KR20130098430A - 돼지 써코바이러스 2형, 돼지 써코바이러스 2형을 포함하는 면역 조성물, 테스트 키트, 및 그 적용 - Google Patents

돼지 써코바이러스 2형, 돼지 써코바이러스 2형을 포함하는 면역 조성물, 테스트 키트, 및 그 적용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중국 타입 컬쳐 컬렉션 센터 (CCTCC)에 수탁 번호 V201117로 기탁된, 돼지의 신종 써코바이러스 2형 (PCV2) 균주를 제공한다. 본 발명은 또한 신종 PCV2 균주를 포함하는 면역 조성물, PCV2 테스트 키트, 및 신종 PCV2 균주의 적용을 제공한다.

Description

돼지 써코바이러스 2형, 돼지 써코바이러스 2형을 포함하는 면역 조성물, 테스트 키트, 및 그 적용{PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2, IMMUNE COMPOSITION CONTAINING THE SAME, ASSAY KIT, AND USE THEREOF}
본 발명은 동물 보건 분야에 관한 것으로서, 더 구체적으로는, 돼지 신종 써코바이러스 2형 (PCV2) 균주, 상기 바이러스 변종을 포함하는 면역 조성물, PCV2 테스트 키트(test kit) 및 상기 바이러스 균주의 적용에 관한 것이다.
돼지 써코바이러스 (PCV)는 돼지 신장 세포계 (PK-15, ATCCCCL33)에서 처음 발견되었다. 돼지 써코바이러스는 PK-15 세포들을 지속적으로 오염시킬 수는 있지만, 오염된 PK-15 세포에서 세포 병변 효과 (cytopathic effect, CPE)를 일으키는 것은 아니다. 또한, PK-15-유도 PCV는 비병원성인 것으로 간주된다. 돼지 써코바이러스가 돼지들을 감염시키기는 하나, 감염된 돼지들에서 병변을 일으키지는 않는다. 돼지 써코바이러스는 1,759 염기쌍(bp)의 원형 게놈을 포함하는 20면체, 외가닥 DNA 바이러스이다. PK-15-유도 PCV는 1995년 써코바이러스과(Circoviridae family)로 분류되었다.
1991년, 돼지 이유후 다조직 소모성 증후군 (post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)이 캐나다에서 최초로 기록되었다. PMWS는 생후 5주 내지 12주의 새끼 돼지들에서 발생한다. 임상적으로는 점진적 체중 감소, 호흡곤란, 창백증, 잦은 황달 등의 증상들을 보이는 것이 특징이다. PMWS의 특징인 미세 병변에는 임파상 기관내 조직구의 침윤을 포함하는 림프성 열화, 폐렴, 육차종성염증, 간염 및 신염 등이 포함된다. 1991년 캐나다에서의 발병 이래, PMWS는 북미, 유럽, 아시아 등지의 많은 국가들에서 보고되어 왔다. 이후, PMWS에 감염된 돼지들에서 신종 써코바이러스가 추출되었다. PMWS-유도 돼지 써코바이러스가 PK-15-유도 PCV와 형태는 유사하나, 게놈 시퀀스에 있어서는 약 68% 내지 76%만이 유사할 뿐이다. 비병원성 PK-15-유도 PCV와 병원성 PMWS-유도 PCV는 각각 돼지 써코바이러스 1형 (PCV1)과 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2)으로 분류되었다.
돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 또한 써코바이러스과(Circoviridae family)에 속한다. PCV2는 외피비보유의, 20면체 외가닥 원형 DNA 바이러스로서, 직경이 17nm에 불과하여, 지금까지 알려진 가장 작은 동물 바이러스 중 하나이다. PCV2 원형 게놈에는 써코바이러스에 일반적인 스템-루프 (stem loop) 구조를 갖는 복제 기점이 포함되어 있다. PCV2 게놈은 1,767 또는 1,768 개의 뉴클레오티드(nucleotide)를 갖고 있으며 11개의 포텐셜 오픈 리딩 프레임 (potential open reading frames-ORF)을 갖고 있는 것으로 추정된다. 상기 11개의 포텐셜 오픈 리딩 프레임 중에서 ORF, ORF 1과 ORF 2가 가장 중요한 유전자로서, 각각 복제 (Rep과 Rep') 단백질과 캡시드 (Cap) 단백질을 암호화(encode)한다. PCV2 ORF2 유전자에 의해 암호화된 캡시드 (Cap) 단백질은 중화 항체의 생성을 유도하는 항원일 가능성이 높다.
PCV2 감염은 전세계 대부분의 양돈장에 널리 퍼져있다. PCV2는 감염된 돼지들 사이에서 낮은 생존율과 낮은 사료 요구율(FCR)로 이어지며, 양돈 산업에 큰 경제적 손실을 가져오는 것으로 나타났다. 따라서, PCV2 테스트 키트 및 PCV2 백신을 개발하는 것이 중요하다.
본 발명은 동물 보건 분야에 관한 것으로서, 더 구체적으로는, 돼지 신종 써코바이러스 2형 (PCV2) 균주, 상기 바이러스 변종을 포함하는 면역 조성물, PCV2 테스트 키트(test kit) 및 상기 바이러스 균주의 적용에 관한 것이다.
본 발명의 제1 양상은 돼지 이유후 다조직 소모성 증후군 (PMWS)의 임상 징후들을 보이는 돼지들로부터 추출된, 더 구체적으로는 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)로 분석되고 확인된 PCV2 균주에 관한 것이다. PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)의 게놈의 양성 (+) 가닥은 SEQ ID No:1의 DNA 시퀀스를 갖는다. PCV2 신균주는 2011년 11월 5일 수탁 번호 V201117로 중국 타입 컬쳐 컬렉션 센터 (China Center for Type Culture Collection, CCTCC)에 기탁되었다.
본 발명의 제2 양상은 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)를 포함하는 면역 조성물에 관한 것이다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 면역 조성물은 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)의 불활성화 바이러스 또는 독성약화 바이러스(attenuated virus) 및 약학적으로 수용 가능한 매개체를 포함하는 백신이다. 그러나, 백신의 종류에는 불활성화 백신, (바이러스 독성약화를 통한) 생(독성약화) 백신, 서브 유닛 백신, DNA 백신, 및 그 외 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주) 또는 신 PCV2 균주 (PCV2 H 균주)의 DNA 또는 아미노산 시퀀스로부터 유래 및 생성된 백신들이 포함되나, 여기에만 한정되지 않는다.
본 발명의 불활성화 과정 (또는 불활성화 처리)에는 불활성화 시약 치료, 열 처리, 및 그 외 당업자에게 알려진 치료법들이 포함되나, 여기에만 한정되지 않는다. 상기 불활성화 시약에는 포름알데히드(formaldehyde), 파라포름알데히드(paraformaldehyde), 베타-프로피오락톤(beta-propiolactone, BPL), 바이너리 에틸렌이민 (binary ethyleneimine, BEI), 또는 그 외 본 발명에 적합한 불활성화 시약들이 포함되나, 여기에만 한정되지 않는다.
상기 약학적으로 수용 가능한 매개체들에는 용제(solvent), 유화제(emulsifier), 서스펜션제(suspending agent), 분해자(decomposer), 결합제(binding agent), 첨가제(excipient), 안정제(stabilizing agent), 킬레이트제(chelating agent), 희석제(diluents), 겔화제(gelling agent), 방부제(preservative), 윤활제(lubricant), 계면활성제(surfactant), 보강제(adjuvant) 또는 그 외 적합한 매개체들이 포함되나 여기에만 한정되지 않는다.
