CN105797150A

CN105797150A - 制备猪圆环病毒灭活疫苗的方法

Info

Publication number: CN105797150A
Application number: CN201610145865.6A
Authority: CN
Inventors: 严伟东; 何启盖; 陈芳洲; 李梦莹; 叶十; 叶十一; 李中华; 郭效珍; 陈焕春
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2016-03-15
Filing date: 2016-03-15
Publication date: 2016-07-27

Abstract

本发明公开了一种制备猪圆环病毒灭活疫苗的方法，该方法将PK15、ST或BHK‑21分别经EDTA‑胰酶消化后传代，用细胞生长液继续培养，细胞长满85％～100％时，用细胞维持液细胞数量；将猪圆环病毒2b型毒株接种长满85％～100％细胞的介质上，培养收集毒株；将毒株收毒接种长满85％～95％细胞的介质上，培养收集得到猪圆环病毒2b型毒株抗原液；灭活再加入免疫佐剂，经乳化制备得到灭活疫苗。本发明的方法制备得到的疫苗的抗原稳定性强、免疫原性高、抗原回收率高和疫苗安全性强。本发明的灭活方法与甲醛灭活的方法进行对比，两种灭活方法制备得到灭活疫苗免疫猪后，血清抗体效价较高，其中用0.002mol/L BEI灭活48h的方法得到的灭活疫苗的抗原稳定性、免疫原性、抗原回收率和疫苗安全性最好。

Description

制备猪圆环病毒灭活疫苗的方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，具体地指一种制备猪圆环病毒灭活疫苗的方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)，圆环病毒属(Circovirus)，一种无被膜的单链环状DNA病毒。它有两个血清型，即PCV1和PCV2(Khampee K.,2005)。首先由Tischer(1974)从猪肾传代细胞系中分离获得PCV1。Clark(1991)又在加拿大报道了PCV2是断奶后多系统衰竭综合症(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。随后由Ellis等(1998)首次从PMWS病猪体内分离到。现已证明，当PCV2感染无菌(gnotobiotic,GN)猪、非哺乳(colostrum-deprived,CD)猪和SPF猪后，能够导致PMWS的发生(Krakowka et al.,2000；2001；Allan et al.,2000b)，并且PCV2基因组感染性克隆能够感染SPF猪，并引起与PMWS相一致的病理变化，从而进一步证明了PCV2是引起PMWS发生的必要因素(Fenaux et al.,2002)。除此之外，PCV2和猪皮炎与肾炎综合症(PDNS)、增生性坏死性肿炎(PNP)、猪呼吸道综合征(PRDC)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦有重要关联(West Kh et al.,1999；harms P A et al.,2002；Molnar T et al.,2002)。

我国自从2000年郎洪武首次报道检测出PCV抗原以来已有十几个省报道了有PCV2的感染，流行呈逐渐蔓延的趋势，严重制约了我国养猪业的发展。目前，在国内已有一些防制PCV2感染的疫苗，但PCV2基因型较多，加上体外培养PCV2比较困难且病毒滴度较低，所以针对我国主要流行基因型毒株的分离鉴定并研究其培养条件的优化，不失为一条可取的策略，也为研制PCV2灭活疫苗奠定了良好的基础。

