CN106834241A

CN106834241A - 嵌合型猪圆环病毒活疫苗c1‑402株及其构建方法

Info

Publication number: CN106834241A
Application number: CN201710120656.0A
Authority: CN
Inventors: 高崧; 刘秀梵; 高清清; 王小波; 高如; 高如一; 俞天奇; 李基棕; 程清如
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2017-03-02
Filing date: 2017-03-02
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2037-03-02
Also published as: CN106834241B

Abstract

嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1‑402株及其构建方法，属于疫苗研究生产技术领域，包括PCV1、PCV2毒株的筛选、表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株的构建、重组病毒核酸、氨基酸序列的组成特征与生物学特性。最终获得可用于工业化生产的表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1‑402株）。

Description

嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-402株及其构建方法

技术领域

本发明属于疫苗研究生产技术领域，特别是表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株的构建技术。

背景技术

猪圆环病毒2型（PCV2）严重危害世界养猪业的健康发展，PCV2广泛分布于世界各地。而猪圆环病毒1型（PCV1）是1974年由德国学者Tischer从PK15传代细胞系中作为一种细胞污染物而首次发现的[Tischer I, Rasch R, Tochtermann G, et al.Characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanentpig kidney cell lines[J].Zentralbl Bakteriol Orig A, 1974, 226 ( 2) : 153-167.]，尽管在全球各地流行，但迄今为止并未发现其具有致病能力。而PCV2是随后从病猪体内分离得到的，其与PCV1非常类似，但在抗原性和基因组序列上有很大的差异，因而被命名为猪圆环病毒2型( PCV2 )。所以，根据PCV的致病性与基因组核酸序列的不同将PCV分为PCV1与PCV2两种基因型。因PCV2能够造成断奶仔猪多系统衰竭综合征、繁殖障碍、猪呼吸道病复合征及皮炎和肾病综合征等多种疾病,给世界养猪业造成了严重危害，因此成为国内外研究的热点。

当然，目前研究最多的是PCV2。基于对PCV2核酸序列的比较，又将其分为PCV2a-PCV2e等5个基因亚群，我国目前主要流行的是PCV2b和PCV2d亚群。在20世纪90年代到2000年流行的基因群主要是PCV2a，2001-2010年流行的主要基因群为PCV2b，2011年至今，主要流行PCV2b和PCV2d基因群。[Xiao C T, Halbur, Opriessnig T, et al. Globalmolecular genetic analysis of porcine circovirus type 2 (PCV2) sequencesconfirms the presence of four main PCV2 genotypes and reveals a rapidincrease of PCV2d.[J].J Gen Virol,2015,96:1830-1841.]。为控制猪圆环病毒病的流行，商品化的亚单位疫苗及全病毒灭活疫苗在世界多地的养猪场得到使用，并取得了一定的效果。

PCV2是已知的脊椎动物中最小的可自主复制的无囊膜病毒，具有1.7 kb的单链闭合环状负链DNA基因组，其中有三个研究透彻的开放阅读框[Walia R, Dardari R,Chaiyakul M,et al.Porcine circovirus-2 capsid protein induces cell death inPK15 cells[J].Virology, 2014, 11: 126-132.]。PCV2基因组排列十分紧密，基因组包含11个潜在ORFs，其阅读框大小各异，编码产物大小也相差悬殊。大多数阅读框出现重叠，基因组长度分为两种，一种1767 bp，另一种为1768 bp[Fenaux M, Halbur P G, Gill M,et al.Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV2)from pigs withpostweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions ofNorth America and development of a differential PCR-restriction fragmentlength polymorphism assay to detect and differentiate between infections withPCV1 and PCV2[J].J Clin Microbiol,2000, 38(7):2494-2503.]。ORF1编码参与病毒基因组复制的两种蛋白质，rep和剪接变异体rep'，而ORF2编码主导免疫原性的cap衣壳蛋白。ORF3编码非结构蛋白质，该蛋白具有促凋亡蛋白的特征。PCV2基因组有限的编码容量意味着PCV必须为多功能产物编码，以确保在宿主细胞内稳定高效地复制与转录。

由于PCV2感染危害严重，而疫苗是预防该病的有效手段之一，疫苗自然成为全世界研究的热点。Fenaux等（2004）用PCV2的ORF2基因替换非致病性PCV1相应的ORF2基因成功构建了PCV1-2感染性克隆，其保留了PCV1的非致病性，同时还能诱导猪体产生针对PCV2的特异性抗体[Fenaux M, Opriessnig T, Halbur PG,et al. A chimeric porcinecircovirus (PCV) with the immunogenic capsid gene of the pathogenic PCV type2 (PCV2) cloned into the genomic backbone of the nonpathogenic PCV1 inducesprotective immunity against PCV2 infection in pigs[J].J Virol, 2004,78(12):6297-6303.]。值得强调的是，上述作者在构建PCV1-2时，采用KpnⅠ不完全酶切方法实现PCV1-2双拷贝的构建，经本实验室多年、多次验证，这一方法中的不完全酶切条件难以精准控制，导致构建成功率极低。