상기 보강제에는 오일 보강제 (광물유, 식물유, 동물유, 완전 프로인트 항원 보강제(Freund? Complete Adjuvant), 불완전 프로인트 항원 보강제(Freund? Incomplete Adjuvant) 등), 수성 보강제 (수산화알루미늄과 같은), 2상 유화 보강제 (수중유중수유제, w/o/w, 유화 보강제), 생물학적 보강제 (CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 톡소이드) 등이 포함되나 여기에만 한정되지 않는다. 상기 2상 유화 보강제에는 계면 활성제 및 유성 물질이 포함된다. 상기 계면 활성제는 솔비톨 지방산 에스테르; 솔비톨 지방산 에스테르와 에틸렌옥사이드 (또는 프로필렌옥사이드) 농축액; 만니톨 지방산 에스테르; 만니톨 지방산 에스테르와 에틸렌옥사이드 (또는 프로필렌옥사이드)의 농축액; 카르복시산, 아민, 아미드, 알코올, 폴리올, 에테르, 및 옥사이드로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 친수기를 갖는 변형된 만니톨 지방산 에스테르; 무수만니톨 지방산 에스테르; 카르복시산, 아민, 아미드, 알코올, 폴리올, 에테르 및 옥사이드로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 친수기를 갖는 변형된 무수만니톨 지방산 에스테르; 사카로스 지방산 에스테르, 사카로스 지방산 에스테르와 에틸렌옥사이드 (또는 프로필렌옥사이드)의 농축액; 글리세롤 지방산 에스테르; 글리세롤 지방산 에스테르와 에틸렌옥사이드 (또는 프로필렌 옥사이드)의 농축액; 지방 알코올과 에틸렌옥사이드 (또는 프로필렌옥사이드)의 농축액, 및 글리세로인지질로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질이다. 상기 유성 물질은 광물유, 식물유, 및 동물유로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질이다.
본 발명의 면역 조성물은 적어도 하나의 병원성 항원을 더 포함한다. 상기 병원성 항원에는 돼지 인플루엔자 바이러스 (Swine influenza virus, SIV)의 항원, 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)의 항원, 마이코플라스마(mycoplasma)의 항원, 돼지 파보바이러스 (porcine parvovirus, PPV)의 항원, 돼지단독(erysipelas)의 항원, 및 위광견(pseudorabies) (아우제스키병) 바이러스의 항원을 포함하나 여기에 한정되지 않는다. 병원성 항원의 종류에는 재조합 단백질, 서브유닛 단백질, 유전자 결손이 있는 병원체, 불활성화 병원성 항원 등을 포함하나 여기에 한정되지 않는다.
본 발명의 제3 양상은 PCV2 감염으로부터 돼지들을 보호하는 방법에 관한 것으로서, PCV2 감염에 대한 면역력 증진, 바이러스혈증(viremia) 및 임상 징후들의 정도 완화, 그리고 생존율 및 체중 증가 등을 위해 상기 PCV2 면역 조성물의 면역학적으로 효과적인 복용량을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제4 양상은 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)에서 유도된 항-PCV2 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 단일클론 항체, 다클론 항체, 및 유전자 조작 항체들을 포함하나 여기에 한정되지 않는다. 바람직한 일 실시예에서, 항체는 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)를 동물에 주사하여 수득한 다클론 항체이다. 또 다른 바람직한 일 실시예에서, 항체는 단일클론 하이브리도마 라이브러리 (hybridoma library) 스크리닝을 통해 수득한 단일클론 항체이다.
본 발명의 제5 양상은 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)의 DNA 단편들(fragments)에 관한 것이다. DNA 단편들은 SEQ ID No: 1, 2, 4, 및 6의 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는다. 상기 DNA 단편들의 적용에는 DNA 백신 및 서브 유닛 백신의 제조, 및 샘플에서 PCV2 바이러스를 검출하기 위한 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)의 설계 등이 포함되나 여기에 제한되지 않는다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 DNA 단편은 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)의 전장(full-length) 게놈 시퀀스 (SEQ ID No: 1)이다. 또 다른 바람직한 일 실시예에서, 상기 DNA 단편들은 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame, ORF)들로서,
SEQ ID No: 3의 아미노산 시퀀스를 암호화한, SEQ ID No: 2의 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 오픈 리딩 프레임 1 (ORF1),
SEQ ID No: 5의 아미노산 시퀀스를 암호화한, SEQ ID No: 4의 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 오픈 리딩 프레임 2 (ORF2), 및
SEQ ID No: 7의 아미노산 시퀀스를 암호화한, SEQ ID No: 6의 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 오픈 리딩 프레임 3 (ORF3)을 포함하나 여기에 한정되지 않는다.
본 발명의 제6 양상은 PCV2에 대한 테스트 키트(test kit)에 관한 것이다. 상기 테스트 키트는 테스트 샘플에서 PCV2 바이러스나 항-PCV2 항체들을 검출하는데 사용된다. 상기 테스트 키트에는 (1) PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)의 항원, (바람직한 일 실시예에서, 상기 항원은 항원 플레이트 상에 침착되어 불활성화 시약으로 불활성화됨); (2) PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)으로부터 유도된 단일클론 또는 다클론 항체; (3) PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)의 전장(full-length) 게놈 시퀀스 (SEQ ID No: 1) 또는 뉴클레오티드 단편들 (SEQ ID No: 2, 4, 및 6)로부터 유도된 유전자 조작 항원 또는 항체; 및 (4) PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)의 전장 게놈 시퀀스 (SEQ ID No: 1)로부터 유도된 폴리뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 단편들 (SEQ ID No: 2, 4, 및 6)이 포함되나 여기에 한정되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드에는 프라이머(primer)와 프로브(probe)들이 포함되나 여기에 한정되지 않는다. 바람직한 일 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)을 검출하는데 사용 가능한 프라이머들이며, 이 프라이머들은 SEQ ID No: 8 내지 11의 뉴클레오티드 시퀀스들을 갖는다.
테스트 키트의 종류에는 효소-연결 면역 흡착 분석법 키트 (enzyme-linked immunosorbent assay kit, ELISA), 마이크로칩 키트 (microchip kit), 면역형광 분석 키트 (immunofluorescent assay kit, IFA kit), 폴리메라아제 연쇄 반응 키트 (polymerase chain reaction kit, PCR kit), 및 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)으로부터 유도된 그 외 테스트 키트들이 포함되나 여기에 한정되지 않는다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 테스트 키트는 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)을 포함하는 적어도 하나의 항원 플레이트를 포함하며, 상기 테스트 키트는 테스트 샘플에서 항-PCV2 항체들을 검출하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)에는 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)과 유사한 바이러스 특성, 게놈, 또는 병원성을 갖는 모든 계대배양 계대(subcultured passage) 및 돌연변이들이 포함된다.
본 발명에서 "DNA (핵산)", "폴리뉴클레오티드", "아미노산", "펩티드", "폴리펩티드" 등은 자연 형태, 추출된 형태, 재조합 형태, 또는 합성 형태로 존재할 수 있다.
"예방하다", "보호하다", 그리고 "대항하다" 등의 용어는, 본 명세서에 기재된 면연 조성물로 접종하지 않은 동물들에 비해, 본 명세서에 기재된 면역 조성물로 접종한 동물들에서 관찰된, PCV2 감염, 및 PCV2 감염으로부터 기인한 관련 질병들에 대한 향상된 대항력 등과 관련 있다.
본 명세서에 기재된 기술 및 과학 용어들의 의미는 당업자가 명백히 이해할 수 있는 것들이다.
