CN104056265A - 猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征的二联疫苗及其制备方法。该二联疫苗为冻干疫苗，其中含有猪圆环病毒2型SH株灭活病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒R98株活病毒，同时疫苗稀释液中加入了佐剂，可进一步提高疫苗的免疫效果。本发明提供的二联冻干疫苗抗原之间无免疫干扰作用，该疫苗成品质量检验均可达到各自单苗的质量标准；在免疫保护效果上，其效果优于单苗；该二联冻干疫苗可以简化免疫程序，降低免疫成本，减少免疫猪的应激反应，因此具有较大的市场应用价值。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病二联疫苗及其制备方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的猪的一种急性、高度接触性传染病，是目前我国规模化猪场的主要传染病。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)可造成猪免疫抑制，导致机体抵抗力下降，从而诱发多种病毒和/或细菌的混合感染和继发感染。这两种疾病对养猪业危害十分严重，给养猪业造成了巨大经济损失，疫苗接种免疫仍是我国防治猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒2型的主要方法。目前猪用疫苗品种较多，多疫苗、多针次免疫一方面费时费力，另一方面会增加猪体的应激反应，影响免疫效果。
目前市场上已有猪繁殖与呼吸综合征与猪圆环病毒病相应的单苗，需要多次分别注射，接种动物产生的应激反应强，使用不方便，而多联疫苗虽然使用比较方便，但疫苗各免疫抗原成分之间往往会产生干扰作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒感染猪体均能产生免疫抑制作用，因此在制备猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒二联疫苗时，应保证两者不产生免疫干扰现象，即不降低各自的免疫效果。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种含有猪繁殖与呼吸综合征活病毒、猪圆环病毒2型灭活病毒的二联疫苗，可以同时防控蓝耳病、猪圆环病毒病。经动物试验证明，该二联疫苗的两种抗原之间不会产生免疫干扰作用，二联疫苗中猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型产生的免疫效果优于单苗，因此该二联疫苗具有较大的应用价值。
为了实现上述指标，本发明采取了如下技术方案：
1.一种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗，该疫苗为冻干疫苗，含有猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)SH株灭活病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)R98株活病毒。
2.本发明所涉及的猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法，包括以下步骤：
(1)猪圆环病毒2型抗原的制备
1)将检验合格的猪圆环病毒2型(SH株)种毒按(V/V)2％～10％接种至生长成良好单层的PK15-B1细胞瓶中，加入细胞维持液，置37℃下培养。培养4日后收获，置-20℃下冻融3次，收获细胞培养物；
2)对猪圆环病毒2型抗原进行超滤浓缩后使其病毒含量为106.5～107.5TCID50/ml；
3)猪圆环病毒2型抗原中加入终体积比为0.05％～0.5％的β-丙内酯，混合均匀，4℃灭活24～36小时，37℃降解2～4小时；
(2)猪繁殖与呼吸综合征抗原的制备
用转瓶培养Marc145细胞，待长成良好单层后，倒去细胞液，将猪繁殖与呼吸综合征病毒R98株种毒原液按(V/V)2％～10％比例接种于细胞上，轻轻旋转细胞瓶，37℃吸附10分钟，加上细胞维持液，置37℃旋转培养，当病变细胞达75％以上时收获细胞和细胞液，收获后的猪繁殖与呼吸综合征病毒液病毒含量为106.5～107.5TCID50/ml；
(3)配苗将上述灭活后的猪圆环病毒2型(SH株)抗原与猪繁殖与呼吸综合征活病毒(R98株)抗原等量混合，在抗原混合液中加入终体积比为30％～60％的常规冻干保护剂，混匀、定量分装、冻干；