发明内容

本发明的第一目的是提出一种嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-402株。

该嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-402株的保藏号为CGMCC No.13593。

该材料于2017年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），建议的分类命名为：嵌合型猪圆环病毒1-2d。

本发明第二目的是提出以上嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-402株的构建方法。

本发明方法包括以下步骤：

1）构建缺失PCV1 ORF2基因组的pSK（+）-PCV1ΔORF2：

以PCV1全基因组为模板，用引物Kpn I-F和引物Kpn I-R扩增出PCV1全基因组；将PCV1全基因组与pGEM-T Easy质粒连接，获得质粒T-PCV1，pBluescript SK（+）载体的酶切及去磷酸化，再通过T-PCV1基因组的酶切、回收和去磷酸化，将PCV1与pSK（+）载体连接，获得重组质粒pSK（+）-PCV1；以质粒pSK（+）-PCV1为模板，用引物Hpa I-R和引物Nar I-F扩增出pSK（+）-PCV1ΔORF2基因；

2）构建重组质粒pSK（+）-sPCV1-2d：

以PCV2d 0402株基因组为模板，用引物Psi I-F和引物Acl I-R扩增出PCV2d ORF2的DNA片段；再将pSK（+）-PCV1ΔORF2与PCV2d ORF2连接得到重组质粒pSK（+）-sPCV1-2d；

3）构建重组质粒pSK（+）-dPCV1-2d：

对重组质粒pSK（+）-sPCV1-2d用KpnⅠ和BstBⅠ进行双酶切，得到1566 bp的条带片段；

对重组质粒pSK（+）-sPCV1-2d用KpnⅠ和BstEⅡ进行双酶切，得到1546 bp的条带片段；

对重组质粒pSK（+）-sPCV1-2d用BstBⅠ和BstEⅡ进行双酶切，得到3428 bp的条带片段；

将上述1566 bp的条带片段、1546 bp的条带片段和3428 bp的条带片段按照1∶1∶3的摩尔比混合，并用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pSK（+）dPCV1-2d，即嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-402株。

以上方法中采用的各引物为：

引物Kpn I-F：5’-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-3’；

引物Kpn I-R：5’-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT -3’；

引物Hpa I-R：

5’-GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCATTACG-3’；

引物Nar I-F：

5’-GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCATCCTATAAAAGTG-3’；

引物Psi I-F：5’-AGGTTATAAGTGGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3’；

引物Acl I-R：5’-GGAAACGTTACCGCAGAAGAAGACACC-3’。

本发明采用特定方法构建一种表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株），通过其核苷酸、氨基酸序列组成与生物学特性鉴定，这种活载体疫苗株可用于工业化生产。

发明的核心避免了国外研究者使用的KpnⅠ不完全酶切过程中反应条件不可控的缺陷，从而大大提高了PCV1-2双拷贝构建的成功率；同时，通过探索不同的转染方法和筛选、使用特定的无PCV1污染的PK-15细胞系等，使得转染后PCV1-2滴度可达10⁵TCID₅₀/mL以上, 高于国外上述研究者报道的10^4.6TCID₅₀/mL。最终获得了完全适用于工厂化生产的表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）。

本发明的主要技术内容在于：通过对PCV1-2单拷贝质粒采用特定的限制性内切酶分别进行三组双酶切，然后进行常规的连接反应实现PCV1-2双拷贝的构建。发明的核心避免了国外研究者使用的KpnⅠ不完全酶切过程中反应条件不可控的缺陷，从而，大大提高了PCV1-2双拷贝构建的成功率；同时，通过探索不同的转染方法和筛选、使用特定的无PCV1污染的PK-15细胞系，使得转染后PCV1-2滴度可达10⁵TCID₅₀/mL以上, 高于国外报道的10^4.6TCID₅₀/mL。最终获得了完全适用于工厂化生产的表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）。