본 발명은 이하 도시된 예들을 참조로 더 자세히 설명한다. 이하 예들은 본 발명의 일부 선택된 실시예들에 대한 것이나, 예시적 목적으로 사용되었을 뿐, 본 발명을 한정하지는 않는다.
본 발명은 중국 타입 컬쳐 컬렉션 센터 (CCTCC)에 수탁 번호 V201117로 기탁된, 돼지의 신종 써코바이러스 2형 (PCV2) 균주를 제공한다. 본 발명은 또한 신종 PCV2 균주를 포함하는 면역 조성물, PCV2 테스트 키트, 및 신종 PCV2 균주의 적용을 제공한다.
도 1a: 4일간 배양된, 비감염 PK-15 세포 (배율 (100×));
도 1b: 4일간 배양된, PCV2 H 균주로 감염된 PK-15 세포 (배율 (100×))
도 2: PCV2 H 균주 게놈 시퀀스의 계통발생적 분석
도 3: PCV2 H 균주의 ORF2 아미노산 시퀀스 (SEQ ID No: 5) 및 국립 바이오테크놀로지 인포메이션 센터의 겐뱅크 데이터베이스(GenBank database of National Center for Biotechnology Information, NCBI)에 기탁된 PCV2 H 균주의 ORF2 아미노산 시퀀스와 가장 높은 시퀀스 유사성을 갖는 3개의 아미노산 시퀀스의 배열
도 4: PCV2 H 균주의 ORF2 아미노산 시퀀스 및 PCV2 2d (겐뱅크 기탁번호: ZJ0955b)의 프로토타입(prototype)의 ORF2 아미노산 시퀀스 (겐뱅크 기탁번호: ADD25772)의 배열
도 5: PCV2 H 균주 불활성화 백신으로 접종한 쥐에서 여러 시점에 수집한 혈청 샘플의 PCV2 ELISA 결과
도 6: PCV2 H 균주 불활성화 백신으로 접종한 새끼 돼지들에서 여러 시점에 수집한 혈청 샘플의 PCV2 IFA 결과
실시예 1 PCV2 바이러스의 분리 및 식별
1. 시드 바이러스 (Seed Virus)의 근원 및 분리
대만 신주(Hsin-Chu)의 양돈장에서, 새끼 돼지들의 폐와 림프절에서 조직 샘플을 수집했다. 상기 새끼 돼지들은 돼지 이유후 다조직 소모성 증후군 (post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)의 임상 징후들을 보이는 생후 8주된 새끼 돼지들이었다. 폐와 림프절 샘플은 -70℃에서 수집하고 냉동시켰다.
바이러스 추출을 위해 조직 샘플을 균질화한 후, 각 균질액의 0.2ml에 돼지 써코바이러스(porcine circovirus, PCV), 고전적 돼지 열 바이러스 (classical swine fever virus, CSFV), 돼지 아데노바이러스 (porcine adenovirus), 돼지 파보바이러스 (procine parvovirus), 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV), 위광견병 바이러스 (pseudorabies virus, PRV), 돼지 수포병 바이러스 (swine vesicular disease virus, SVDV), 마이코플라스마(mycoplasma), 그리고 박테리아가 없는 PK-15 단층 세포 또는 그 유도 세포계들을 접종시켰다. 상기 세포들을 5% CO2에서 37℃로 1시간 동안 배양한 후, 살균 인산염 완충액 (sterile phosphate buffered saline, PBS)에서 세포들을 3번 세척했다. 이어, 2%의 FBS를 포함하는 MEM 배지와 5% CO2에서 37℃로 4시간 동안 세포들을 배양했다. 그런 다음, MEM 배지는 버리고, 300mM의 D-글루코사민과 상기 세포들을 30분간 배양했다. 그런 다음, 살균 PBS로 상기 세포들을 3번 세척한 후, 8% FBS를 포함하는 MEM 배지와 5% CO2, 37℃에서 72시간 동안 상기 세포들을 배양했다. 마지막으로, 면역형광시험법 (immunifluorescence assay, IFA)을 통해 PCV2에 대한 상기 세포 배양액 검증 실시했다.
IFA 프로토콜은 아래와 같다. 먼저, 살균 PBS에서 샘플 세포들을 5분 단위로 3번 세척한 후, 4℃에서 30분간 80% 아세톤 75μl으로 고정시켰다. 그런 다음, 아세톤은 버리고, 세포들은 살균 PBS에서 5분 단위로 3번 세척했다. 다음으로, 37℃에서 30분 동안 돼지 써코바이러스 항바이럴 다클론성 항혈청 (porcine circovirus anti-viral polyclonal antiserum, VMRD®)(1차 항체, PBS에서 1:1500 희석)에서 세포들을 배양했다. 이어, 항혈청은 버리고, 세포들은 살균 PBS에서 5분 단위로 3번 세척했다. 그런 다음, 세포들을 37℃에서 30분간 75μl의 토끼 항돼지(rabbit anti-pig) IgG-FITC (전분자(whole molecule))(시가마(Sigama), F1638)(2차 항체, PBS에서 1:1000 희석)에서 배양했다. 이어, 항체는 버리고, 세포들은 PBS에서 5분 단위로 3번 세척했다. 마지막으로, 형광 현미경 검사를 위해 96정(well) 배양 접시에 담긴 세포 샘플들을 200μl의 PBS에 넣었다.
세포들을 감염시키고 IFA의 가장 양성적인 결과를 보인 바이러스를 시드 바이러스(seed virus)로 선정했다. 그런 다음, SEQ ID No: 1에 명시된 대로 시드 바이러스의 게놈 시퀀스를 결정했다. 시퀀스를 배열, 분석한 후, 최종적으로 PCV2의 신균주인 것으로 확인했다 (시퀀스 배열 분석 및 결과는 아래와 같다). 이 PCV2 신균주는 PCV2 H 균주로 명명한다.
2. 시드 바이러스 (Seed Virus) 계대배양(subculture)
새로 준비한 PK-15 세포 또는 그 유도 세포계를 PCV2 신균주 (PCV2 H 균주)로 접종한 후, 접종된 세포들에서 바이러스를 채취했는데, PCV2 H 신균주의 계대(passage) 1(P1)이었다. PCV2 H 균주의 P1을 함유하는 세포 배양 상청액을 수집하고 희석한 후(1:2), 새로 준비한 PK-15 세포 또는 그 유도 세포계들에 접종했다. 접종된 세포들을 3일간 배양하고, PCV2 H 균주의 계대 2(P2)를 포함하는 세포 배양 상청액을 수집했다. 이 과정을 3번 더 실시해 PCV2 H 균주의 계대 6 (P6)을 수득했다.
도 1B에 나타난 바와 같이, PCV2 H 균주로 접종한 PK-15 세포 또는 그 유도 세포계들을 배양하는 과정에서, 접종된 세포들에서 세포 병변 효과 (cytopathic effect, CPE)가 관찰되었다. 또한, 도 1A에서는 4일간의 배양 후 나타난 비접종 PK-15 세포들의 형태와 성장을 도시하고 있고 (100×), 도 1B에서는 4일간의 배양 후 PCV2 H 균주로 접종한 PK-15 세포들의 형태와 성장을 도시하고 있다 (100×). 마찬가지로, PCV2 H 균주로 접종한 PK-15 유도 세포계에서 관측된 CPE도 도 1B를 참조로 설명될 수 있다.
3. 시드 바이러스 (Seed Virus) 식별
본 발명에서 분리된 PCV2 H 균주의 게놈은 SEQ ID No: 1의 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는다. SEQ ID No: 1의 뉴클레오티드 시퀀스를 국립 바이오테크놀로지 인포메이션 센터의 겐뱅크 데이터베이스(GenBank database of National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 시퀀스들과 비교했다. 비교 결과, PCV2 H 균주는 몇몇 PCV2 시퀀스들 (표 1)과 동종의 것으로 나타났으나, PCV2 H 균주의 게놈 시퀀스 (SEQ ID No: 1)와 정확히 동일한 (100% 동종인) 시퀀스는 데이터베이스에 없었다. 따라서, 배열 결과를 비추어볼 때, 본 발명에서 추출한 바이러스 PCV2 H 균주는 PCV2과에 속하는 신균주인 것으로 간주된다. 도 2에 나타난 PCV2 H 균주의 게놈 시퀀스에 대한 계통발생적 분석을 바탕으로 볼 때, PCV2 H 균주는 PCV2 2d 하위그룹에 속하는 것으로 간주된다.
PCV2 H 균주 게놈 DNA와 NCBI의 겐뱅크 데이터베이스의 시퀀스들간의 NCBI BLAST를 통한 비교
수납 번호 설명 최대 점수 총 점수 최대 식별
HM038017 .1 돼지 써코바이러스 2 균주 BDH 3236 3236 99%
GU001710 .1 돼지 써코바이러스 2 분리 BJ0901b 3236 3236 99%
EF675230 .1 돼지 써코바이러스 2 균주 GXHZ-1 3236 3236 99%
GU083583 .1 돼지 써코바이러스 2 분리 PCV2C53 3230 3230 99%
GQ359002 .1 돼지 써코바이러스 2 균주 GX0839 3230 3230 99%
FJ644929 .1 돼지 써코바이러스 2 분리 GL08 3230 3230 99%
FJ426398 .1 돼지 써코바이러스 2 균주 GXWZ -1 3230 3230 99%
HM038030.1 돼지 써코바이러스 2 균주 AH 3229 3229 99%