(4)疫苗稀释液的配制在pH6.8～7.2PBS中加入10％～20％的MontanideTM Gel佐剂(W/V)，利用低剪切力的磁力搅拌器乳化30～60分钟，制备疫苗稀释液。
本发明详细实施方式
一、疫苗制备
1.猪圆环病毒2型抗原液的制备与检验
(1)接毒将检验合格的PCV2SH株种毒按(V/V)3％接种至生长成良好单层的PK15-B1细胞瓶中，加入细胞维持液，置37℃下培养。培养4日后收获，置-20℃下冻融3次，收获细胞培养物，取少量样品进行无菌检验及病毒含量的测定。收获后病毒液置于-20℃保存。
(2)无菌检验按《中国兽药典》(中国兽药典委员会，《中华人民共和国兽药典2010年版》三部，中国农业出版社，2011年，本发明以下称《中国兽药典》)附录进行检验，抗原液无菌生长。
(3)病毒含量测定将PCV2SH株病毒液用含4％犊牛血清的DMEM细胞维持液作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-73个稀释度，分别接种PK15-B1细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，100μl/孔，同时设立正常细胞对照，置37℃含5％CO2的培养箱中继续培养24小时，用含2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的DMEM细胞维持液换液，继续培养24小时后进行间接免疫荧光试验，具体方法如下：
1)病毒稀释与接种将PCV2病毒液用含4％犊牛血清的DMEM细胞维持液作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-73个稀释度，分别接种PK15-B1细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，100μl/孔，同时设立正常细胞对照，置37℃含5％CO2的培养箱中继续培养24小时，用含2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的DMEM细胞维持液换液，继续培养24小时。
2)细胞固定弃去营养液，用PBS(0.01mol/L，pH值7.0)洗涤细胞3次；加入冷丙酮(80％丙酮，20％双蒸水)，150μl/孔，置2～8℃下作用30分钟。
3)加入PCV2抗体弃去丙酮，置室温下干燥，用PBS洗涤1次，加入1∶20稀释的PCV2抗体，50μl/孔，置37℃下作用1小时。
4)加入FITC标记的SPA弃去孔内液体，用PBS洗涤5次，加入1∶100稀释的FITC标记的SPA，50μl/孔，置37℃下作用1小时，弃去孔内液体，用PBS洗涤5次。
5)镜检观察将上述细胞培养板置荧光显微镜下观察。正常细胞对照孔应无荧光物质着染；有绿色荧光物质着染的细胞孔，判为PCV2感染阳性。
6)计算TCID50统计每个稀释度病毒接种细胞孔中PCV2阳性的孔数，根据Karber法计算病毒TCID50。
(4)浓缩根据病毒含量测定的结果，对PCV2抗原进行适当倍数的超滤浓缩，对浓缩后抗原进行无菌检验、病毒含量的测定。经检验，该抗原液无菌生长，病毒含量为107.0TCID50/ml。
(5)灭活将检验合格的病毒液中加入终体积为0.2％的β-丙内酯，4℃灭活24小时，37℃降解4小时获得灭活抗原。取少量灭活后病毒液进行无菌检验及灭活检验。
(6)灭活检验取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15细胞，置37℃下吸附1小时，弃去病毒液，加入新的细胞维持液，置37℃下继续培养2日，无细胞病变(CPE)，连续盲传3代后，用IFA法检测，无绿色PCV2阳性细胞产生。
2.猪繁殖与呼吸综合征抗原液的制备及检验
(1)抗原制备用转瓶培养细胞，待长成良好单层后，倒去细胞液，将种毒原液按(V/V)2％比例接种于细胞上，轻轻旋转细胞瓶，37℃吸附10分钟，加上细胞维持液，置37℃旋转培养。每日观察2次，记录细胞病变情况，当病变细胞达75％以上时收获细胞和细胞液，在-20℃以下保存。收获后的猪繁殖与呼吸综合征病毒液进行无菌检验及病毒含量测定。
(2)病毒含量测定将病毒用细胞维持液做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-63个稀释度，各接种于96孔培养板Marc145细胞单层，200μl/孔，置于5％CO2温箱37℃培养5日，观察细胞病变，根据Reed-Muench法计算病毒TCID50。
