CN110387355B - 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒株、疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种重组猪伪狂犬病病毒株，所述重组猪伪狂犬病病毒株重组有猪圆环病毒Cap蛋白基因，其特征在于，所述猪圆环病毒Cap蛋白基因为猪圆环病毒2型和/或3型Cap蛋白基因。本发明还提供了包含该重组猪伪狂犬病病毒株的活疫苗及其制备方法和应用。经免疫原性试验、广谱性保护试验和混合感染保护试验证明，该活疫苗具有很好的保护力，能一针同时控制PCV2、PCV3、PRV感染。

Description

表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒株、疫苗 及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒株、制备方法及利用该重组猪伪狂犬病病毒株制备的疫苗组合物，属于兽用生物制品领域。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是目前为止发现的最小的脊椎动物病毒。PCV根据致病性、抗原性及核苷酸序列的不同分为猪圆环病毒1型(PCV1)、2型(PCV2)和3型(PCV3)三种基因型。其中PCV1广泛存在于猪群但对其无致病性，基因组长度为1759bp。PCV2具有致病性，基因组长度为1767bp或者1768bp。PCV3是新近在猪的繁殖障碍病例中分离并确认致病病原的猪圆环病毒，基因组长度为2.0kb。
伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)主要引起猪严重的神经学症状、呼吸道疾病和生殖障碍。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。最近的流行的猪伪狂犬病发生了新的特点，突出表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率最高可达100％，发病猪死亡率最高可达100％，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)。现有技术的疫苗免疫猪只后不能完全抵抗野毒攻击，依然会出现高热、精神沉郁、食欲下降或废绝等症状，感染率超过80％，发病率超过30％，死亡率在10％～20％之间。
临床上，PCV2、PCV3与PRV常呈现混合感染情况，从而使疫情变得更加严重。目前国内外还没有能一针同时控制PCV2、PCV3、PRV感染的疫苗，因此，临床上急需提供一种能一针解决这几种疫病爆发的疫苗。
发明内容
为解决上述问题，本发明将猪圆环病毒Cap蛋白基因重组进猪伪狂犬病病毒弱毒株，构建表达猪圆环病毒Cap蛋白的重组猪伪狂犬病病毒株。
本发明主要目的在于提供一种重组猪伪狂犬病病毒株，所述重组猪伪狂犬病病毒株含有猪圆环病毒Cap蛋白基因，其中，所述猪圆环病毒Cap蛋白基因为猪圆环病毒2型和/或3型Cap蛋白基因。
本发明的另一方面在于提供一种活疫苗rPRV-Cap，其中，所述活疫苗rPRV-Cap包括免疫量的本发明所述的重组猪伪狂犬病病毒株。
本发明的另一方面在于提供一种活疫苗rPRV-Cap的制备方法，其中，所述方法包括：步骤(1)克隆所述猪圆环病毒2型Cap蛋白基因和/或克隆所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因，并将所述猪圆环病毒2型Cap蛋白基因和/或所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因重组到伪狂犬病病毒活载体以获得上述重组猪伪狂犬病病毒株；以及步骤(2)在上述重组猪伪狂犬病病毒株中加入冻干保护剂。
本发明的又一方面在于提供上述活疫苗rPRV-Cap在制备预防和/治疗猪圆环病毒和/或猪伪狂犬病病毒感染的药物中的应用。
本发明首次采用猪伪狂犬病病毒变异株为载体，表达目前新的猪圆环病毒3型Cap蛋白基因和/或猪圆环病毒2型Cap蛋白基因，特别是猪圆环病毒2型新的基因亚型Cap蛋白基因，以制备重组病毒活疫苗，不仅能对猪伪狂犬病病毒变异株、猪圆环病毒3型、不同地域来源和不同基因亚型的猪圆环病毒2型分别进行保护，还能针对猪伪狂犬病病毒变异株和猪圆环病毒3型和/或不同地域来源和不同基因亚型的猪圆环病毒2型的混合感染进行保护。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明涉及一种重组猪伪狂犬病病毒株，所述重组猪伪狂犬病病毒株重组有猪圆环病毒Cap蛋白基因，其中，所述猪圆环病毒Cap蛋白基因为猪圆环病毒2型和/或3型Cap蛋白基因。
优选地，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白基因为猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白基因。
“猪圆环病毒3型”为基因组2.0kb的圆环病毒，其与已知的圆环病毒的无论是核苷酸还是氨基酸序列的同源性均小于50％，是一种新的猪圆环病毒，其能与多种病原混合感染引起猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。
“猪圆环病毒2型new基因亚型”是指一种新的PCV2基因亚型，其ORF2基因中存在突变或经不同基因亚型的ORF2基因之间重组而来，具有PCV2b的标签序列，但在遗传进化分析中组成一个独立分支，猪只感染该基因亚型的毒株后出现的临床表征有：持续性高温，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白为序列SEQ ID NO.1编码的蛋白。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其简并序列。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述猪圆环病毒3型Cap蛋白为序列SEQ IDNO.2编码的蛋白。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因具有SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列或其简并序列。
作为本发明的一种实施方式，所述猪伪狂犬病病毒株为伪狂犬变异株的致弱株。