HM161710.1 돼지 써코바이러스 2 분리 BX-2 3225 3225 99%
한 분석에 따르면, 본 발명의 PCV2 H 균주는 오픈 리딩 프레임 (open reading frames, ORF) 1, 2 및 3을 포함하는 것으로 나타났다. ORF1은 SEQ ID No: 3의 아미노산 시퀀스를 암호화한, SEQ ID No: 2의 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는다. ORF2는 SEQ ID No: 5의 아미노산 시퀀스를 암호화한, SEQ ID No: 4의 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는다. ORF3은 SEQ ID No: 7의 아미노산 시퀀스를 암호화한, SEQ ID No: 6의 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는다.
PCV2 ORF2 유전자에 의해 암호화된 캡시드(capsid) 단백질이 중화 항체의 생성을 유도하는 항원일 가능성이 가장 높기 때문에, PCV 2 H 균주의 ORF2의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID No: 4)와 아미노산 시퀀스 (SEQ ID No: 5)를 NCBI의 겐뱅크 데이터베이스의 시퀀스들과 비교했다. 비교 결과, NCBI의 겐뱅크 데이터베이스의 어떤 시퀀스도 PCV2 H 균주의 ORF2의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID No: 4)나 아미노산 시퀀스 (SEQ ID No: 5)와 동일(100% 동종)하지 않은 것으로 나타났다. PCV2 H 균주의 ORF2의 아미노산 시퀀스 (SEQ ID No: 5)와 겐뱅크 데이터베이스의 시퀀스들 사이에 가장 상동의 시퀀스는 98% 상동한 것으로 나타났다. 도 3은 PCV2 H 균주의 ORF2의 아미노산 시퀀스 (SEQ ID No: 5) 및 가장 상동성이 높은 3개의 시퀀스들의 배열로서, 이에 따르면, SEQ ID No: 5 아미노산 6개가, 가장 유사성이 높은 3개의 시퀀스들과 다른 것으로 나타났다. PCV2 H 균주의 ORF2의 아미노산 시퀀스 (SEQ ID No: 5)를 PCV2 2d 하위그룹 프로토타입(겐뱅크 수납번호: ZJ0955b)의 ORF2의 아미노산 시퀀스(겐뱅크 수납번호: ADD25772)와 추가적으로 비교한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 두 시퀀스들간에 7 개의 아미노산이 다르게 나타났으며, 두 시퀀스들은 97%의 상동성을 갖는 것으로 나타났다.
또한, PCV2 H 균주의 ORF1과 ORF3의 뉴클레오티드 시퀀스들 (SEQ ID No: 2 및 6)과 아미노산 시퀀스들 (SEQ ID No: 3 및 7)을 NCBI의 겐뱅크 데이터베이스의 시퀀스들과 비교했다. 비교 결과, NCBI의 겐뱅크 데이터베이스의 어떤 시퀀스도 PCV2 H 균주의 ORF1이나 ORF3의 아미노산 시퀀스들과 동일(100% 상동)하지 않은 것으로 나타났다.
분석에 따르면, 본 발명의 PCV2 H 균주는 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2)의 신균주인 것으로 나타났다. PCV2 신균주는 2011년 11월 5일부터 수탁 번호 V201117로 중국 타입 컬쳐 컬렉션 센터 (China Center for Type Culture Collection, CCTCC)에 기탁되어왔다.
실시예 2 PCV2 H 균주 백신의 제조
1. 바이러스 배양
돼지 써코바이러스(porcine circovirus, PCV), 고전적 돼지 열 바이러스 (classical swine fever virus, CSFV), 돼지 아데노바이러스 (porcine adenovirus), 돼지 파보바이러스 (porcine parvovirus), 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV), 위광견병 바이러스 (pseudorabies virus, PRV), 돼지 수포병 바이러스 (swine vesicular disease virus, SVDV), 마이코플라스마(mycoplasma), 그리고 박테리아가 없는 PK-15 세포들을, 5% CO2, 37℃에서, 세포 배양 성장 배지 (pH 7.2±0.2의 5% FBS가 함유된 MEM 배지)에서 배양했다. PK-세포 단일층이 형성되자, PK-15 세포들을 0.2% 트립신-EDTA와 분리한 후 세포 수를 세기 (cell-counting) 위해 세포 배양 유지 배지 (pH 7.4±0.2, 2% FBS를 함유하는 MEM 배지)에서 부유시켰다. 다음으로, 최종 농도 3.0×105 세포/ml가 될 때까지 세포들을 세포 배양 성장 배지와 희석시킨 후, 전면 단일층으로 만들기 위해, 롤러병(roller bottle)에 배분하여 37℃에서 3~4일간 배양시켰다. 그런 다음, 롤러병 안의 세포 배양 배지는 버리고, 세포들은 PBS로 세척했다. PCV2 H 균주의 바이럴 스톡 (viral stock)은 최종 농도가 104.0 TCID50/ml가 될 때까지 세포 배양 유지 배지로 희석한 후 롤러병 안에서 PK-세포 단일층들에 접종시켰다. 바이러스 배양을 위해, 감염된 세포들을 37℃에서 48~96 시간 동안 배양시켰다. 면역형광 분석법 (immunofluorescence assay, IFA)을 통해 PCV2 H 균주의 바이러스 역가(virus titer)를 모니터링 했다. 그런 다음, PCV2 H 균주의 바이러스 용액 수집을 위해, 바이러스 역가가 106.0 TCID50/ml 이상 됐을 때, 또는 세포 병변 효과 (Cytopathic effect, CPE)가 70~80%에 도달했을 때 세포 배양 상청액을 채취했다.
2. 불활성화 과정
상기 단계에서 수집한 PCV2 H 균주의 바이러스 용액에, 최종 농도가 0.2%(w/v)가 되도록 37% 중량의 포름알데히드를 첨가했다. 그런 다음, 상기 바이러스를 37℃에서 적어도 24 시간 동안, 바람직하게는 48 시간 동안 포름알데히드와 함께 흔들어서 불활성화시켰다. 상기 바이러스가 완전히 불성화되자 포름알데히드를 제거하기 위해 포름알데히드가 포함된 PCV2 H 균주의 바이러스 용액을 원심 분리했다. 이어, 원심 분리된 바이러스 용액을 증류수나 인산염 완충 식염수 (PBS) 등의 완충액에서 부유시키자, 부유된 바이러스 용액은 PCV2 H 균주 불활성화 백신의 불활성화 항원 스톡이 되었고, 이는 차후 사용을 위해 4℃에서 보관했다.
3. PCV2 H 균주 불활성화 백신의 제조
교반 및 유화용 유화 탱크 안에서, PCV2 H 균주 불활성화 백신의 불활성화 항원 스톡에, 수중유중수유제 항원보강제 (water-in-oil-in-water, W/O/W) 유화를 위한 MONTANIDETM ISA 206 유성 백신 보강제 등과 같은 살균된 2상 유화 보강제를 최종 농도 50% (v/v)가 될 때까지 첨가했다. 유화된 생성물은 오일-보강제가 포함된 PCV2 H 균주 불활성화 백신이다.
이 외에도, 당업자에게 알려진 것이면 본 발명에서 PCV2 불활성화 백신을 위한 보강제로 사용할 수 있다. 본 실시예에서 사용한 상기 2상 유화 보강제 (수중유중수유제 항원보강제) 대신 오일 보강제 (광물유, 식물유, 동물유, 완전 프로인트 항원 보강제, 불완전 프로인트 항원 보강제 등), 수성 보강제 (수산화알루미늄 등), 또는 생물학적 보강제 (CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 톡소이드) 등을 사용할 수 있으나, 여기에 한정되지 않는다.
실시예 3 PCV2 테스트 키트 준비 - 1
본 실시예에서 PCV2 테스트 키트는 PCV2 H 균주의 바이러스 항원을 함유하는 항원 플레이트이다. 먼저, 최종 농도가 2 × 105 세포/ml가 될 때까지, 세포 배양 배지에서, PK-15 세포 또는 그 단일클론 세포계를 배양, 트립신화, 그리고 재부유시켰다. 96정 세포 배양 플레이트(평저)의 각 정(well) 당, PK-15 세포 50 마이크로리터(μl)와 PCV2 H 균주 (1 × 103 TCID50/ml)의 바이럴 스톡 50μl을 첨가하여 5% CO2, 37℃에서 72 시간 동안 배양했다. PCV2 H 균주에 감염된 세포들은 살균된 PBS로 2번 세척한 후 실온에서 15분간 80% 아세톤과 고정시켰다. 그런 다음, 아세톤은 버리고, 세포들은 살균된 PBS로 3번 세척했다. 이어, 상기 플레이트를 뒤집어 37℃ 배양기에서 건조시켰다. 건조된 플레이트는 PCV2 H 균주의 바이러스 항원을 함유하는 항원 플레이트로서, 혈청 샘플에서 PCV2에 대한 항체의 양을 검출하기 위한 ELISA 실험에 사용할 수 있다. 그런 다음, 차후 사용을 위해 20℃에서 플레이트를 보관했다 (Tischer et al., 1995)