4.配苗、分装及冻干
将上述灭活好的猪圆环病毒2型抗原与猪繁殖与呼吸综合征活病毒抗原等量混合，在抗原混合液中加入终体积比为50％的冻干保护剂，混匀、定量分装、冻干。
冻干保护剂中成分为(W/V)：蔗糖为20％，脱脂奶粉为5％。
5.疫苗稀释液的制备
在PBS(pH6.8～7.2)中加入10％的MontanideTM Gel佐剂(购自法国SEPPIC公司)(W/V)，利用低剪切力的磁力搅拌器乳化30～60分钟，制备疫苗稀释液。
PBS的成分为：0.15mol/L NaCl，0.025mol/L Na2HPO4，0.005mol/L KH2PO4。
二、疫苗成品检验
(一)成品检验
1.性状检验
微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加疫苗稀释液后迅速溶解。
2.无菌检验、支原体检验
按《中国兽药典》附录进行检验，疫苗无菌、无支原体生长。
3.安全检验
将疫苗用疫苗稀释液稀释成每毫升含10头份，肌肉注射14～21日龄PRRSV抗体阴性、PCV2抗体与抗原阴性健康仔猪3头，每头1ml，观察14日，无异常临床反应。
4.效力检验
(1)猪圆环病毒2型部分
小鼠免疫试验法用5～6周龄PCV2ELISA抗体阴性健康雌性清洁级Balb/c小鼠(PCV2ELISA抗体不高于1:50)15只，分成3组，每组5只。用疫苗稀释液将冻干疫苗稀释至0.5头份/ml，第1组和第2组分别皮下接种参考疫苗(圆环疫苗)和待检疫苗，每只0.2ml，两周后按相同途径和剂量进行第2次接种；第3组不接种，作空白对照。各组小鼠均隔离饲养观察。首免后5周采血，分离血清，测定血清中PCV2ELISA抗体，对照组应全部为阴性，待检疫苗免疫组抗体平均效价应不低于参考疫苗免疫组抗体平均效价，参考疫苗免疫组抗体平均效价应不低于1:800。
(2)猪繁殖与呼吸综合征部分
病毒含量将Marc145细胞培养于细胞瓶中，每隔2日用含10％犊牛血清DMEM营养液按1:2扩大培养；测定疫苗病毒含量前48小时，将该细胞传代接种于96孔培养板，置于5％CO2温箱37℃培养2日，形成细胞单层；按瓶签注明头份，将疫苗用生理盐水稀释为每毫升含1头份，再用细胞维持液做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-63个稀释度病毒液，接种于96孔细胞培养板Marc145细胞单层，每个稀释度重复4孔，0.2ml/孔；然后将细胞板放置于5％CO2温箱37℃培养5日，观察细胞病变(CPE)，根据Reed-Muench法计算TCID50。每头份应不低于105.0TCID50。
4.剩余水分测定
按《中国兽药典》附录进行测定，剩余水分含量应不超过4.0％，说明剩余水分合格。
5.鉴别检验
将疫苗用生理盐水稀释为每毫升含1头份，接种于96孔细胞板Marc145细胞，2孔/样品，100μl/孔，37℃吸附1小时，加入含4％犊牛血清的DMEM细胞维持液，同时设定空白细胞对照，在5％CO2温箱37℃培养24小时；弃去营养液，用PBS缓冲液(0.01mol/L pH值为7.0)洗涤细胞3次；加入冷丙酮(80％丙酮，20％双蒸水)，200μl/孔，4℃30分钟；弃丙酮，在室温下干燥，用PBS缓冲液洗涤1次；加入1:500稀释的美洲型PRRSV单克隆抗体(购自美国VMRD公司)，50μl/孔，37℃1小时；移去孔内液体，用PBS缓冲液洗涤5次；加入1:100稀释的FITC标记羊抗鼠IgG(购自武汉博士德公司)，50μl/孔，37℃1小时；移去孔内液体，用PBS缓冲液洗涤5次，于荧光显微镜下观察。接毒细胞胞浆均有绿色荧光，空白对照组孔细胞浆内无荧光物质着染，说明疫苗中抗原均为PRRSV。
6.外源病毒检验
按《中国兽药典》规定，用荧光抗体检测法及红细胞吸附法进行外源病毒检验。每批疫苗抽取2～3瓶，分别用生理盐水恢复，并稀释至2头份/ml，加入等量蓝耳特异性血清(由南京农业大学姜平教授提供)，混合，37℃中和1h。分别接种至细胞单层达75％以上的VERO、MDBK、ST细胞，每瓶接种1ml，补充适量营养液。另取VERO、MDBK、ST细胞各1瓶不接种，作为阴性对照，5％CO2温箱37℃培养，连续传代2次，传代后收获的培养物用荧光抗体法、红细胞吸附试验进行外源病毒检测。