附图说明

图1a为pSK（+）-sPCV1-2d（单拷贝）的构建。

图1b为pSK（+）-dPCV1-2d（C1-402双拷贝）的构建。

图2为KpnⅠ和BstBⅠ双酶切pSK（+）-sPCV1-2d质粒获得1566 bp左右目的片段的电泳图。

图3为KpnⅠ和BstEⅡ双酶切pSK（+）-sPCV1-2d质粒获得1546 bp左右目的片段的电泳图。

图4为BstBⅠ和BstEⅡ双酶切pSK（+）-sPCV1-2d质粒获得3428 bp左右目的片段的电泳图。

图5为BstBⅠ单酶切pSK（+）-dPCV1-2d获得1770 bp与4770 bp左右目的片段的电泳图。

图6为PCV2d ORF2特异性条带的电泳图。

图7为接种PCV2d 0402株的PK-15细胞的IFA图。

图8为接种表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）的PK-15细胞的IFA图。

图9为正常对照细胞IFA图。

图10为试验猪血清荧光抗体消长情况图。

图11为试验猪血清中和抗体消长情况图。

具体实施方式

一、表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）的构建：

设计用于扩增的引物序列如下：

表1 所需引物及内切酶识别序列

引物名称	引物序列	酶

注：下划线部分为各内切酶的识别序列

1、构建缺失PCV1 ORF2基因组的pSK（+）-PCV1ΔORF2：

如图1a所示，以PCV1全基因组为模板，用引物Kpn I-F和引物Kpn I-R扩增出PCV1全基因组；将PCV1全基因组与pGEM-T Easy质粒连接，获得质粒T-PCV1，pBluescript SK（+）载体的酶切及去磷酸化，再通过T-PCV1基因组的酶切、回收和去磷酸化，将PCV1与pSK（+）载体连接，获得重组质粒pSK（+）-PCV1；以质粒pSK（+）-PCV1为模板，用引物Hpa I-R和引物Nar I-F扩增出长度为4065 bp的pSK（+）-PCV1ΔORF2基因。

2、构建重组质粒pSK（+）-sPCV1-2d：

以PCV2d 0402株基因组为模板，用引物Psi I-F和引物Acl I-R扩增出PCV2d ORF2长度约705 bp的DNA片段；将回收纯化的pSK（+）-PCV1ΔORF2与PCV2d ORF2连接得到长度为4770bp的pSK（+）-sPCV1-2d。

3、构建重组质粒pSK（+）-dPCV1-2d：

如图1b所示：

（1）对pSK（+）-sPCV1-2d用KpnⅠ和BstBⅠ进行双酶切，将酶切产物用0.7%的琼脂糖凝胶进行电泳，得到大小分别为204 bp，1566 bp，3000 bp左右的三个条带片段，如图2所示。图2中，M：DL5000 DNA Marker；1：pSK（+）-sPCV1-2d质粒；2：KpnⅠ酶酶切pSK（+）-sPCV1-2d质粒获得3000 bp与1770 bp左右片段；3：BstBⅠ酶酶切1770 bp获得1566 bp与204 bp左右片段。

将孔3中1566 bp左右的条带片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

（2）对pSK（+）-sPCV1-2d用KpnⅠ和BstEⅡ进行双酶切，将酶切产物用0.7%的琼脂糖凝胶进行电泳，得到大小分别为224 bp，1546 bp，3000 bp左右的三个条带片段，如图3所示：M：DL5000 DNA Marker；1：pSK（+）-sPCV1-2b质粒；2：KpnⅠ酶酶切pSK（+）-sPCV1-2b质粒获得1770 bp与3000 bp左右片段；3：BstBⅠ酶酶切1770 bp获得1546 bp与224 bp左右片段。

将孔3中1546 bp左右的条带片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

（3）对pSK（+）-sPCV1-2d用BstBⅠ和BstEⅡ进行双酶切，得到大小分别为1342 bp、3428 bp左右的两条条带片段，如图4所示：M：DL5000 DNA Marker；1：pSK（+）-sPCV1-2d质粒；2：BstBⅠ酶酶切pSK（+）-sPCV1-2d质粒获得4770 bp左右片段；3：BstEⅡ酶第二次酶切获得3428 bp与1342 bp左右片段。

将孔3中3428 bp左右的条带片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

（4）将上述分别回收的目的1566 bp的条带片段、1546 bp的条带片段和3428 bp的条带片段以1:1:3的摩尔比混合，用T4 DNA连接酶于16℃环境中过夜进行连接以获得长度为6540 bp的重组质粒pSK（+）dPCV1-2d。

鉴定：将获得的重组质粒pSK（+）dPCV1-2d连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，并用AIX平板进行蓝白斑筛选阳性克隆。对其中的白色单菌落用BstBⅠ或BstEⅡ进行单酶切，采用电泳条带图鉴定，如图5所示：M：DL5000 DNA Marker；1：BstBⅠ单酶切pSK（+）-dPCV1-2d获得1770 bp与4770 bp左右目的片段；2：BstBⅠ单酶切pSK（+）-sPCV1-2d获得4770bp左右片段。

由图5可见：酶切鉴定重组质粒（pSK（+）-dPCV1-2d）中有1770 bp和4770 bp左右大小的两条条带，而同样的方法酶切单拷贝质粒（pSK（+）-sPCV1-2d）只能获得4770 bp左右目的片段，说明：采用以上方法获得了长度为6540 bp的重组质粒pSK（+）dPCV1-2d。

该材料于2017年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），建议的分类命名为：嵌合型猪圆环病1-2d，保藏号为CGMCC No.13593。

二、表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）的生物学特性鉴定：

材料：重组质粒pSK（+）-dPCV1-2d（即PCV1-2d）、筛选获得的无PCV1污染的PK-15细胞。

猪源PCV2阳性血清（商品化血清或自制血清）。

1、表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗（C1-402株）转染细胞的PCR检测：

将构建成功的重组质粒pSK（+）-dPCV1-2d电转化生长状态良好的无PCV1污染的PK-15细胞，经过5次传代后PCR方法检测到PCV2d ORF2特异性条带电泳图如图6所示，而正常的细胞则未出现条带。