실시예 4 PCV2 테스트 키트 준비 - 2
본 실시예에서 PCV2 테스트 키트는 PCV2 H 균주의 재조합 캡시드 단백질을 함유하는 항원 플레이트이다. 상기 재조합 캡시드 단백질은 항원 플레이트의 항원이다. 상기 캡시드 단백질은 PCV2 H 균주의 ORF2 유전자에 의해 암호화되고 SEQ ID No: 5의 아미노산 시퀀스를 갖는다.
PCV2 H 균주의 ORF2 뉴클레오티드 시퀀스는 먼저, 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 통해 복제했다. PCV2 H 균주의 바이럴 DNA는 PCR 반응에서 주형 DNA로 사용했다. 포워드 프라이머(forward primer)와 리버스 프라이머(reverse primer)는 ORF2 뉴클레오티드 시퀀스를 증폭시키도록 설계했다. 본 실시예에서, 상기 포워드 프라이머는 HindIII 분열 분위(cleavage site)를, 리버스 프라이머는 Xho I 분열 분위를 갖는다. 상기 프라이머들은 당업자가 본 발명의 ORF2 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID No: 4)를 바탕으로 설계 가능하다. PCF 반응을 위해, 템플릿 DNA 8μl, 10× PCR 버퍼 (MDBio, Inc.) 5μl, dNTP 8μl(각각 1.25mM), 각 프라이머 1μl(각각 50μM), 그리고 Pfu DNA 중합효소 (MDBio, Inc.) 0.5μl가 함유된 총 중량 50μl의 PCR 혼합액을 진앰프 PCR 시스템 2400 반응기 (GeneAmp PCR System 2400 reactor) (어플라이드 바이오시스템즈, Applied Biosystems)에 넣었다. PCR 반응은 상기 PCR 혼합액을 95℃에서 예열하는 최초 단계로부터 시작되었고, DNA 증폭은 다음의 파라미터들을 기준으로 25 사이클로 이루어졌다; 95℃에서 30초간 변성시키기, 55℃에서 30초간 어닐링하기, 및 72℃에서 30초간 연장시키기. 상기 PCR 반응은 72℃에서 5분간 이루어지는 최종 확장 단계로 마무리되었다. 이렇게 해서 수득한 PCR 생성물은 PCR-M 클린 업 키트 (Clean Up Kit) (비오젠, Viogene)으로 정제시켰다.
정제 후, 상기 PCR 생성물을 pET24a 발현 벡터(expression vector)안으로 주입했다. 정제된 PCR 생성물과 pET24a 발현 벡터 (노바젠, Novagen)는 2가지 제한 효소 (뉴잉글랜드 바이오랩, New England Biolab)인 HindIII와 Xho I으로, 37℃에서 각각 8시간 동안 소화시켰다. 제한 효소 분열 반응 후, 소화된 PCR 생성물과 pET24a 발현 벡터는 각각 PCR ? 클린 업 키트 (비오젠)로 정제시켰다. 정제된 PCR 생성물은 정제된 pET24a 발현 벡터와 결합시켰고, 이렇게 해서 형성된 결합물은 숙주 세포 (E. coli)로 변형되었다. 형질전환주(transformant)를 선택한 후, DNA 염기서열에 의해 맞는 시퀀스를 갖는 클론을 확인하여 pET24a-ORF2으로 명명했다.
pET24a-ORF2를 포함하는 박테리아를 37℃에서 16 내지 18 시간 동안 LB 브로스(broth) 2ml에서 배양한 후, 이 배양액을 카나마이신 25μg/ml를 포함하는 신선한 LB 브로스(broth)에 1:50 비율로 첨가하여 다시 37℃ 에서 200rpm로 배양했다. 상기 배양액의 600nm 파장 (OD600)에서 광학 밀도가 0.6에 도달했을 때, 최종 농도가 1mM가 되도록 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드 (IPTG)를 더 첨가한 후, 다시 37℃ 에서 200rpm로 배양했다. 상기 배양액의 1 밀리리터를 원심 분리한 다음 (10,000 xg), 재조합 단백질이 수용성 단백질인지 봉입체(inclusion body)인지를 B-PERTM 박테리아 단백질 추출법 (Pierce Protein Research Produces)을 통해 판단했다. 40 마이크로리터(μl)의 시약을 상기 원심 분리된 박테리아에 첨가하여 1분간 보텍스(vortex) 믹서에서 흔들어 혼합했다. 그런 다음 상기 혼합액을 10,000 xg에서 원심 분리했다. 상청액에 부유하는 단백질은 수용성 단백질인 반면 하부 (알갱이, pellet)의 단백질은 봉입체였다. 수용성 단백질은 SDS-PAGE 분석을 위해 1x 샘플 버퍼에서 용해한 반면, 상기 봉입체는 SDS-PAGE 분석을 위해 2x 샘플 버퍼와 함께 혼합했다. 두 샘플들 모두 20분간 가열한 후 원심 분리했다. 두 샘플의 상청액 안의 단백질들은 PCV2 H 균주의 재조합 캡시드 단백질의 발현을 분석하기 위해 15%의 SDS-PAGE와 용해시켰다. 분석 후, PCV2 H 균주의 재조합 캡시드 단백질을 사용해 항원 플레이트를 만들었다.
PCV2 H 균주의 재조합 캡시드 단백질은 최종 농도 10μg/ml가 될 때까지 PBS (pH 9.6)로 희석시켰다. 희석된 재조합 단백질은 37℃에서 2 시간 동안 96-정 세포 배양 플레이트 (평저) (100μL/정) 상에 침착한 후, 다시 밤새 4℃에서 침착했다. 그런 다음, 상기 플레이트의 각 정을 3 내지 5분 동안 PBS로 3번 세척한 후, 37℃에서 2 시간 동안 재조합 단백질을 차단하기 위해 200μl의 0.15% BSA 차단 용액을 첨가했다. 플레이트의 각 정을 PBS로 세척한 후, 차후 사용을 위해 4℃에서 보관했다.
실시예 5 항- PCV2 H 균주 항체의 제조
1. 항-PCV2 H 균주 다클론 항체
충분한 바이러스 역가를 갖는 불활성화 PCV2 H 균주는 적합한 보강제, 가령, 완전 프로인트 항원 보강제와 혼합했다. 상기 혼합물을 쥐, 돼지, 염소, 토끼 등의 동물에 1차 접종한 후, 2차 접종은 필요한 경우 적절한 기간 후 (2 내지 3주)에 실시했다. 이어, 또 다시 적절한 기간 후(2 내지 3 주), 접종한 동물들의 혈청을 항-PCV2 H 균주 다클론 항체로 수집했다.
항-PCV2 H 균주 다클론 항체는, 필요한 경우 크로모제닉 리포터(chromogenic reporter)나 형광 물질로 활용할 수 있다.
또한 필요한 경우, 1차 및 2차 접종 후 추가 접종하여 항체 역가를 증진시킬 수 있다.
항-PCV2 H 균주 다클론 항체의 생성을 위해 접종할 수 있는 동물들에는 쥐, 토끼, 새 (알), 돼지, 염소, 소, 및 수중 동물 등이 포함되나 여기에 한정되지 않는다.
2. 항-PCV2 H 균주 단클론 항체
충분한 바이러스 역가를 갖는 불활성화 PCV2 H 균주 또는 PCV2 H 균주의 특정 항원 프레임 (ORF2 등)을 1차적으로 동물 (쥐 등)에 접종했다. 불활성화 바이러스나 항원 단편은, 필요한 경우 완전 프로인트 항원 보강제와 같은 적합한 보강제와 혼합할 수 있다. 또한, 적절한 기간 (2 내지 3주) 후 필요한 경우 2차 접종도 실시할 수 있다. 또 다시 적절한 기간 (2 내지 3주) 후, 접종한 동물의 항체를 수집해 동물의 췌장 세포가 항-PCV2 H 균주 다클론 항체 생성에 적합한지 평가하는데 사용했다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG1500와 같은 PEG)을 사용해, 접종한 동물에서 채취한 적합한 췌장 세포와 골수 세포 (FO 세포계와 NS 세포계)간의 세포 결합을 완성했다. 결합 세포들로부터 적합한 특성을 갖는 항체들을 생성하는 하이브리도마들을 선택한 후 항-PCV2 H 균주 단클론 항체 생성에 적합한 하이브리도마로 서브-복제했다.
항-PCV2 H 균주 다클론 항체는 테스트 키트, 치료 목적, 또는 식품이나 식품 보조제로 사용하여 동물의 면역성을 증진시킬 수 있다.
실시예 6 불활성화 PCV2 백신의 효력 시험 - 1
1. 백신 프로토콜 및 샘플 채취
생후 5 내지 6 주된, 특정-병원체가 없는 (SPF) Balb/c 쥐들을 각각 15 마리로 구성된 임의의 4 개 그룹으로 나눴다. ELISA 실험 결과 60 마리 모두 항-PCV2 항체에 음성 반응을 보였다. 3 개 백신 그룹 (그룹 1 내지 3)의 쥐들에게 0.2ml의 3 가지 다른 롯(lot)의 불활성화 PCV2 H 균주 백신을 근육 주사를 통해 주입했다. 1차 접종(p.i.)으로부터 2주 후, 3 개 백신 그룹의 쥐들에게, 상기와 같은 양의 3 가지 다른 백신 롯을 재주입했다. 그룹 4의 쥐들에게는 접종을 하지 않고 음성 대조군으로 삼았다. 1차 접종(p.i.)으로부터 2, 3, 4, 및 5주 후, 각 그룹에서 5 마리씩을 임의로 선택해 혈청 샘플을 채취했다. 모든 혈청 샘플의 검증은 ELISA를 통해 이루어졌다.
2. ELISA를 통한 항-PCV2 항체 검출