PCV2不仅是一种原发性病因，更重要的是它能够使感染猪的免疫功能受到损害，引起免疫抑制，使发病猪出现并发或继发感染，PMWS主要发生于5～12周龄的断奶仔猪，这主要是由于小猪长到3～5周龄时母源抗体开始下降，以致不能保护仔猪免受PCV2侵害，因此多在断奶后母源抗体水平下降时感染PCV2。而疫苗免疫是防制该病的有效手段，迄今，全球已有4种商品化PCV2疫苗相继问世，并在部分国家和地区推广应用。法国梅里亚动物保健公司研发的PCV2疫苗(Circovac,母猪2针)为矿物油佐剂全病毒灭活苗，用于母猪免疫，该产品于2007年9月首次在欧洲获得批准文号，已在多个国家进行了田间试验。由于PCV2难培养、生长慢，考虑到培养病毒成本高、周期长，人们又摸索出了一些新的方法来制备PCV2仔猪用疫苗，主要包括2种类型：一类是亚单位疫苗，如德国勃林格殷格翰动物保健公司的PCV2疫苗(CircoFlex,水剂1针)和荷兰英特威/先灵葆雅动物保健公司的PCV2疫苗(Circumvent,水剂2针)，其原理是将PCV2基因组中编码免疫原性蛋白的ORF2片段插入到昆虫杆状病毒中，通过培养昆虫杆状病毒即可快速、大量获得具备免疫原性的PCV2核衣壳蛋白，再将其制备成疫苗，大量田间试验表明该类疫苗可为仔猪提供良好的免疫保护。另一类是嵌合病毒灭活苗，原理是将PCV2的ORF2片段置换不致病的PCV1中的ORF2片段，即获得了PCV1-PCV2嵌合病毒，具有与PCV2类似的免疫原性。美国富道动物保健公司研制的PCV2疫苗(Suvaxyn PCV2,水剂1针)即是采用了这种技术，并于2006年在美国第一个获得了完整的许可证。广泛的使用表明，嵌合病毒灭活苗可为猪群提供较好的免疫保护，特别在抑制病毒，减少病毒血症方面具有显著的优势。目前猪圆环病毒疫苗已在预防PCVD上发挥了显著的效果。随着时间的推移，部分进口商品化PCV2疫苗将会逐渐走进我国市场，并且我国也正在自主研发国产化的PCV2疫苗。然而，在当前我国的PCV2疫苗主要为灭活疫苗，本试验已经获得了PCV2WH株的灭活苗的新兽药证书，通过对新灭活工艺的探究能使该疫苗更方便有效的服务广大农户。

我国的PCV2感染情况较为复杂，陈庆新等(2006)应用IFA技术，对浙江省内11个不同地区104个规模化猪场2000-2004年期间的4307个血清样本进行PCV2的血清学流行病学调查，检测结果表明浙江省猪场均存在PCV2感染。祝卫国等(2008)通过对陕西省多个不同地区的规模化养猪场的PCV2抗体进行检测。结果表明：浙江猪群PCV2感染率为68.1％，种猪感染的血清阳性率为66.9％，断奶仔猪感染的血清阳性率为82.1％。PCV2感染的血清阳性率高的种猪和仔猪群PRRSV和PRV的抗体阳性率低；PRRSV的感染率也随着PCV2感染率升高而升高。陕西省该病的平均阳性率为35.9％(171/476)；在不同生长阶段的猪群中，未断奶仔猪阳性率2.3％(2/88)，断奶仔猪阳性率为48.8％(41/84肥育猪阳性率为49.4％(39/79)；种公猪阳性率为16.1％(5/31)，后备母猪阳性率为16.9％(20/118)，经产母猪阳性率为57.5％(69/120)。不同地区PCV2感染的程度具有-定的差异，阳性率从20.0％到65.0％不等。赵海坤(2008)等采集来自江苏扬州和苏州地区157个猪群的疑似猪圆环病毒感染的病料(脾脏、腹股沟淋巴结)并进PCV2的检测，结果发现70.7％的猪群存在PCV2感染。进一步分析显示，单脾脏的PCV2检出率为7.6％，单独淋巴结的PCV2检出率为21.7％，从脾脏淋巴结同时检出PCV2的比例为41.4％。另外，对采自扬州某屠宰场的32份猪股沟淋巴结检测结果表明临床健康猪的PCV2感染率也高达71.9％。

近年来，由PCV2感染所引发的疾病已成为我国规模化猪场的主要疫病，给我国养猪生产造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒病目前无有效的治疗方法，应用猪圆环病毒2型(WH株)做好免疫工作是其重要的防治手段。

发明内容

本发明的目的是提供了一种制备猪圆环病毒灭活疫苗的方法，制备得到的疫苗的抗原稳定性强、免疫原性高、抗原回收率高和疫苗安全性强。

为实现上述目的，本发明提供的一种制备猪圆环病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

1)将PK15、ST或BHK-21分别经EDTA-胰酶消化后传代，用细胞生长液继续培养，细胞长满85％～100％时，用细胞维持液细胞数量；

2)将猪圆环病毒2b型毒株接种长满85％～100％细胞的介质上，用细胞维持液培养12～36h，再用200～400mmol/L的D-氨基葡萄糖在温度为37℃条件下培养20～40min，最后用细胞维持液培养36～48h，收集毒株；其中，猪圆环病毒2b型毒株为2型猪圆环病毒，毒株是WH株，命名为猪圆环病毒2型WH株，将该毒株于2010年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国武汉武汉大学，其微生物保藏编号是：CCTCC No：V 201009；猪圆环病毒2b型毒株的全长序列如SEQ ID No.1所示。