图6中，M：200 bp DNA Marker；1：PCV2d ORF2特异性目的片段。

2、表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗（C1-402株）转染细胞的间接免疫荧光（IFA）检测：

在荧光显微镜下观察到，经转染表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）的PK-15细胞中检测到了明显的特异荧光（如图7所示）；接种PCV2阳性对照的细胞同样出现了特异荧光（如图8所示），而正常对照细胞中则未出现荧光（如图9所示），可见转染表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗（C1-402株）的细胞能够表达PCV2 Cap蛋白。

3、表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗（C1-402株）的TCID₅₀测定：

将长势良好的无PCV1污染的PK-15细胞，经0.25%胰酶消化后，用DMEM培养基将细胞吹匀，分装96孔板，100µL/孔（2×10⁴个细胞/孔），于37℃、5%CO₂培养箱培养，待细胞长至50%左右时，弃去培养基，PBS洗2遍，DMEM培养基将表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）病毒液进行10倍倍比稀释（10^-1~10^-6稀释），每个稀释度8孔，100µL/孔，设置阴性、阳性对照。接种96孔板后于37℃、5%CO₂培养箱中吸附1.5小时后更换2%胎牛血清（FBS）的DMEM维持液继续培养60 h。弃去培养液，PBS洗3遍，每次5 min，拍干后冷甲醇-20固定20 min，弃去固定液，PBS洗3遍，每次5min，吸水纸上拍干。加入用PBS稀释的猪源PCV2阳性血清（1:1000）50µL/孔，37℃孵育1 h，PBS同上洗涤，拍干。避光加入25 µl的1:200稀释的FITC标记的羊抗猪荧光二抗（IgG），避光孵育45 min，PBS同上洗涤，拍干。进行间接免疫荧光（IFA）观察，病毒TCID₅₀按Reed-Muench二氏法计算。

经检测，表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）的TCID₅₀为10^5.4/ml，满足制备疫苗的要求。

三、表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）的免疫效力试验：

1、表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗（C1-402株）免疫试验分组及处理：

收获C1-402病毒液，IFA检测病毒滴度，用PBS将病毒液稀释至10^4.0 TCID₅₀/mL作为免疫用活疫苗。

将19头商品猪随机分为4组，免疫组和攻毒对照组各5头，健康对照组2头，试验分组及处理方法见表2。

表2试验分组及处理情况

2、实验猪在增重、死淘率及其他生产性能方面与对照猪的差异：

攻毒前后对接种猪和对照猪分别测量体温，称重，计算各组的平均值，观察有无差异；同时，在整个试验期间对实验猪、对照猪的各种副反应、发病、死亡情况进行统计。

攻毒前各试验组猪体温均在正常范围。攻毒后免疫组猪无明显临床症状，体温无明显变化，攻毒对照组有3头猪出现精神沉郁，食欲减退，连续2d体温升高（40.3℃-41.5℃）。攻毒前平均相对日增重（ADWG）在0.25-0.53 kg之间，攻毒后ADWG在0.39-0.88 kg之间，各组间差异不显著，见表3。

表3 各试验组体温及ADWG情况（试验猪的分组见表2）

3、血清荧光抗体效价：

表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）活疫苗组免疫前试验猪血清PCV2荧光抗体均为阴性。免疫后14 d两组均有3头猪血清抗体转阳性（1:400），免疫后21 d各组试验猪PCV2的抗体均成阳性，2×10^3.5TCID₅₀免疫组有3头抗体达到1:400，2头抗体达到1:6400，而2×10^4.0TCID₅₀免疫组一头抗体达1:1600，另外分别2头抗体达到1：3200和1:6400。2×10^3.5TCID₅₀免疫组试验猪抗体在42 d达到最高，持续一周，2×10^4.0TCID₅₀免疫组试验猪抗体在35 d达到高峰。免疫14 d后2×10^4.0TCID₅₀免疫组血清抗体均高于2×10^3.5TCID₅₀免疫组，见图10。

由图10可见：表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）活疫苗免疫组，无论单头猪所接受的疫苗病毒的量为2×10^4.0 TCID₅₀，还是2×10^3.5 TCID₅₀的活疫苗病毒，均能产生荧光抗体，只是免疫剂量高的猪抗体速度上升快，滴度高。我们知道，猪圆环病毒（包括嵌合型猪圆环病毒）培养的滴度低，直接导致猪圆环病毒病疫苗是迄今所有猪用疫苗中单价最高的疫苗。因此就单头猪而言，与现有商品化灭活疫苗相比（单头猪所接受的灭活疫苗病毒的量为2×10^5.0 TCID₅₀），在降低疫苗病毒免疫剂量的前提下，活疫苗免疫效果更好。预示着表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）活疫苗具有现有商品化灭活疫苗无可比拟的优越性。