실시예 3 또는 실시예 4에서 준비한 항원 플레이트를 본 실시예에서 ELISA 플레이트로 사용할 수 있다. ELISA 플레이트들을 500μl/L의 트윈(Tween)-20 (예 PBST)를 함유하는 PBS 50 mmol/L (pH 7.2)로 각각 3 내지 5분 동안 3번 세척했다. ELISA 플레이트들을 차단하기 위해, ELISA 플레이트의 각 정에 200μl/L의 0.15% BSA 차단 용액(blocking solution)을 첨가한 후, 37℃에서 2 시간 동안 ELISA 플레이트들을 배양했다. 그런 다음, ELISA 플레이트들을 PBS로 세척했다. 쥐 혈청 샘플들을 PBS 와 50배로 (1:50) 희석한 후 순차적으로 2배로 재희석했다. 희석한 혈청 샘플들을 ELISA 플레이트(100μl/정)의 정(well)들에 첨가한 후, 플레이트들을 37℃에서 1 시간 동안 배양했다. 배양 후, 상기 플레이트들을 PBS 로 세척했다. 겨자무과산화 효소 (horseradish peroxidase, HRP)로 활용한 2차 항체 (가령 토끼 항-쥐 2차 항체)를 상기 정들에 첨가했다. 37℃에서 1 시간 동안 배양한 후, 상기 플레이트들을 PBS로 세척했다. 결과의 가시화를 위해, 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘 (tetramethylbenzidine, TMB)을 상기 정들에 첨가했다. 배양 후, 상기 반응은 2mM H2SO4의 첨가로 중단되었다. 결과는 양성-대-음성 (P/N)의 비로 기록했다. P/N 비는 주어진 테스트 샘플의 450nm(OD450)에서의 광학 밀도를 표준 음성 대조군의 OD450로 나눔으로써 산출했다. P/N 비율 ≥ 2.1을 양성으로 간주했다. P/N 비율 ≥ 2.1의 최대 희석치를 혈청 샘플들의 ELISA 항체 역가로 간주했다.
상기 HRP와 TMB와 함께, 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP), 4-메틸움벨리페릴 포스파타아제 (4-methylumbelliferyl phosphate, MUP), 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC) 등과 같은 기능을 갖는 크로모제닉 리포터(chromogenic reporter) 또는 형광 물질 또한 본 실시예에서 사용할 수 있다.
3. 결과
1차 접종(p.i.)으로부터 2주 후, 접종한 모든 쥐들에서 항-PCV2 H 균주 항체가 검출되었다. 2차 접종 후, 상기 1차 접종으로부터 35일째가 되는 날(d.p.i), 접종 쥐들의 ELISA 항체 역가는 1800 내지 2000에 도달했다 (도 5). 따라서, 이러한 결과들은 본 발명의 불활성화 PCV2 H 균주 백신이 쥐의 면역 반응 유도에 효과적이라는 것을 보여준다.
실시예 7 불활성화 PCV2 백신의 효력 시험 - 2
1. 백신 프로토콜 및 샘플 채취
생후 5 내지 6주의 건강한 새끼 돼지 두 마리에 각각 1ml의 불활성화 PCV2 H 균주 백신을 근육 주사를 통해 주입했다. 1차 접종(p.i.)으로부터 3주 후, 같은 양의 백신을 추가 주입했다. 상기 두 새끼 돼지들로부터, 1차 접종 전 (생후 5 내지 6주), 2차 접종 전(생후 8내지 9주), 그리고 2차 접종으로부터 2주 후 (생후 10 내지 11주)에 각각 혈청 샘플을 채취했다. 두 새끼 돼지 모두 혈청 채취와 같은 시점에 체중을 측정했다. 모든 혈청 샘플은 ELISA를 통해 테스트했다.
2. ELISA에 의한 항-PCV2 항체의 검출
실시예 3 또는 실시예 4에서 준비한 항원 플레이트들을 본 실시예에서 ELISA 플레이트로 사용할 수 있다. ELISA 플레이트들을 500μl/L의 트윈(Tween)-20 (예 PBST)를 함유하는 PBS 50 mmol/L (pH 7.2)로 각각 3 내지 5분 동안 3번 세척했다. ELISA 플레이트들을 차단하기 위해, ELISA 플레이트의 각 정에 200μl/L의 0.15% BSA 차단 용액을 첨가한 후, ELISA 플레이트들은 37℃에서 2 시간 동안 배양했다. 그런 다음, ELISA 플레이트들을 PBS로 세척했다. 돼지 혈청 샘플들을 PBS 와 50배로 (1:50) 희석한 후 순차적으로 2배로 재희석했다. 희석된 혈청 샘플들은 ELISA 플레이트(100μl/정)의 정(well)들에 첨가한 후, 플레이트들을 37℃에서 1 시간 동안 배양했다. 배양 후, 상기 플레이트들을 PBS 로 세척했다. 겨자무과산화 효소 (HRP)로 활용한 2차 항체 (가령 염소 항-돼지 2차 항체)를 상기 정들에 첨가했다. 37℃에서 1 시간 동안 배양한 후, 상기 플레이트들을 PBS로 세척했다. 결과의 가시화를 위해, 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 상기 정들에 첨가했다. 배양 후, 상기 반응은 2mM H2SO4의 첨가로 중단되었다. 결과는 양성-대-음성 (P/N)의 비로 기록했다. P/N 비는 주어진 테스트 샘플의 450 nm(OD450)에서의 광학 밀도를 표준 음성 대조군의 OD450로 나눔으로서 산출했다. P/N 비율 ≥ 2.1을 양성으로 간주했다. P/N 비율 ≥ 2.1의 최대 희석치는 혈청 샘플들의 ELISA 항체 역가들로 간주했다.
3. 결과
1차 접종(p.i.)으로부터 3주 후, 접종한 두 새끼 돼지 모두에서 항-PCV2 H 균주 항체가 검출되었다. 2차 접종으로부터 2주 후, 접종한 새끼 돼지들의 ELISA 항체 역가는 11,000 보다 높았다 (표 2). 따라서, 이러한 결과들은 본 발명의 불활성화 PCV2 H 균주 백신이 돼지들의 면역 반응 유도에 효과적이라는 것을 보여준다.
접종된 새끼 돼지들의 ELISA 항체 역가
샘플링 시점 1차 접종 전
(생후 5 내지 6주)		 2차 접종 전
(생후 8 내지 9주)		 2차 접종 후 2주
(생후 10 내지 11주)
새끼 돼지 1 1 8,490 11,728
새끼 돼지 2 1 10,263 13,065
실시예 8 불활성화 PCV2 백신의 효력 시험 - 3
1. 백신 프로토콜 및 샘플 채취
생후 2주된 40 마리의 건강한 새끼 돼지들을 각각 10 마리로 구성된 임의의 4 개 그룹으로 나눴다. 생후 3주가 됐을 때, 3 개 백신 그룹 (그룹 1 내지 3)의 새끼 돼지들에게 1ml의 3 가지 다른 롯(lot)의 불활성화 PCV2 H 균주 백신을 근육 주사를 통해 주입했다. 1차 접종(p.i.)으로부터 3주 후, 새끼 돼지들에게 같은 양의 백신을 재주입했다. 그룹 4의 새끼 돼지들에게는 접종을 하지 않고 음성 대조군으로 놔두었다. 1차 접종(p.i.)으로부터 1주 전 (생후 2주), 그리고 1차 접종으로부터 1, 2, 3 및 5주 후 (각각 생후 4-, 5-, 6-, 및 8주-) 모든 새끼 돼지들로부터 혈청 샘플을 채취했다. 모든 새끼 돼지들은 생후 3, 4, 5, 6, 및 8주에 체중을 측정했다. 모든 혈청 샘플의 검증은 ELISA를 통해 이루어졌다.
백신 및 샘플 채취 스케줄
연령
(주)
2
3
4
5
6
8
접종 - 1차 접종 - - 2차 접종 -
테스트 1 혈액 샘플링
IFA
-		 혈액
샘플링
IFA		 혈액
샘플링
IFA		 혈액
샘플링
IFA		 혈액
샘플링
IFA
테스트 2 - 체중 측정 체중 측정 체중 측정 체중 측정 체중 측정
2. IFA에 의한 항-PCV2 항체 검출
실시예 3에서 준비한 항원 플레이트를 본 실시예에서도 사용했다. -20℃에서 가져온 항체 플레이트를 37℃에서 녹여 건조되도록 했다. 돼지 혈청 샘플은 PBS 와 50배(1:50)로 희석한 후 순차적으로 2배로 재희석했다. 희석한 혈청 샘플들은 ELISA 플레이트(50μl/정)의 정(well)들에 첨가한 후, 플레이트들을 37℃에서 30분간 배양했다. 배양 후, 상기 플레이트들을 PBS 로 3번 세척해 결합하지 않은 항체들을 제거했다. FITC에 활용한 토끼 항-돼지 IgG 50 마이크로리터 (50μl)를 상기 정들에 첨가했다. 암실에서 30분간 배양한 후, 플레이트들을 PBS 로 3번 세척하고, 형광 현미경을 통해 관찰하여 항-PCV2 H 균주 항체들의 역가를 산출했다. (Rodriquez-Arrioja et al., 2000)
3. 결과
3.1 항체 역가
1차 접종(p.i.)으로부터 2주 후, 접종한 새끼 돼지들 (생후 5주)로부터 채취한 혈청 샘플들은 약 600의 IFA 역가를 갖는 반면, 대조군에서 채취한 샘플은 약 200의 IFA 역가를 갖고 있었다 (표 4 및 도 6), 2차 접종 후, 접종한 새끼 돼지들 (생후 6주)들에서의 IFA 역가는 급격히 증가했다 (IFA 역가는 13,000를 초과했다). 생후 8주가 되자, 접종한 새끼 돼지들은 46,000 이상의 IFA 역가를 갖는 반면, 접종하지 않은 새끼 돼지들은 약 170의 매우 낮은 IFA 역가를 보였다.
IFA에 의한 접종한 새끼 돼지들의 항-PCV2 H 균주 항체 역가
연령 (주) 2 4 5 6 8
그룹 1 800 200 600 13,440 48,640