荧光抗体检测法收获的细胞培养物接种至VERO、MDBK、ST细胞单层的6孔板，每种细胞接种1个孔，同时将分别接种100TCID50PPV、CSFV、BVDV病毒的细胞做为阳性对照，培养5～7日后，按试剂盒所述(猪瘟病毒间接免疫荧光抗体检测试剂盒、猪细小病毒间接免疫荧光抗体检测试剂盒、牛病毒性腹泻间接免疫荧光抗体检测试剂盒购自中国兽医药品监察所)进行荧光检测，阳性对照见特异性荧光，阴性对照无特异性荧光，样品接种孔无特异性荧光，则样品为阴性。
红细胞吸附试验将收获的培养物接种至VERO、MDBK、ST细胞中，培养7日后，PBS洗涤，加入0.2％(V/V)豚鼠红细胞和鸡红细胞等量混合悬液，分别在4℃、25℃放置30分钟，PBS洗涤，显微镜下检查红细胞吸附情况，不出现红细胞吸附现象判为合格。
7.真空度测定
测定疫苗的真空度，各疫苗瓶内均出现紫色辉光，说明疫苗真空度检验合格。
(二)疫苗稀释液的无菌检验
取疫苗稀释液按《中国兽药典》(2010年版)附录中方法进行检验，疫苗稀释液中无菌生长。
本发明涉及的微生物资源信息
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive Respiratory Syndrome virus)R98株，由南京农业大学姜平教授提供，该毒株为我国商品化猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)的生产用种毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株由南京农业大学姜平教授提供，为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)的检验用毒株，该苗由中华人民共和国农业部批准为三类新兽药(农业部公告1222号，2009.06.12发布)。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)SH株(保藏号为CGMCC No.2389)由南京农业大学姜平教授提供；PK15-B1株细胞，由南京农业大学姜平教授提供，该毒株和细胞为我国商品化猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)的生产用种毒和细胞，该疫苗由中华人民共和国农业部批准为二类新兽药(农业部公告1448号，2010.08.27发布)。
本发明的有益效果
(1)猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒感染猪体均能产生免疫抑制作用，二者的混合感染或相互继发感染可导致发病率和死亡率升高，对养殖场造成巨大经济损失，本发明提供的猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒二联疫苗可同时预防两种疫病，确保疫苗的使用效果。
(2)在现有技术中，猪繁殖与呼吸综合征疫苗和猪圆环病毒疫苗都是分开免疫的，需要多次分时注射，动物可产生较强的应激反应，也增加了工作量。本发明提供的猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒二联疫苗可减少了免疫次数，避免多次接种免疫出现的不良反应，同时还大大简化了免疫程序，降低免疫成本。
(3)采用Gel佐剂作为稀释液来配合二联疫苗使用，安全性好，并可产生更好的免疫反应，抗体维持时间更长，免疫效果更佳。
实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不局限于本发明的应用范围，下面实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1
——猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗的制备
以猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗13001、13002、13003批为例
1.猪圆环病毒2型抗原液的制备与检验
(1)将PCV2SH株(CGMCC No.2389，由南京农业大学姜平教授提供)种毒按(V/V)3％接种至生长成良好单层的PK15-B1细胞(由南京农业大学姜平教授提供)瓶中，加入4％犊牛血清DMEM细胞维持液(V/V)，置37℃下培养。培养4日后收获，置-20℃下冻融3次，收获细胞培养物，取少量样品进行无菌检验及病毒含量的测定。收获后病毒液置于-20℃保存。
(2)无菌检验按《中国兽药典》附录中方法进行检验，抗原液均无菌生长。