4、血清中和抗体效价：

表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）活疫苗组免疫前试验猪血清均未检测到中和抗体滴度，免疫后14 d可检测到明显的中和抗体效价（1:4-1:8）。2×10^4.0TCID₅₀免疫组免疫后21 d至49 d中和抗体均高于2×10^3.5TCID₅₀免疫组，2×10^4.0TCID₅₀免疫组血清中和抗体42 d达峰值（平均值为1:51.2），高水平中和抗体一直维持到免疫后49 d，2×10^3.5TCID₅₀免疫组血清中和抗体49 d达峰值（平均值为1:48.0）。

攻毒对照组试验猪攻毒后第一周产生中和抗体且持续上升，至剖杀时中和抗体均在1:8-1:16之间，见图11。

由图11可见：表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）两组不同免疫剂量的活疫苗免疫组中和抗体的滴度以及高水平中和抗体均持续较长时间，其中，2×10^4.0TCID₅₀免疫组的中和抗体水平明显高于2×10^3.5TCID₅₀免疫组。与荧光抗体水平相比，中和抗体更能代表疫苗的免疫效果，同样预示表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）活疫苗显著优于现有商品化灭活疫苗。

四、表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）的核苷酸、氨基酸序列：

经对表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）基因组全序列分析，获得的C1-402株的基因组、ORF2基因序列及其与国外构建的PCV1-2a中ORF2基因的序列比较如下：

1、本发明构建的C1-402株基因组核苷酸序列：

ccgaaggccg atttgaagca gtggacccac cctgtgccct tttcccatat aaaataaatt 60

actgagtctt ttttgttatc acatcgtaat ggtttttatt tttattcact tagggttaag 120

tggggggtct ttaagattaa attctctgaa ttgtacatac atggttatac ggatattgta 180

gtcctggtcg tatatactgt tttcgaacgc agtgccgagg cctacatggt ctacatttcc 240

agtagtttgt agtctcagcc agagttgatt tcttttgtta ttgggttgga agtaatcgat 300

tgtcgtatca aggacaggtt tcggggtaaa gtaccgggag tggtaggaga agggctgggt 360

tatggtatgg cgggaggagt agtttacata ggggtcatag gttagggcat tggcctttgt 420

tacaaagtta tcatctagaa taacagcagt ggagcccact cccctgtcac cctgggtgat 480

tggggagcag ggccagaatt caaccttaac cttccttatt ctgtagtatt caaagggcac 540

agtgaggggg tttgagcccc ctcctggggg aagaaaatca ttaatattaa atctcatcat 600

gtccacattc caggagggcg ttctgactgt ggttttcttg acagtataac cgatggtgcg 660

ggagaggcgg gtgttgaaga tgccattttt ccttctccag cggtaacggt ggcgggggtg 720

gactagccag gggcggcggc ggaggatctg gccaagatgg ctgcgggggc ggtgtcttcg 780

tctgcggaaa cgcctccttg gatacgtcat tcatcctata aaagtgaaag aagtgcgctg 840

ctgtagtatt accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcgtca gtgaaaatgc 900