그룹 2 1,680 230 620 20,800 46,720
그룹 3 1,100 220 650 18,660 49,760
(대조군) 1,880 210 190 300 170
3.2 체중 증가
접종한 새끼 돼지들은 대조군의 비접종 새끼 돼지들에 비해 높은 체중 증가를 보였다 (표 5 및 도 7). 생후 8주가 되자, 접종한 새끼 돼지들은 비접종 새끼 돼지들보다 약 2kg 정도 체중이 더 나갔다.
접종한 새끼 돼지들의 체중 (kg)
생후 (주) 3 4 5 6 8
그룹 1 8.4461 9.9512 12.4207 16.1756 20.5284
그룹 2 7.3781 9.064 11.7594 15.2267 20.3755
그룹 3 7.9564 9.5413 12.3461 15.8561 20.4345
그룹 4
(대조군)		 7.5906 8.9899 11.724 12.9102 18.6059
따라서, 상기 결과에 따르면 본 발명의 불활성화 PCV2 H 균주 백신은 돼지들의 면역 반응을 효과적으로 유도하고, 면역성을 증대시키고, 체중 증가를 가져오는 것으로 나타났다.
실시예 9 불활성화 PCV2 백신의 효력 시험 - 4
1. 백신 프로토콜 및 PCV2 감염
생후 14일 내지 16일 된 새끼 돼지들을 각각 5 마리로 구성된 임의의 4 개 그룹으로 나눴다. 20 마리 모두 항-PCV2 항체에 음성 반응을 보였다. 3 개 백신 그룹 (그룹 1 내지 3)의 새끼 돼지들에게 1ml의 3 가지 다른 롯(lot)의 불활성화 PCV2 H 변성 백신을 근육 주사를 통해 주입했다. 1차 접종(p.i.)으로부터 2주 후, 새끼 돼지들에게 같은 양의 백신을 재주입했다. 그룹 4의 새끼 돼지들에게는 접종을 하지 않고 음성 대조군으로 놔두었다. 1차 접종(p.i.)으로부터 5주 후, 모든 새끼 돼지들은 ml당 106.0 50% 조직 배양 감염 투여량 (106.0 TCID50/ml)의 PCV2 H 균주 (바이러스 균주) 바이러스 스톡으로 도전되었다. 각 새끼 돼지는 비강을 통해 1ml의 바이러스 스톡 및 근육 주사를 통해 2ml의 바이러스 스톡으로 도전되었다. 도전 후 PCR 에 의한 PCV2 바이러스혈증(viremia) 검출을 위해, 7, 11, 19 및 25일 후에 혈청 및 비강 스왑(swab) 샘플을 수집했다.
2. PCR에 의한 PCV2 바이러스혈증 검출
PCV2 도전 후 수집한 돼지 혈청 샘플들에서의 바이럴 DNA의 레벨은 PCR을 사용해 결정했다. 바이러스 DNA는 DNAzol® 시약에서 추출했다. 먼저, DNAzol® 시약을 200μl의 혈청에 첨가한 후, 상기 혼합액을 12,000 rpm/분으로 15분간 원심 분리했다. 상청액은 2배 중량의 절대 에탄올과 혼합하여 DNA를 침전시켰다. 혼합액을 12,000 rpm/분으로 15분간 원심 분리한 다음, 상청액은 버렸다. DNA 펠릿(pellet)은 75% 에탄올로 세척하고, 12,000 rpm/분으로 15분간 원심 분리하여 에탄올을 제거한 후, 8mM NaOH에서 최종 용해했다.
PCV2 바이러스혈증 검출에 사용한 PCR 프라이머는 다음과 같은 시퀀스를 갖는다:
PCV2-F1: 5' GTGAAGTGGTATTTTGGTGCC 3' (SEQ ID No: 8)
PCV2-R1: 5' GTCTTCCAATCACGCTTCTGC 3' (SEQ ID No: 9)
PCV2-F1(포워드, forward)와 PCV2-R1(리버스, reverse) 프라이머들을 사용해 PCV2의 PRF1으로부터 284 bp 단편을 증폭시켰다. 최종 용량 25μㅣ의 PCR 혼합액에는 1μㅣ의 포워드 프라이머, 1μl의 리버스 프라이머, 1.5μl의 25mM Mg2 +, 2.0μl의 2.5mM dNTP, 2.5μl의 10×Mg2 + 프리 버퍼 (free buffer), 0.2μl의 Taq DNA 중합효소, 11.8μl의 증류수, 및 5μl의 주형 DNA가 포함되어 있었다. PCR 반응은 PCR 혼합액을 95℃에서 5분간 예열하는 초기 단계에서 시작해, DNA 증폭은 다음의 파라미터들을 기준으로 38사이클로 수행되었다; 30초간 94℃에서 변성하기, 55℃에서 30초간 어닐링하기, 72℃에서 30초간 연장하기. PCR 반응은 72℃에서 5분간 최종 확장하는 단계로 마무리하고 4℃에서 보관했다. 그런 다음, PCR 생성물은 1%의 아가로스젤(agarose gel)상에서 분석한 후 에티디움 브로마이드 염색 (ethidium bromide staining)으로 가시화시켰다.
또한, PCV2 바이러스혈증 검출에 사용한 또 다른 PCR 프라이머쌍은 다음과 같은 시퀀스를 갖는다:
PCV2-F2: 5' TGTTGGCGAGGAGGGTAATG '3 (SEQ ID No: 10)
PCV2-R2: 5' TGGGACAGCAGTTGAGGAGT '3 (SEQ ID No: 11)
PCV2-F2(포워드)와 PCV2-R2(리버스) 프라이머들을 사용해 PCV2로부터 676bp 단편을 증폭시켰다.
3. 해부학적 및 병리학적 분석
도전 후 25일째에, 새끼 돼지들을 죽인 후 해부하여 장기내 병리학적 이상을 관찰하고 림프절 및 폐를 수집했다. 조직 샘플은 4%의 포름알데히드에서 고정시키고 파라핀에 담근 후 절개했다. 조직 부분은 헤마톡실린과 에오신 (H&E)으로 염색한 후 현미경으로 관찰했다.
4. 결과
4.1 바이러스혈증 평가
PCR 결과에 따르면, 도전 후 25일째에, 접종한 새끼 돼지들 (그룹 1 내지 3)에서 바이러스혈증의 발생률이 접종하지 않은 새끼 돼지들 (그룹 4)보다 40 내지 60% 낮게 나타났다 (표 6). 이러한 결과는 본 발명의 불활성화 PCV2 H 균주 백신이 돼지들의 면역력을 유도하고, 돼지들의 바이러스혈증의 정도와 기간을 줄이고, PCV2 감염으로부터 돼지들을 보호할 수 있다는 것을 보여준다.
PCR에 의해 측정한 돼지 혈청내 바이러스혈증
그룹 도전 전 도전 이후 일수
7 11 19 25
그룹 1 0/5a 2/5 2/5 1/5 1/5
그룹 2 0/5 2/5 1/5 0/5 0/5
그룹 3 0/5 3/5 2/5 1/5 1/5
그룹 4
(대조군)		 0/5 4/5 3/5 4/5 3/5
a 분모는 실험한 새끼 돼지들의 수를 나타내고, 분자는 바이러스혈증을 갖고 있던 새끼 돼지들의 수를 나타낸다.
4.2 병리조직학적 시험
도전 후 25일째에 새끼 돼지들을 죽이고 해부했다. 2 마리의 접종하지 않은 새끼 돼지들에서 서혜, 종격, 및 장간막림프절이 확장되어 있었고, 림프절 섹션들의 색이 창백했다. 접종하지 않은 새끼 돼지 한 마리는 폐가 붕괴되지는 않았지만 고무같이 질긴 상태였고, 폐수종이 있었고, 신장에는 백반(white-spotted)이 보였다. 접종한 모든 돼지들에서 큰 병리학적 이상은 보이지 않았다 (표 7 및 표 8)
접종 및 비접종 새끼 돼지들의 병리학적 이상
그룹 병리학적 이상
림프절 확장 폐수종 신장에
백반 발생		 비장이
약간 확장		 그 외
이상 현상b
그룹 1 0/5a 0/5 0/5 0/5 0/5
그룹 2 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
그룹 3 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
그룹 4
(대조군)		 2/5 1/5 1/5 1/5 0/5
a 분모는 해부한 새끼 돼지들의 수를 나타내고, 분자는 병리학적 이상을 보인 새끼 돼지들의 수를 나타낸다.
b 그 외 이상 현상으로는 간이나 담낭이 약간 확장되는 것, 그리고 장의 창증 등이 있었다.
표 8은 조직 섹션에 대한 현미경을 통한 병리조직학적 시험 결과 및 PCR에 의한 PCV2 바이러스혈증 평가 결과를 나타낸다. 림프구 결핍 및 대식세포 침윤 등과 같은 림프절의 병리조직학적 병변들이 거의 모든 접종하지 않은 새끼 돼지들 (그룹 4)에서 나타났고, 접종하지 않은 새끼 돼지들에서 샘플링한 모든 림프절이 PCV2 바이러스혈증에 양성 반응을 보였다. 또한, 염증성 세포 침윤과 같은 폐에서의 병리조직학적 병변이 접종하지 않은 3 마리 새끼 돼지에서 관찰되었으며, 접종하지 않은 새끼 돼지들에서 샘플링한 폐 조직 2개가 PCV2 바이러스혈증에 양성 반응을 보였다. 비접종 새끼 돼지들에 비해, 접종한 새끼 돼지들에서는 상당한 병리조직학적 병변 및 PCV2 바이러스 감소를 보였다. 림프절에서의 병리조직학적 병변은 15 (그룹 1 내지 3) 중에서, 접종한 새끼 돼지 1 마리 (돼지 no. A4)에서만 나타났고, 접종한 새끼 돼지에서 샘플링한 림프절 (돼지 no. A4)만이 PCV2 바이러스혈증에 양성 반응을 보였다. 이러한 결과는 본 발명의 불활성화 PCV2 H 균주 백신이 PCV2 감염으로부터 돼지들을 보호할 수 있고, 보호율은 80%~100% 였다는 것을 보여준다.
그룹
 돼지 No.
 림프절 폐 PWMS
발생률
 보호율
(%)
상당한
병리학적 변화		 림프구 결핍 대식
세포
침윤		 PCR 상당한
병리학적 변화		 염증
세포
침윤		 PCR