(3)病毒含量测定将PCV2SH株病毒液用含4％犊牛血清的DMEM细胞维持液(V/V)作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-73个稀释度，分别接种PK15-B1细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，100μl/孔，同时设立正常细胞对照，置37℃含5％CO2的培养箱中继续培养24小时，用含2mmol/L D-氨基葡萄糖盐酸、4％犊牛血清(V/V)的DMEM细胞维持液换液，继续培养24小时后进行间接免疫荧光试验，具体方法如下：
1)病毒稀释与接种将PCV2病毒液用含4％犊牛血清的DMEM细胞维持液作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-73个稀释度，分别接种PK15-B1细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，100μl/孔，同时设立正常细胞对照，置37℃含5％CO2的培养箱中继续培养24小时，用含2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的DMEM细胞维持液换液，继续培养24小时。
2)细胞固定弃去营养液，用PBS(0.01mol/L，pH值7.0)洗涤细胞3次；加入冷丙酮(80％丙酮，20％双蒸水)，150μl/孔，置2～8℃下作用30分钟。
3)加入PCV2抗体弃去丙酮，置室温下干燥，用PBS洗涤1次，加入1∶20稀释的PCV2抗体，50μl/孔，置37℃下作用1小时。
4)加入FITC标记的SPA弃去孔内液体，用PBS洗涤5次，加入1∶100稀释的FITC标记的SPA，50μl/孔，置37℃下作用1小时，弃去孔内液体，用PBS洗涤5次。
5)镜检观察将上述细胞培养板置荧光显微镜下观察。正常细胞对照孔应无荧光物质着染；有绿色荧光物质着染的细胞孔，判为PCV2感染阳性。
6)计算TCID50统计每个稀释度病毒接种细胞孔中PCV2阳性的孔数，根据Karber法计算病毒TCID50。
经检测制备的K13001、K13002、K13003三批PCV2SH株抗原的病毒含量分别为106.0TCID50/ml、106.5TCID50/ml、105.66TCID50/ml。
2.猪圆环病毒2型抗原液的浓缩、灭活及检验
(1)浓缩根据病毒含量测定的结果，对PCV2(SH株)抗原进行超滤浓缩，对浓缩后抗原进行无菌检验、病毒含量的测定。经检验，K13001、K13002、K13003三批PCV2SH株抗原液均无菌生长，病毒含量分别为107.0TCID50/ml、107.33TCID50/ml、106.5TCID50/ml。
(2)灭活将检验合格的病毒液中加入终体积比为0.2％的β-丙内酯，4℃灭活24小时，37℃降解4小时获得灭活抗原。取少量灭活后病毒液进行无菌检验及灭活检验。
(3)灭活检验取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15-B1细胞，置37℃下吸附1小时，弃去病毒液，加入4％犊牛血清的DMEM细胞维持液(V/V)，置37℃下继续培养2日，无细胞病变(CPE)，连续盲传3代后，用IFA法检测，K13001、K13002、K13003三批PCV2SH株抗原样品均无绿色细胞(PCV2阳性)产生，说明灭活检验合格。
3.猪繁殖与呼吸综合征抗原液的制备及检验
(1)用转瓶培养细胞，待长成良好单层后，倒去细胞液，将PRRSV R98株种毒原液按(V/V)2％比例接种于细胞上，轻轻旋转细胞瓶，37℃吸附10分钟，加上细胞维持液，置37℃旋转培养。每日观察2次，记录细胞病变情况，当病变细胞达75％以上时收获细胞和细胞液，在-20℃以下保存。收获后的猪繁殖与呼吸综合征病毒液(R98株)进行无菌检验及病毒含量测定。
(2)病毒含量测定将病毒用细胞维持液做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-63个稀释度，各接种于96孔培养板Marc145细胞单层，200μl/孔，置于5％CO2温箱37℃培养5日，观察细胞病变，根据Reed-Muench法计算病毒TCID50。此次实验得到的三批抗原NK13001、NK13002、NK13003病毒含量为107.45TCID50/ml、107.2TCID50/ml、107.45TCID50/ml、。
4.配苗、分装及冻干
将上述灭活好的猪圆环病毒2型SH株抗原与猪繁殖与呼吸综合征病毒R98株活病毒抗原等量混合，在抗原混合液中加入终体积比为50％的冻干保护剂，混匀、定量分装、冻干。
