃。在接毒后72小时，当微载体上细胞的CPE达到80％以上时，收获抗原，置于-20℃条件下保存。
3病毒含量的测定
将收获的抗原液用无血清DMEM细胞培养液做10倍系列稀释，取10-5、 10-6、10-7、10-84个稀释度，分别接种于已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔Marc-145细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照。置37℃、含5％CO2培养箱中吸附1小时后，每孔补加含4％新生牛血清的DMEM细胞培养液0.1ml。置37℃、含5％CO2培养箱中培养观察5日，根据Reed-Muench法计算TCID50。结果为每毫升病毒含量 108.5TCID50。
4抗原的稀释、配苗及冻干
将收获的抗原液根据病毒含量测定结果用DMEM培养基进行适当比例稀释后，用于疫苗配制。将稀释后的抗原液与耐热保护剂按3∶1比例均匀混合。然后再2.0ml/瓶进行定量分装，经冷冻真空干燥制成活疫苗，加盖密封。
5活疫苗的常规检验
对制备的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的性状、无菌、支原体、外源病毒、鉴别检验、剩余水分测定、真空度测定等检测项进行相关检测，结果均符合规定。具体检测结果见表1。
表1高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)活疫苗常规检测结果
Figure RE-GDA0002678466330000061
Figure RE-GDA0002678466330000071
6效力检验
病毒含量测定，将疫苗用无血清DMEM细胞培养液稀释为1头份/ml，再作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度，分别接种于已长成良好单层、弃去培养液的96孔Marc-145细胞培养板，每个稀释度接种6 孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照组。置37℃、含5％CO2培养箱中吸附 1小时后，每孔补加含4％新生牛血清的DMEM细胞培养液0.1ml。置37℃、含5％CO2培养箱中培养观察5日，根据Reed-Muench法计算TCID50。每头份病毒含量应不低于105.5TCID50。通过对冻干活疫苗的病毒含量进行测定，结果显示为106.0TCID50/头份。
7安全检验
用4～6周龄健康易感仔猪5头，接种前观察2～3日，每日定时测定体温1次，取其平均值作为基础体温。每头猪耳根后部肌肉注射疫苗10头份，接种后每日定时测定体温1次，连续观察14日。与接种前相比，精神、食欲应无明显变化，体温升高不超过1℃；若体温超过基础体温1℃，但不超过 1.5℃，且稽留不超过2日也判为合格。具体的体温见图5，仔猪体温稳定，结果就表明制备的活疫苗对仔猪的安全性均符合要求。
本实施例的结果表明，通过Vero-TB细胞制备得到的活疫苗安全有效。
综上，本发明的Vero-TB细胞对PRRSV十分敏感，可以作为病毒宿主帮助PRRSV大量繁殖，其效果明显优于Marc-145细胞，能显著提高PRRS 活疫苗和灭活疫苗的生产效率；同时，通过Vero-TB细胞制备得到的灭活疫苗或活疫苗安全有效。

Claims (10)

1.一株Vero单克隆细胞系，其特征在于：所述细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C202054。
2.一种PRRSV的培养方法，其特征在于：所述方法是将权利要求1所述细胞系作为病毒宿主对PRRSV进行培养。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述培养包括对所述细胞系附着于微载体进行悬浮培养。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述PRRSV为CH-1a株。
5.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述PRRSV为JXA1-R株或TB-PX株。
6.权利要求1所述的细胞系或权利要求2-5任一所述的培养方法在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：所述疫苗是灭活疫苗。
8.如权利要求6或7所述的用途，其特征在于：所述疫苗的抗原为PRRSV的CH-1a株。
9.如权利要求6所述的用途，其特征在于：所述疫苗是活疫苗。
10.如权利要求6或9所述的用途，其特征在于：所述疫苗的抗原为PRRSV的JXA1-R株或TB-PX株。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104056265A (zh) * 2014-07-11 2014-09-24 江苏南农高科技股份有限公司 猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法
US20160279231A1 (en) * 2015-03-20 2016-09-29 Pulike Biological Engineering, Inc. A Method of Attenuating Porcine Pseudorabies Virus, Attenuated Strains of Porcine Pseudorabies Virus, Vaccine Composition and Use Thereof
CN106924726A (zh) * 2015-12-29 2017-07-07 普莱柯生物工程股份有限公司 一种用于预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物及其制备方法和应用
WO2018000722A1 (zh) * 2016-06-27 2018-01-04 普莱柯生物工程股份有限公司 一种预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104056265A (zh) * 2014-07-11 2014-09-24 江苏南农高科技股份有限公司 猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法
US20160279231A1 (en) * 2015-03-20 2016-09-29 Pulike Biological Engineering, Inc. A Method of Attenuating Porcine Pseudorabies Virus, Attenuated Strains of Porcine Pseudorabies Virus, Vaccine Composition and Use Thereof
CN106924726A (zh) * 2015-12-29 2017-07-07 普莱柯生物工程股份有限公司 一种用于预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物及其制备方法和应用
WO2018000722A1 (zh) * 2016-06-27 2018-01-04 普莱柯生物工程股份有限公司 一种预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘金彪;彭大新;吴艳涛;高崧;刘秀梵;: "猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的研制" *
陈晓春;吴华伟;王继文;邓永;郎洪武;高金源;吴晓薇;: "猪繁殖与呼吸综合征毒株在Vero细胞上的增殖验证试验" *

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