3)将步骤2)收集的毒株收毒接种长满85％～95％细胞的介质上，用细胞维持液培养12～36h，收集得到猪圆环病毒2b型毒株抗原液；

4)用浓度为0.00025～0.002mol/L的BEI对的PCV2b型毒株抗原液灭活22～48h，加入阻断剂终止灭活，再加入免疫佐剂，经乳化制备得到灭活疫苗。

进一步地，所述步骤1)中，培养条件，温度为37℃，环境下含5％CO₂的含量为5％，细胞生长液为含10％血清的DMEM培养基(pH为6.8～7.2)。

再进一步地，所述细胞维持液为含1～3％血清的DMEM，pH为6.8～7.2。

再进一步地，所述步骤2)中，D-氨基葡萄糖的浓度为200～400mmol/L，D-氨基葡萄糖的优选浓度为300mmol/L。

再进一步地，所述步骤4)中，抗原液与免疫佐剂的体积比为1∶1～3。

再进一步地，所述步骤4)中，灭活疫苗中抗原含量为：1mL疫苗中抗原含量都为1×10⁶TCID₅₀。

再进一步地，所述步骤4)中，BEI的浓度为0.002mol/L，灭活时间为48h。

本发明的原理

二乙烯亚胺(Binary ethylenimine,BEI)类灭活剂，其灭活原理是：通过干扰核酸代谢和破坏病毒核酸达到灭活病毒。近年来，BEI已在灭活口蹄疫病毒、鸡法氏囊病病毒、流感病毒等研究和生产领域得到应用，均显示出较好的灭活效果。而尚未有该制剂在PCV2灭苗疫苗中使用的报道，本实验通过BEI与甲醛在灭活效果方面进行对比，对不同浓度的BEI和2‰的甲醛在不同温度下灭活PCV2(WH株)的效果进行观察，以寻找其较理想的灭活剂，并确定最佳的灭活条件，并将其运用于灭活疫苗的制备过程。

本发明的有益效果在于：

本发明制备的猪圆环病毒灭活疫苗的方法，制备得到的疫苗的抗原稳定性强、免疫原性高、抗原回收率高和疫苗安全性强。本发明的灭活方法与甲醛灭活的方法进行对比，两种灭活方法制备得到灭活疫苗免疫猪后，血清抗体效价较高，其中用0.002mol/L BEI灭活48h的方法得到的灭活疫苗的抗原稳定性、免疫原性、抗原回收率和疫苗安全性最好。

附图说明

图1为PCV2的PCR鉴定图片；

图2为荧光免疫对照对比图；

图2a为未接毒PCV2的PK15细胞间接荧光免疫对照；

图2b为感染PCV2的PK15细胞的间接荧光免疫阳性结果；

图3为PEDV的透射电镜照片。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1病毒的培养和鉴定

取PCV2WH株的样品按10％同步接种到新消化的PK-15细胞悬液中，37℃静置培养24h，细胞形成单层后，按Tischer方法加入适量300mmol D-氨基葡萄糖进行处理(以能完全覆盖细胞单层为准)，于37℃培养30min，弃去D-氨基葡萄糖，加入含2％新生牛血清的DMEM维持液继续培养48h，收获病毒，放置-20℃冰箱中暂时保存(长期保存需放置于-80℃)。

病毒的鉴定主要通过PCR方法，间接免疫荧光方法以及电镜观察方法进行确定。

参照GenBank己发表的PCV2毒株(AY122275)核苷酸序列，设计一对引物，引物扩增目的片段大小1767bp，利用两个扩增片段的重叠序列拼接成病毒基因组全长。引物序列如下：

P1：5’-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’，

P2：5’-GAACCGCGGGCTGGCTGAACT TTTGAAAGT-3’。

引物由上海生工生物公司合成。50μL PCR反应体系依次加入去离子水35.5μL，上、下游引物各1μL(工作浓度20μL)，dNTP 5μL(各成分2.5mmol/mL)，10X LABuffer缓冲液5μL，病料组织全基因组模板5μL，LA Taq 5μL。扩增反应条件为：95℃变性9min，94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃再延伸7min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。成功检出结果如图1。