그룹 1


 A1 - - - - - - - -



A2 - - - - - - - -
A3 - - - - - - - -
A4 - + + + - - - +
A5 - - - - - - - -
소계 1/5 1/5 0/5 1/5 0/5 0/5* 0/5* 1/5 80


그룹 2


 B1 - - - - - - - -



B2 - - - - - - - -
B3 - - - - - - - -
B4 - - - - - - - -
B5 - - - - - - - -
소계 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 100


그룹 3


 C1 - - - - - - - -



C2 - - - - - - - -
C3 - - - - - - - -
C4 - - - - - - - -
C5 - - - - - - - -
소계 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 100


그룹 4
(대조군)
 D1 + + + + - + - +




D2 + + + + + + + +
D3 - + + + - + + +
D4 - + + + - - - +
D5 - + - + - - - +
소계 2/5 5/5 4/5 5/5 1/5 3/5 2/5 5/5
* 분모는 해부한 새끼 돼지들을 수를 나타내고, 분자는 병리학적 이상을 보인 새끼 돼지들을 수를 나타낸다.
이 모든 결과들을 바탕으로 봤을 때, 본 발명의 불활성화 PCV2 H 균주 백신은 돼지들의 면역력을 효과적으로 유도했고, PCV2 감염으로부터 돼지들을 접종했고, 돼지들의 바이러스혈증의 정도와 기간을 감소시켰고, 임상 징후들을 최소화했고, 체중 증가 폭을 증대시켰다.
또한, 이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형실시들은 본 발명의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어져서는 안될 것이다.
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600 ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg 660 atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg 720 atgatctact gagactctgt gatcgatatc ctttgactgt tgagactaaa ggtggaactg 780 tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840 cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900 ggaagaatgc tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960 catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020 ttttattatt cacttagggt taagtggggg gtctttaaga ttaaattctc tgaattgtac 1080 atacatggtt atacggatat tgtagtcctg gtcgtatata ctgttttcga acgcagtgcc 1140 gaggcctaca tggtctacat ttccagtagt ttgtagtctc agccagagtt gatttctttt 1200 gttattgggt tggaagtaat cgattgtcct atcaaggaca ggtttcgggg taaagtaccg 1260 ggagtggtag gagaagggct gggttatggt atggcgggag gagtagttta cataggggtc 1320 ataggttagg gcattggcct ttgttacaaa gttatcatct agaataacag cagtggagct 1380 cactcccctg tcaccctggg tgattgggga gcagggccag aattcaacct taaccttcct 1440 tattctgtag tattcaaagg gcacagtgag ggggcttgag ccccctcctg ggggaagaaa 1500 atcattaata ttaaatctca tcatgtccac attccaggag ggcgttctga ctgtggtttt 1560 cttgacagta taaccgatgg tgcgggagag gcgggtgttg aagatgccat ttttccttct 1620 ccagcggtaa cggtggcggg ggtggactag ccaggggcgg cggcggagga tctggccaag 1680 atggctgcgg gggcggtgtc ttcgtctgcg gtaacgcctc cttggatacg tcatcgctga 1740 aaacgaaaga agtgcgctgt aagtatt 1767 <210> 2 <211> 945 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 2 atgcccagca agaagagtgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg 60 ctgaataatc cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt 120 gattatttta ttgttggcga ggaaggtaat gaggagggcc gaacacccca cctacagggg 180 ttcgctaatt ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agtggtattt tggtgcccgc 240 tgccacatcg agaaagcgaa aggaacagat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa 300 ggcaacttac tgatagaatg tggagctcct agatctcaag gacaacggag tgacctctct 360 actgctgtga gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct 420 gtaacgtttg tcagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg 480 cagaagcgtg attggaagac gaatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggcaaa 540 agcaaatggg ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac 600 aagtggtggg atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg 660 ctgccgtggg atgatctact gagactctgt gatcgatatc ctttgactgt tgagactaaa 720 ggtggaactg tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg 780 gaatggtact cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc 840 ttggtatttt ggaagaatgc tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc 900 ctttcccccc catgccctga atttccatat gaaataaatt actga 945 <210> 3 <211> 314 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 3 Met Pro Ser Lys Lys Ser Gly Arg Ser Gly Pro Gln Pro His Lys Arg 1 5 10 15 Trp Val Phe Thr Leu Asn Asn Pro Ser Glu Asp Glu Arg Lys Lys Ile 20 25 30 Arg Glu Leu Pro Ile Ser Leu Phe Asp Tyr Phe Ile Val Gly Glu Glu 35 40 45 Gly Asn Glu Glu Gly Arg Thr Pro His Leu Gln Gly Phe Ala Asn Phe 50 55 60 Val Lys Lys Gln Thr Phe Asn Lys Val Lys Trp Tyr Phe Gly Ala Arg 65 70 75 80 Cys His Ile Glu Lys Ala Lys Gly Thr Asp Gln Gln Asn Lys Glu Tyr 85 90 95 Cys Ser Lys Glu Gly Asn Leu Leu Ile Glu Cys Gly Ala Pro Arg Ser 100 105 110 Gln Gly Gln Arg Ser Asp Leu Ser Thr Ala Val Ser Thr Leu Leu Glu 115 120 125 Ser Gly Ser Leu Val Thr Val Ala Glu Gln His Pro Val Thr Phe Val 130 135 140 Arg Asn Phe Arg Gly Leu Ala Glu Leu Leu Lys Val Ser Gly Lys Met 145 150 155 160 Gln Lys Arg Asp Trp Lys Thr Asn Val His Val Ile Val Gly Pro Pro 165 170 175 Gly Cys Gly Lys Ser Lys Trp Ala Ala Asn Phe Ala Asp Pro Glu Thr 180 185 190 Thr Tyr Trp Lys Pro Pro Arg Asn Lys Trp Trp Asp Gly Tyr His Gly 195 200 205 Glu Glu Val Val Val Ile Asp Asp Phe Tyr Gly Trp Leu Pro Trp Asp 210 215 220 Asp Leu Leu Arg Leu Cys Asp Arg Tyr Pro Leu Thr Val Glu Thr Lys 225 230 235 240 Gly Gly Thr Val Pro Phe Leu Ala Arg Ser Ile Leu Ile Thr Ser Asn 245 250 255 Gln Thr Pro Leu Glu Trp Tyr Ser Ser Thr Ala Val Pro Ala Val Glu 260 265 270 Ala Leu Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Leu Val Phe Trp Lys Asn Ala Thr 275 280 285 Glu Gln Ser Thr Glu Glu Gly Gly Gln Phe Val Thr Leu Ser Pro Pro 290 295 300 Cys Pro Glu Phe Pro Tyr Glu Ile Asn Tyr 305 310 <210> 4 <211> 705 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 4 atgacgtatc caaggaggcg ttaccgcaga cgaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60 cagatcctcc gccgccgccc ctggctagtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120 aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccatcg gttatactgt caagaaaacc 180 acagtcagaa cgccctcctg gaatgtggac atgatgagat ttaatattaa tgattttctt 240 cccccaggag ggggctcaag ccccctcact gtgccctttg aatactacag aataaggaag 300 gttaaggttg aattctggcc ctgctcccca atcacccagg gtgacagggg agtgagctcc 360 actgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca atgccctaac ctatgacccc 420 tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccggtac 480 tttaccccga aacctgtcct tgataggaca atcgattact tccaacccaa taacaaaaga 540 aatcaactct ggctgagact acaaactact ggaaatgtag accatgtagg cctcggcact 600 gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggac tacaatatcc gtataaccat gtatgtacaa 660 ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaacccta agtga 705 <210> 5 <211> 234 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 5 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Ser Ser Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Ser Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys 225 230 <210> 6 <211> 315 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 6 atggtaacca tcccaccact tgtttctagg tggtttccag tatgtggttt ccgggtctgc 60 aaaattagca gcccatttgc ttttgccaca cccaggtggc cccacaatga cgtgtacatt 120 cgtcttccaa tcacgcttct gcattttccc gctcactttc aaaagttcag ccagcccgcg 180 gaaatttctg acaaacgtta cagggtgctg ctctgcaacg gtcaccagac tcccgctctc 240 caacaaggta ctcacagcag tagagaggtc actccgttgt ccttgagatc taggagctcc 300 acattctatc agtaa 315 <210> 7 <211> 104 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 7 Met Val Thr Ile Pro Pro Leu Val Ser Arg Trp Phe Pro Val Cys Gly 1 5 10 15 Phe Arg Val Cys Lys Ile Ser Ser Pro Phe Ala Phe Ala Thr Pro Arg 20 25 30 Trp Pro His Asn Asp Val Tyr Ile Arg Leu Pro Ile Thr Leu Leu His 35 40 45 Phe Pro Ala His Phe Gln Lys Phe Ser Gln Pro Ala Glu Ile Ser Asp 50 55 60 Lys Arg Tyr Arg Val Leu Leu Cys Asn Gly His Gln Thr Pro Ala Leu 65 70 75 80 Gln Gln Gly Thr His Ser Ser Arg Glu Val Thr Pro Leu Ser Leu Arg 85 90 95 Ser Arg Ser Ser Thr Phe Tyr Gln 100 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/ probe for detecting Porcine Circovirus Type 2 <400> 8 gtgaagtggt attttggtgc c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/ probe for detecting Porcine Circovirus Type 2 <400> 9 gtcttccaat cacgcttctg c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/ probe for detecting Porcine Circovirus Type 2 <400> 10 tgttggcgag gagggtaatg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/ probe for detecting Porcine Circovirus Type 2 <400> 11 tgggacagca gttgaggagt 20

Claims (20)

  1. SEQ ID No: 1 게놈 시퀀스를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스(circovirus) 2형 (PCV2) 바이러스
  2. 제1항에 있어서,
    중국 타입 컬쳐 컬렉션 센터 (China Center for Type Culture Collection, CCTCC)에 수탁 번호 V201117로 기탁된 것을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 바이러스
  3. 제1항에 있어서,
    상기 PCV2 바이러스는 PK-15 세포계 또는 그 유도체 세포계들에서 세포병변 효과 (cytopathic effect, CPE)를 유발할 수 있는 것을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 바이러스
  4. 제1항의 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 조성물
  5. 제4항에 있어서,
    약학적으로 수용 가능한 매개체(vehicle)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 조성물
  6. 제5항에 있어서,
    상기 매개체는 보강제(adjuvant)인 것을 특징으로 하는 면역 조성물
  7. 제4항에 있어서,
    상기 PCV2 바이러스는 불활성화 과정에 의해 처리되는 것을 특징으로 하는 면역 조성물
  8. 제4항에 있어서,
    상기 PCV2 바이러스는 독성약화되거나; 또는 서브유닛(subunit), DNA, 또는 제1항의 PCV2로부터 유도되고 생성된 다른 형태인 것을 특징으로 하는 면역 조성물
  9. 제4항에 있어서,
    돼지 인플루엔자 바이러스 (Swine influenza virus, SIV)의 항원, 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)의 항원, 마이코플라스마(mycoplasma)의 항원, 돼지 파보바이러스 (porcine parvovirus, PPV)의 항원, 돼지단독(erysipelas)의 항원, 및 위광견(pseudorabies) 바이러스의 항원으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 병원성 항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 조성물
  10. 돼지 내의 PCV2에 대한 면역성을 증대시키는 위해 제4항의 면역 조성물로 돼지를 접종하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 써보바이러스 2형의 감염으로부터 돼지를 보호하는 방법
  11. 제1항의 상기 PCV2 바이러스로부터 유도된 것을 특징으로 하는 항-돼지 싸코바이러스 2형 (PCV2) 항체
  12. 제11항에 있어서,
    상기 항체는 단클론 항체, 다클론 항체, 및 유전자 조작 항체 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 항체
  13. 제1항의 PCV2 바이러스의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드(nucleotide) 시퀀스를 포함하는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)로서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID No: 3, SEQ ID No:5, 및 SEQ ID No: 7 시퀀스들 중에서 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드
  14. 제13항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID No:2, SEQ ID No: 4, 및 SEQ ID No: 6 시퀀스들 중에서 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 폴리뉴클레오티드
  15. 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 테스트 키트로서, 제1항의 바이러스 항원, 제1항의 바이러스로부터 유도된 항체, 제13항의 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID No:1 시퀀스를 탐지하는 핵산 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 탐지 유닛(detect unit)을 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 테스트 키트
  16. 제15항에 있어서,
    상기 바이러스 항원은 플레이트상에 침착된 것을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 테스트 키트
  17. 제16항에 있어서,
    상기 바이러스 항원은 불활성화 과정에 의해 처리된 것을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 테스트 키트
  18. 제15항에 있어서,
    상기 항체는 단클론 항체, 다클론 항체, 및 유전자 조작 항체 중에서 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 테스트 키트
  19. 제15항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID No:2, SEQ ID No: 4, 및 SEQ ID No:6 중에서 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 테스트 키트
  20. 제15항에 있어서,
    상기 핵산 단편은 SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, 및 SEQ ID No: 11 중에서 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 테스트 키트(test kit)
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