caagcaagaa aagcggcccg caaccccata agaggtgggt gttcaccctt aataatcctt 960

ccgaggagga gaaaaacaaa atacgggagc ttccaatctc cctttttgat tattttgttt 1020

gcggagagga aggtttggaa gagggtagaa ctcctcacct ccaggggttt gcgaattttg 1080

ctaagaagca gacttttaac aaggtgaagt ggtattttgg tgcccgctgc cacatcgaga 1140

aagcgaaagg aaccgaccag cagaataaag aatactgcag taaagaaggc cacatactta 1200

tcgagtgtgg agctccgcgg aaccagggga agcgcagcga cctgtctact gctgtgagta 1260

cccttttgga gacggggtct ttggtgactg tagccgagca gttccctgta acgtatgtga 1320

gaaatttccg cgggctggct gaacttttga aagttagcgg gaagatgcag cagcgtgatt 1380

ggaagacagc tgtacacgtc atagtgggcc cgcccggttg tgggaagagc cagtgggccc 1440

gtaattttgc tgagcctagc gacacctact ggaagcctag tagaaataag tggtgggatg 1500

gatatcatgg agaagaagtt gttgttttgg atgattttta tggctggtta ccttgggatg 1560

atctactgag actgtgtgac cggtatccat tgactgtaga gactaaaggg ggtactgttc1620

cttttttggc ccgcagtatt ttgattacca gcaatcaggc cccccaggaa tggtactcct 1680

caactgctgt cccagctgta gaagctctct atcggaggat tactactttg caattttgga 1740

agactgctgg agaacaatcc acggaggtac 1770

2、C1-402株和国外构建的PCV1-2a中ORF2的核苷酸序列：

本发明C1-402株中ORF2的核苷酸序列为：

tcacttaggg ttaagtgggg ggtctttaag attaaattct ctgaattgta catacatggt 60

tatacggata ttgtagtcct ggtcgtatat actgttttcg aacgcagtgc cgaggcctac 120

atggtctaca tttccagtag tttgtagtct cagccagagt tgatttcttt tgttattggg 180

ttggaagtaa tcgattgtcg tatcaaggac aggtttcggg gtaaagtacc gggagtggta 240

ggagaagggc tgggttatgg tatggcggga ggagtagttt acataggggt cataggttag 300

ggcattggcc tttgttacaa agttatcatc tagaataaca gcagtggagc ccactcccct 360

gtcaccctgg gtgattgggg agcagggcca gaattcaacc ttaaccttcc ttattctgta 420

gtattcaaag ggcacagtga gggggtttga gccccctcct gggggaagaa aatcattaat 480

attaaatctc atcatgtcca cattccagga gggcgttctg actgtggttt tcttgacagt 540

ataaccgatg gtgcgggaga ggcgggtgtt gaagatgcca tttttccttc tccagcggta 600

acggtggcgg gggtggacta gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa gatggctgcg 660

ggggcggtgt cttcgtctgc ggaaacgcct ccttggatac gtcat 705

而国外构建的PCV1-2a [Fenaux M, Halbur PG,Gill M, et al. Geneticcharacterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs withpostweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions ofNorth America and development of a differential PCR-restriction fragmentlength polymorphism assay to detect and differentiate between infections withPCV-1 and PCV-2[J].J Clin Microbiol, 2000, 38(7): 2494-2503.]ORF2的核苷酸数量为702 bp。

将本发明构建的C1-402株与国外构建的PCV1-2a的ORF2进行核苷酸序列比较。结果两者ORF2核苷酸同源性为91%。

ORF2基因编码猪圆环病毒的Cap蛋白，该蛋白为PCV2主要免疫保护性抗原。C1-402株与国外构建的PCV1-2a株中ORF2核苷酸序列同源性为91%，说明：（1）本发明构建的C1-402株所用ORF2基因来自PCV2d 0402株，该毒株分离自我国发病猪，由于ORF2为保护性抗原基因，预示与国外构建的PCV1-2a相比，本发明构建的C1-402株对我国猪圆环病毒病的保护效果更好。（2）本发明构建的C1-402株与国外构建的PCV1-2a株ORF2核苷酸序列同源性有明显差异（9%），其意义在于：一方面ORF2中9% 的核苷酸差异，可以作为本发明构建的C1-402株与国外构建的PCV1-2a株间相互区分的分子标记；另一方面，证明C1-402株为本发明独立构建。

、C1-402株和国外构建的PCV1-2a中ORF2的氨基酸序列的比较：

本发明C1-402株ORF2推导的氨基酸序列为：

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro

1 5 10 15

Arg Ger His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val

20 25 30

His Pro Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe

35 40 45

Asn Thr Arg Leu Ger Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr

50 55 60

Thr Val Arg Thr Pro Ger Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn

65 70 75

Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ger Asn Pro Leu Thr

80 85 90

Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe

95 100 105

Trp Pro Cys Ger Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ger

110 115 120

Thr Gla Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Gla Asn Gla

125 130 135

Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ger Ger Arg His Thr Ile

140 145 150

Thr Gln Pro Phe Ger Tyr His Ger Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro

155 160 165

Val Leu Asp Thr Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg

170 175 180

Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn Val Asp His

185 190 195

Val Gly Leu Gly Thr Gla Phe Glu Asn Ger Ile Tyr Asp Gln Asp

200 205 210

Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn

215 220 225

Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

230

国外构建的PCV1-2a ORF2推导的氨基酸序列为：

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro

1 5 10 15

Arg Ger His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val

20 25 30

His Pro Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe

35 40 45

Asn Thr Arg Leu Ger Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Gla Thr

50 55 60

Thr Val Arg Thr Pro Ger Trp Gla Val Asp Met Met Arg Phe Asn

65 70 75

Ile Asp Asp Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ger

80 85 90

Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg lys Val Lys Val Glu Phe

95 100 105

Trp Pro Cys Ger Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ger

110 115 120

Thr Gla Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Gla Thr Gla

125 130 135

Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ger Ger Arg His Thr Ile

140 145 150

Pro Gln Pro Phe Ger Tyr His Ger Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro

155 160 165

Val Leu Asp Ger Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg

170 175 180

Asn Gln Leu Trp Met Arg Leu Gln Thr Ger Arg Asn Val Asp His

185 190 195

Val Gly Leu Gly Thr Gla Phe Glu Asn Ger Ile Tyr Asp Gln Asp

200 205 210

Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn

215 220 225

Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro

230

将本发明构建成功的C1-402株与国外构建的PCV1-2a对应Cap蛋白的推导氨基酸序列进行比较。结果两者Cap蛋白的氨基酸同源性为92%。

如前所述，ORF2基因编码猪圆环病毒的Cap蛋白，该蛋白为PCV2主要免疫保护性抗原。C1-402株与国外构建的PCV1-2a株中Cap蛋白的氨基酸同源性为92%，同样说明：（1）与国外构建的PCV1-2a相比，本发明构建的C1-233株对我国猪圆环病毒病的保护效果更好。（2）本发明构建的C1-402株与国外构建的PCV1-2a株Cap蛋白的氨基酸同源性有明显差异（8%），同样可以作为本发明构建的C1-402株与国外构建的PCV1-2a株间相互区分的分子标记；另一方面，证明C1-402株为本发明独立构建。