将收取的病毒悬浮液置于PK-15细胞中，接种于96孔板(100μL/孔)，37℃培养24h，用300mmol/L D-氨基葡萄糖溶液孵育30min，用PH为7.4的10mmol/L无菌PBS洗涤2次后用维持液继续培养，同时设不接种病毒的细胞为空白对照组。将上述2组细胞培养48h后弃去细胞维持液，PBS洗涤后用-20℃的冷无水乙醇固定30min，弃去固定液，将96孔细胞板自然晾干。将已固定的96孔板用PBS洗3次，每次5min，自然干燥。向试验和空白对照孔中均分别滴100μLPCV2阴性血清和阳性血清，置37℃温箱中作用1h，PBS洗涤3次(5min/次)。向试验和空白对照孔均滴加用PBS作150∶倍稀释的FITC-羊抗猪IgG，50μL/孔，37℃作用30min，PBS洗涤3次。最后用PBS封底，在倒置荧光显微镜下观察到特异性的荧光(图2)。

透射电镜观察，细胞病变约70％后收细胞培养物，12000rpm离心5min去细胞碎片后，取上清经27000rpm离心2h，使用透射电镜观察该病毒的形态大小，观察到圆形的病毒粒子(图3)。

毒种鉴定：按照《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌、支原体检验，毒种应纯净，且每毫升毒种病毒含量不低于10^5.0TCID₅₀。

实施例2BEI灭活剂的配制

将BEA与0.2mol/L的NaOH溶液在37℃条件下水浴1h，配制成BEI灭活剂，4℃保存备用。

实施例3BEI和2‰的甲醛对病毒液的灭活

在病毒液中分别加入终浓度为0.002mol/L、0.001mol/L、0.0005mol/Ll和0.00025mol/L的BEI以及浓度含量为2‰的甲醛，分别于37℃、32℃、27℃和22℃放置12d，加入阻断剂终止灭活。每天取样，采用间接免疫荧光法测定病毒含量。

表1～4为不同温度条件下浓度为0.002mol/L、0.001mol/L、0.0005mol/L、0.00025mol/L及浓度为2‰的甲醛对PCV2(WH株)的灭活效果。

成品检验：按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌和支原体生长。

本实施例制备的猪圆环病毒灭活疫苗，每1mL抗原的毒价为10⁶TCID₅₀，性状检验、安全检验、效力检验等均合格。

表1 37℃下BEI对猪圆环病毒2型(WH株)的灭活效果(LogTCID₅₀/mL)

表2 32℃下BEI对PCV2(WH株)的灭活效果(LogTCID₅₀/mL)

表3 27℃下BEI对PCV2(WH株)的灭活效果(LogTCID₅₀/mL)

表4 22℃下BEI对PCV2(WH株)的灭活效果(LogTCID₅₀/mL)

实施例4灭活病毒液的配苗分装

将不同温度(37℃、32℃、27℃、22℃)条件下4种浓度(0.002mol/L、0.001mol/L、0.0005mol/L、0.00025mol/L)的BEI和2‰甲醛灭活的病毒液进行配苗和分装，无菌检验合格后，将4种浓度BEI和2‰甲醛灭活配苗的疫苗编为A、B、C、D、E 5组(37℃条件下4种浓度BEI和2‰甲醛灭活后配苗的疫苗编为A1、B1、C1、D1、E1，32℃条件下4种浓度BEI和2‰甲醛灭活后配苗的疫苗编为A2、B2、C2、D2、E2，每个温度条件下得到的疫苗为一组，以此类推)，并将疫苗4℃保存备用。

实施例5不同温度条件下生产的5种疫苗对易感仔猪免疫后的血清抗体产生效果

不同浓度BEI在不同温度下对PCV2的灭活效果

经分析，在各温度下，高浓度的BEI灭活PCV2的效果均优于低浓度的BEI。37℃时，0.002mol/L的BEI能在48h内完全灭活病毒，0.001mol/L的BEI能在72h内完全灭活病毒；32℃下，0.002mol/L的BEI仍能在48h内完全灭活病毒，但速率减缓；27℃与22℃的灭活情况相似，BEI的给各个浓度及甲醛均需要至少96h以上才能完全灭活病毒。甲醛需要72h以上可完全灭活病毒。