冻干保护剂中成分为(W/V)：蔗糖为20％，脱脂奶粉为5％。
5.疫苗稀释液的制备
在PBS(pH6.8～7.2)中加入10％的MontanideTM Gel佐剂(W/V)，利用低剪切力的磁力搅拌器乳化30分钟，制备疫苗稀释液。
PBS的成分为：0.15mol/L NaCl，0.025mol/L Na2HPO4，0.005mol/L KH2PO4。
实施例2
——猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗的检验
以猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗13001、13002、13003批为例
1.性状检验
对按上述方法所制的三批二联疫苗进行性状检验，疫苗为微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加疫苗稀释液后迅速溶解。
2.无菌检验、支原体检验
三批疫苗按《中国兽药典》附录中的方法进行检验，三批疫苗均无菌、无支原体生长。
3.安全检验
将三批二联疫苗用疫苗稀释液分别稀释成每毫升含10头份，肌肉注射14～21日龄PRRSV抗体阴性、PCV2抗体与抗原阴性健康仔猪3头，每头1ml，观察14日，接种猪均无异常临床反应。
4.效力检验
(1)猪圆环病毒2型部分
小鼠免疫试验法用5～6周龄PCV2ELISA抗体阴性健康雌性清洁级Balb/c小鼠(购自扬州大学比较医学中心)(PCV2ELISA抗体不高于1:50)25只，分成5组，每组5只。用疫苗稀释液将冻干疫苗稀释至1头份/ml，第1、2、3组分别皮下接种待检疫苗，每只0.2ml；第4组皮下接种圆环参考疫苗(SH株，本申请人生产的疫苗，为参考苗04)作为对照，每只0.2ml，两周后按相同途径和剂量进行第2次接种；第5组不接种，作空白对照。各组小鼠均隔离饲养观察。首免后5周采血，分离血清，测定血清中PCV2ELISA抗体，检测结果显示，阴性对照组抗体效价均＜1:50，全部为阴性，13001、13002、13003批三批二联冻干免疫组抗体平均效价分别为1:3840、1:3200、1:3520，参考疫苗平均效价为1:1440(见表1)。
表1二联苗猪圆环病毒2型效力试验结果
(2)猪繁殖与呼吸综合征部分
病毒含量将Marc145细胞培养于细胞瓶中，每隔2日用含10％犊牛血清DMEM营养液(V/V)按1:2扩大培养；测定疫苗病毒含量前48小时，将该细胞传代接种于96孔培养板，置于5％CO2温箱37℃培养2日，形成细胞单层；按瓶签注明头份，将疫苗用生理盐水稀释为每毫升含1头份，再用含4％犊牛血清的DMEM细胞维持液(V/V)做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-63个稀释度病毒液，接种于96孔细胞培养板Marc145细胞单层，每个稀释度重复4孔，0.2ml/孔；然后将细胞板放置于5％CO2温箱37℃培养5日，观察细胞病变(CPE)，根据Reed-Muench法计算TCID50，三批疫苗中PRRSV的病毒含量分别为106.03TCID50/头份、106.03TCID50/头份、105.93TCID50/头份。
4.剩余水分测定
按现行《中国兽药典》附录进行测定，三批疫苗的剩余水分均＜4％，达到药典标准，剩余水分检验合格(见表2)。
表2不同批次二联疫苗剩余水分检测结果
5.鉴别检验
将三批疫苗用生理盐水稀释为每毫升含1头份，接种于96孔细胞板Marc145细胞，2孔/样品，100μl/孔，37℃吸附1小时，加入含4％犊牛血清的DMEM细胞维持液(V/V)，同时设定空白细胞对照，在5％CO2温箱37℃培养24小时；弃去营养液，用PBS缓冲液(0.01mol/LpH值为7.0)洗涤细胞3次；加入冷丙酮(80％丙酮，20％双蒸水)，200μl/孔，4℃30分钟；弃丙酮，在室温下干燥，用PBS缓冲液洗涤1次；加入1:500稀释的美洲型PRRSV单克隆抗体，50μl/孔，37℃1小时；移去孔内液体，用PBS缓冲液洗涤5次；加入1:100稀释的FITC标记羊抗鼠IgG，50μl/孔，37℃1小时；移去孔内液体，用PBS缓冲液洗涤5次，于荧光显微镜下观察。结果显示接毒细胞胞浆均有绿色荧光，空白对照组孔细胞浆内无荧光物质着染，说明三批疫苗中抗原均为PRRSV。
6.外源病毒检验