以上结果表明，通过对PCV1-2单拷贝质粒采用特定的限制性内切酶分别进行三组双酶切，然后常规连接实现PCV1-2双拷贝的构建，大大提高了PCV1-2双拷贝构建的成功率。优化转染条件后，表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）滴度可达10^5。0TCID₅₀/mL以上，构建的活病毒效价满足制备疫苗的要求。荧光显微镜观察到，经转染表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗株（C1-402株）的PK-15细胞中检测到了明显的特异荧光，该毒株免疫组猪血清荧光抗体42 d达峰值；该毒株免疫猪高水平中和抗体一直维持到免疫后49 d。因此，表达猪圆环病毒2d型ORF2基因的重组猪圆环病毒1型活载体疫苗（C1-402株）可作为基因工程疫苗使用，为深入研究PCV1与PCV2病毒基因的功能与致病机理奠定了基础，也为其他类似病毒的研究提供了借鉴。

<110>扬州大学

<120>嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-402株及其构建方法

<160>10

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据pSK（+）-sPCV1-2d基因序列设计

<400>1

tttggtaccc gaaggccgat t

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据pSK（+）-sPCV1-2d基因序列设计

<400>2

attggtacct ccgtggattg ttct

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据pSK（+）-sPCV1-2d基因序列设计

<400>3

gaagttaacc ctaaatgaat aaaaataaaa accattacg

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据pSK（+）-sPCV1-2d基因序列设计

<400>4

ggtggcgcct ccttggatac gtcatcctat aaaagtg

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据pSK（+）-sPCV1-2d基因序列设计

<400>5

aggttataag tggtgggggg tctttaagat taa

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据pSK（+）-sPCV1-2d基因序列设计

<400>6

ggaaacgtta ccgcagaaga agacacc

<210>7

<211>1770

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成的C1-402株基因组核酸序列

<400>7

ccgaaggccg atttgaagca gtggacccac cctgtgccct tttcccatat aaaataaatt 60

actgagtctt ttttgttatc acatcgtaat ggtttttatt tttattcact tagggttaag 120

tggggggtct ttaagattaa attctctgaa ttgtacatac atggttatac ggatattgta 180

gtcctggtcg tatatactgt tttcgaacgc agtgccgagg cctacatggt ctacatttcc 240

agtagtttgt agtctcagcc agagttgatt tcttttgtta ttgggttgga agtaatcgat 300

tgtcgtatca aggacaggtt tcggggtaaa gtaccgggag tggtaggaga agggctgggt 360

tatggtatgg cgggaggagt agtttacata ggggtcatag gttagggcat tggcctttgt 420

tacaaagtta tcatctagaa taacagcagt ggagcccact cccctgtcac cctgggtgat 480

tggggagcag ggccagaatt caaccttaac cttccttatt ctgtagtatt caaagggcac 540

agtgaggggg tttgagcccc ctcctggggg aagaaaatca ttaatattaa atctcatcat 600

gtccacattc caggagggcg ttctgactgt ggttttcttg acagtataac cgatggtgcg 660

ggagaggcgg gtgttgaaga tgccattttt ccttctccag cggtaacggt ggcgggggtg 720

gactagccag gggcggcggc ggaggatctg gccaagatgg ctgcgggggc ggtgtcttcg 780

tctgcggaaa cgcctccttg gatacgtcat tcatcctata aaagtgaaag aagtgcgctg 840

ctgtagtatt accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcgtca gtgaaaatgc 900