表5 A1、B1、C1、D1、E1 5种疫苗对易感仔猪免疫后的血清抗体产生效果

表6 A2、B2、C2、D2、E2 5种疫苗对易感仔猪免疫后的血清抗体产生效果

表7 A3、B3、C3、D3、E3 5种疫苗对易感仔猪免疫后的血清抗体产生效果

表8 A4、B4、C4、D4、E4 5种疫苗对易感仔猪免疫后的血清抗体产生效果

上面的结果显示，BEI灭活后的病毒液配制的4种疫苗注射易感仔猪后产生的抗体水平均高于甲醛灭活后病毒液配制的疫苗。BEI主效应显著，即BEI不同浓度灭活后配制疫苗的抗原完整性与甲醛灭活后病毒液配制疫苗的抗原完整性相比，差异显著，BEI灭活后的病毒液病毒抗原完整性更高。0.002mol/L BEI灭活后的病毒液病毒抗原完整性与其他3个浓度相比，并无明显差异。温度在这个过程中并未表现出明显差异，即在4种温度条件下，经相同浓度的BEI灭活后，病毒液病毒抗原完整性并无太大变化。

实施例6病毒液的灭活验证试验

灭活终止时从病毒液中取样，用DMEM培养基稀释后，接种至PK-15细胞，以接种未灭活的PK-15细胞作为对照。对检验组和对照组于37℃培养4d，收获病毒液；再用收获的病毒液接种健康PK-15细胞，如上操作2次。第3次收获的病毒液用荧光显色法显色，如出现荧光信号视为PCV2未灭活，判为阳性；如未出现荧光信号视为无PCV2，判为阴性。对检验组和对照组的培养物进行冻融，用荧光显色法分别检测PCV2。

灭活病毒液盲传：将灭活好的病毒液接种生长良好的PK-15细胞单层(100mL扁瓶)，每瓶2mL，吸附1h后，加入细胞维持液8mL，置37℃下培养4d后，置-20℃以下冻融细胞培养瓶，将上一代细胞冻融液再接种到下一代细胞扁瓶中，如此进行，将细胞盲传3代。

取灭活后的病毒液100μL与PK-15细胞同步接种于96孔微量板中，置37℃下培养并观察5d，用间接荧光试验进行检测，无阳性信号。由以上临床试验统计数据可知，在37℃条件下，0.002mol/L的BEI能在48h内完全灭活病毒，灭活后的病毒液配制的疫苗注射易感仔猪(抗体低于1:40)后产生的抗体水平，显著高于甲醛灭活后病毒液配制的疫苗注射易感仔猪(抗体低于1:40)产生的抗体水平。经验证，灭活彻底，无活病毒存在。

最后得到结论，BEI对PCV2(WH株)的抗原破坏小，能较好地保持疫苗的有效成分，获取最优的灭活条件，减少灭活过程中抗原损失,并能够稳定抗原结构，提高免疫原性。该方法可保证产品质量的稳定性、均一性，降低了生产的成本。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种制备猪圆环病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：

2)将猪圆环病毒2b型毒株接种长满85％～100％细胞的介质上，用细胞维持液培养12～36h，再用200～400mmol/L的D-氨基葡萄糖在温度为37℃条件下培养20～40min，最后用细胞维持液培养36～48h，收集毒株；

4)用浓度为0.00025～0.002mol/L的BEI对的猪圆环病毒2b型毒株抗原液灭活24～48h，加入阻断剂终止灭活，再加入免疫佐剂，经乳化制备得到灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述制备猪圆环病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：所述步骤1)中，培养条件，温度为37℃，环境下含5％CO₂的含量为3％～8％，细胞生长液为含10％血清的DMEM，其pH值6.8～7.2。

3.根据权利要求1或2所述制备猪圆环病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：所述细胞维持液为含1％～3％血清的DMEM，pH为6.8～7.2。

4.根据权利要求1或2所述制备猪圆环病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：所述步骤2)中，D-氨基葡萄糖的浓度为200～400mmol/L。

5.根据权利要求1或2所述制备猪圆环病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：所述步骤4)中，抗原液与免疫佐剂的体积比为1∶1～3。

6.根据权利要求5所述制备猪圆环病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：所述步骤4)中，灭活疫苗中抗原含量为：每1mL疫苗中抗原含量都为1×10⁶TCID₅₀。

7.根据权利要求6所述制备猪圆环病毒灭活疫苗的方法，其特征在于：所述步骤4)中，BEI的浓度为0.002mol/L，灭活时间为48h。