按《中国兽药典》规定，用荧光抗体检测法及红细胞吸附法进行外源病毒检验。每批疫苗抽取2-3瓶，分别用生理盐水恢复，并稀释至2头份/ml，加入等量猪繁殖与呼吸综合征特异性血清(由南京农业大学姜平教授提供)，混合，37℃中和1小时。分别接种至细胞单层达75％以上的VERO、MDBK、ST细胞(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)，每瓶接种1ml，补充适量含10％犊牛血清的DMEM营养液(V/V)。另取VERO、MDBK、ST细胞各1瓶不接种，作为阴性对照，5％CO2温箱37℃培养，连续传代2次，传代后收获的培养物用荧光抗体法、红细胞吸附试验进行外源病毒检测。
荧光抗体检测法收获的细胞培养物接种至VERO、MDBK、ST细胞单层的6孔板，每种细胞接种1个孔，同时将分别接种100TCID50PPV、CSFV、BVDV病毒的细胞做为阳性对照，培养5～7日后，按试剂盒所述(猪瘟病毒间接免疫荧光抗体检测试剂盒、猪细小病毒间接免疫荧光抗体检测试剂盒、牛病毒性腹泻间接免疫荧光抗体检测试剂盒购自中国兽医药品监察所)进行荧光检测，阳性对照见特异性荧光，阴性对照物特异性荧光，样品接种孔无特异性荧光，则样品为阴性。
红细胞吸附试验：将收获的培养物接种至VERO、MDBK、ST细胞中，培养7日后，PBS洗涤，加入0.2％(V/V)豚鼠红细胞和鸡红细胞等量混合悬液，分别在4℃、25℃放置30分钟，PBS洗涤，显微镜下检查红细胞吸附情况，不出现红细胞吸附现象判为合格。
结果显示三批疫苗中均无外源病毒污染。
7.真空度测定
测定三批疫苗的真空度，各疫苗内均出现紫色辉光，说明疫苗真空度检验合格。
实施例3
——疫苗稀释液的无菌检验
取3批疫苗稀释液按《中国兽药典》附录进行无菌检验检验，检验结果为疫苗稀释液中无菌生长。
实施例4
——猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗与单苗免疫效果比较
以猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗13001批为例
选取14～21日龄PRRSV、PCV2抗体阴性，PCV2抗原阴性健康仔猪35头，分为7组，每组5头，第1组免疫猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株，本申请人生产的商品疫苗，批号为1304003)，肌肉注射疫苗1头份；第2组免疫猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株，本申请人生产的商品疫苗，批号为1304006)，肌肉注射疫苗1ml，两周后按相同途径和剂量进行第2次免疫；第3、4组免疫猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗，肌肉注射疫苗1头份；第5组为非免疫蓝耳病毒攻毒组；第6组为非免疫猪圆环病毒2型攻毒组；第7组为空白对照组(非免疫、非攻毒)，均隔离饲养观察。
(1)猪繁殖与呼吸综合征病毒攻毒试验
第1、3、5组免疫后30日，用PRRSV-S1株(由南京农业大学姜平教授提供)(105.0TCID50/ml)攻击，滴鼻2ml/头，连续观察28日，在攻毒后7、14、21、28日采血，用RT-PCR检测仔猪血清，同时每日均测定攻毒猪体温，根据临床症状和病毒血症检测结果进行判定。仔猪体温升高(≥40℃)，持续2～3日；食欲减退，精神沉郁；或PRRSV病毒血症至少持续28日，则可判为发病。
攻毒后，第1、3组中均有1头猪体温升高(≥40℃)，维持1日；第5组有3头仔猪体温升高(≥40℃)，持续2～3日；第7组空白对照组体温未有变化；由表3可知，第1组在攻毒后21日未检测到病毒血症，而二联冻干疫苗免疫组于攻毒后日14日就未检测到病毒血症，明显早于蓝耳疫苗免疫组，而非免疫攻毒组其病毒血症持续28日，由此可见，猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗其免疫效果优于猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)，对PRRSV-S1株的攻击起到免疫保护的作用。
表3疫苗免疫PRRSV攻毒后病毒血症检测结果
(2)猪圆环病毒2型攻毒试验