caagcaagaa aagcggcccg caaccccata agaggtgggt gttcaccctt aataatcctt 960

ccgaggagga gaaaaacaaa atacgggagc ttccaatctc cctttttgat tattttgttt 1020

gcggagagga aggtttggaa gagggtagaa ctcctcacct ccaggggttt gcgaattttg 1080

ctaagaagca gacttttaac aaggtgaagt ggtattttgg tgcccgctgc cacatcgaga 1140

aagcgaaagg aaccgaccag cagaataaag aatactgcag taaagaaggc cacatactta 1200

tcgagtgtgg agctccgcgg aaccagggga agcgcagcga cctgtctact gctgtgagta 1260

cccttttgga gacggggtct ttggtgactg tagccgagca gttccctgta acgtatgtga 1320

gaaatttccg cgggctggct gaacttttga aagttagcgg gaagatgcag cagcgtgatt 1380

ggaagacagc tgtacacgtc atagtgggcc cgcccggttg tgggaagagc cagtgggccc 1440

gtaattttgc tgagcctagc gacacctact ggaagcctag tagaaataag tggtgggatg 1500

gatatcatgg agaagaagtt gttgttttgg atgattttta tggctggtta ccttgggatg 1560

atctactgag actgtgtgac cggtatccat tgactgtaga gactaaaggg ggtactgttc1620

cttttttggc ccgcagtatt ttgattacca gcaatcaggc cccccaggaa tggtactcct 1680

caactgctgt cccagctgta gaagctctct atcggaggat tactactttg caattttgga 1740

agactgctgg agaacaatcc acggaggtac

<210>8

<211>705

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成的C1-402株中ORF2的核苷酸序列

<400>8

tcacttaggg ttaagtgggg ggtctttaag attaaattct ctgaattgta catacatggt 60

tatacggata ttgtagtcct ggtcgtatat actgttttcg aacgcagtgc cgaggcctac 120

atggtctaca tttccagtag tttgtagtct cagccagagt tgatttcttt tgttattggg 180

ttggaagtaa tcgattgtcg tatcaaggac aggtttcggg gtaaagtacc gggagtggta 240

ggagaagggc tgggttatgg tatggcggga ggagtagttt acataggggt cataggttag 300

ggcattggcc tttgttacaa agttatcatc tagaataaca gcagtggagc ccactcccct 360

gtcaccctgg gtgattgggg agcagggcca gaattcaacc ttaaccttcc ttattctgta 420

gtattcaaag ggcacagtga gggggtttga gccccctcct gggggaagaa aatcattaat 480

attaaatctc atcatgtcca cattccagga gggcgttctg actgtggttt tcttgacagt 540

ataaccgatg gtgcgggaga ggcgggtgtt gaagatgcca tttttccttc tccagcggta 600

acggtggcgg gggtggacta gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa gatggctgcg 660

ggggcggtgt cttcgtctgc ggaaacgcct ccttggatac gtcat

<210>9

<211>234

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>C1-402株ORF2推导的氨基酸序列

<400>9

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro

1 5 10 15

Arg Ger His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val

20 25 30

His Pro Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe

35 40 45

Asn Thr Arg Leu Ger Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr

50 55 60

Thr Val Arg Thr Pro Ger Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn

65 70 75

Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ger Asn Pro Leu Thr

80 85 90

Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe

95 100 105

Trp Pro Cys Ger Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ger

110 115 120

Thr Gla Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Gla Asn Gla

125 130 135

Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ger Ger Arg His Thr Ile

140 145 150

Thr Gln Pro Phe Ger Tyr His Ger Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro

155 160 165

Val Leu Asp Thr Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg

170 175 180

Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn Val Asp His

185 190 195

Val Gly Leu Gly Thr Gla Phe Glu Asn Ger Ile Tyr Asp Gln Asp

200 205 210

Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn

215 220 225

Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

230

<210>10

<211>233

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PCV1-2a ORF2推导的氨基酸序列

<400>10

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro

1 5 10 15

Arg Ger His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val

20 25 30

His Pro Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe

35 40 45

Asn Thr Arg Leu Ger Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Gla Thr

50 55 60

Thr Val Arg Thr Pro Ger Trp Gla Val Asp Met Met Arg Phe Asn

65 70 75

Ile Asp Asp Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ger

80 85 90

Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg lys Val Lys Val Glu Phe

95 100 105

Trp Pro Cys Ger Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ger

110 115 120

Thr Gla Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Gla Thr Gla

125 130 135

Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ger Ger Arg His Thr Ile

140 145 150

Pro Gln Pro Phe Ger Tyr His Ger Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro

155 160 165

Val Leu Asp Ger Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg

170 175 180

Asn Gln Leu Trp Met Arg Leu Gln Thr Ger Arg Asn Val Asp His

185 190 195

Val Gly Leu Gly Thr Gla Phe Glu Asn Ger Ile Tyr Asp Gln Asp

200 205 210

Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn

215 220 225

Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro

230

Claims

1. 嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-402株，保藏号为CGMCC No.13593。

2.如权利要求1所述嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-402株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）构建缺失PCV1 ORF2基因组的pSK（+）-PCV1ΔORF2：

2）构建重组质粒pSK（+）-sPCV1-2d：

3）构建重组质粒pSK（+）-dPCV1-2d：

将上述1566 bp的条带片段、1546 bp的条带片段和3428 bp的条带片段按照1∶1∶3的摩尔比混合，并用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pSK（+）dPCV1-2d，即嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-402株；

所述引物Kpn I-F：5’-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-3’；

引物Kpn I-R：5’-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT -3’；

引物Hpa I-R：

5’-GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCATTACG-3’；

引物Nar I-F：

5’-GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCATCCTATAAAAGTG-3’；

引物Psi I-F：5’-AGGTTATAAGTGGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3’；

引物Acl I-R：5’-GGAAACGTTACCGCAGAAGAAGACACC-3’。