首免后5周对所有猪称重，第2、4、6组各用PCV2SH株(含106.0TCID50/ml)滴鼻1ml、肌肉注射2ml，隔离饲养。攻毒后第4、7日，分别在每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)，每个点接种1ml(4ml/头)，同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11日、19日腹腔再次接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察28日，于第28日称重后扑杀，剖检。根据体温标准、相对日增重和病毒抗原检测进行判定。
体温升高(≥40℃)(每日上午10点左右测定仔猪体温一次)，至少持续3日；根据每头猪的个体相对日增重计算每组猪的平均相对日增重，并将各组的平均相对日增重与空白对照组的平均相对日增重进行比较，当平均相对日增重显著低于空白对照组(P<0.05)时，判定该组所有猪有临床症状；用免疫组化方法检测淋巴结组织，应检测到PCV2抗原。符合上述任何2项，即可判为发病。攻毒对照组应至少4头发病，免疫组应至少4头保护。
由表4及表5可知，猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗组攻毒后，其相对日增重高于猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)免疫组，说明这两种疫苗均能有效的保护仔猪免受猪圆环病毒2型SH株的攻击，但从相对日增重这一生产性能看，二联疫苗组优于猪圆环单苗免疫组。
表4疫苗免疫PCV2攻毒后相对日增重检测结果
备注：a字母相同表示差异不显著(P>0.05)，b字母表示差异显著(P＜0.05)
表5PCV2攻毒后体温变化及免疫组化检测结果
Claims (2)
1.一种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗，其特征在于该疫苗为冻干疫苗，含有猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)SH株灭活病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive Respiratory Syndrome virus，PRRSV)R98株活病毒。
2.一种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)猪圆环病毒2型抗原的制备
将猪圆环病毒2型SH株种毒按(V/V)2％～10％接种至生长成良好单层的PK15-B1细胞瓶中，加入细胞维持液，置37℃下培养。培养4日后收获，经冻融收获细胞培养物；
对猪圆环病毒2型抗原进行超滤浓缩，使其病毒含量为106.5～107.5TCID50/ml；
将检验后的猪圆环病毒2型抗原中加入终体积比为0.05％～0.5％的β-丙内酯，混合均匀，4℃灭活24～36小时，37℃降解2～4小时；
(2)猪繁殖与呼吸综合征抗原的制备
用转瓶培养Marc145细胞，待长成良好单层后，倒去培养液，将猪繁殖与呼吸综合征病毒R98株种毒原液按(V/V)2％～10％接种于细胞上，轻轻旋转细胞瓶，37℃吸附10分钟，加上细胞维持液，置37℃旋转培养，当病变细胞达75％以上时收获细胞和细胞液，收获后的猪繁殖与呼吸综合征病毒液病毒含量为106.5～107.5TCID50/ml；
(3)配苗将上述灭活后的猪圆环病毒2型SH株抗原、猪繁殖与呼吸综合征活病毒R98株抗原等量混合，在抗原混合液中加入终体积比为30％～60％的常用冻干保护剂，混匀、定量分装、冻干；
(4)疫苗稀释液的配制在pH6.8～7.2PBS中加入10％～20％的MontanideTM Gel佐剂(W/V)，利用低剪切力的磁力搅拌器乳化30～60分钟，制成疫苗稀释液。
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Denomination of invention: Porcine Circovirus Type 2, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Combination Vaccine and Its Preparation Method Granted publication date: 20160427 Pledgee: Jiangyin Jiangsu rural commercial bank Limited by Share Ltd. South Gate Branch Pledgor: JIANGSU NANNONG HI-TECH CO.,LTD. Registration number: Y2024980021520 |