优选地，本发明所述猪伪狂犬病毒株为gI/gE/11K/28K/TK蛋白失活的猪伪狂犬病毒株，其中，所述猪伪狂犬病毒株为伪狂犬变异株。
gI/gE/11K/28K/TK蛋白失活可使用本技术领域的公知方式，包括其基因缺失表达上述蛋白的功能性片段的核苷酸序列，其基因整个ORF缺失，或者其基因缺失、删除或添加一个或多个核苷酸使其不能正常表达功能蛋白或表达的蛋白不具有其原有的功能，或功能极弱。
作为本发明的一种实施方式，所述猪伪狂犬病毒弱毒株基因组中gI/gE/11K/28K/TK整个ORF缺失。
“伪狂犬变异株”也称为高致病性猪伪狂犬毒株，是指：表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率最高可达100％，发病猪死亡率最高可达100％，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)。
优选地，所述的伪狂犬变异株为经分离的所述猪伪狂犬病病毒变异株，当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中基因缺失伪狂犬弱毒疫苗后依然会造成猪出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝症状的毒株。
优选地，所述的伪狂犬变异株为当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中缺失gE、TK和gI基因中的一个及一个以上基因的伪狂犬弱毒疫苗后，所述猪依然感染猪伪狂犬病，并且所述猪伪狂犬病毒变异株具备具有使9-10日龄仔猪精神沉郁和食欲下降的毒株。
优选地，所述的猪伪狂犬变异株为经分离的所述猪伪狂犬病毒变异株当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中基因缺失伪狂犬弱毒疫苗后依然会造成猪出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝症状的毒株；更优选地，所述的猪伪狂犬变异株为当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中缺失gE、TK和gI基因中的一个及一个以上基因的伪狂犬弱毒疫苗后所述猪依然感染猪伪狂犬病，并且所述猪伪狂犬病毒变异株具备具有使9-10日龄仔猪精神沉郁和食欲下降的毒株。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明提供一种缺失gI/gE/11K/28K/TK基因的伪狂犬病毒基因工程弱毒株。
术语“猪伪狂犬变异株”也称为高致病性猪伪狂犬毒株，是指：表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状。优选地，所述的伪狂犬变异株为经分离的所述猪伪狂犬病毒变异株当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中基因缺失伪狂犬弱毒疫苗后依然会造成猪出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝等症状的毒株。更优选地，所述的猪伪狂犬变异株为当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中缺失gE、TK和gI基因中的一个及一个以上基因的伪狂犬弱毒疫苗后依然感染猪伪狂犬病并具备具有使9-10日龄仔猪精神沉郁和食欲下降的毒株。
本发明术语“同源性”在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，Altschul S.F.et al，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Stephen F.et al，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www.eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例如，Higgins D.G.et al，Methods in Enzymology，266：383-402(1996)；Larkin M.A.et al，Bioinformatics(Oxford，England)，23(21)：2947-8(2007))；和TCoffee软件等(在瑞士生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，Poirot O.et al，NucleicAcids Res.，31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.et al，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。
术语“gI蛋白”由US7编码，包含366个氨基酸，ORF位于122298-123398之间.
术语“gE蛋”白由US8编码，包含577个氨基酸，ORF位于123502-125235之间.
术语“11K”由US9编码，包含98个氨基酸，ORF位于125293-125589之间。
术语“28K”由US2编码，包含256个氨基酸，ORF位于125811-126581之间。
术语“TK”又称为“胸苷激酶”由UL23编码，包含320个氨基酸，ORF位于59512-60474之间。
本发明术语“gI/gE/11K/28K/TK”是指“gI、gE、11K、28K和TK”，其中“/”在本发明中是和的意思，例如“gI/gE/11K/28K/TK蛋白失活”是指gI、gE、11K、28K和TK五个蛋白均失去活性。
除非另有说明本发明术语“PRV-TK-/gI-/gE-/11K-/28K-”，是指缺失gI、gE、11K、28K和TK基因。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述伪狂犬变异株为猪伪狂犬病病毒JS-2012株、猪伪狂犬HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、PRV TJ株、猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01、猪伪狂犬病毒变异株HN1201株、猪伪狂犬病毒变异株HN1202株。
猪伪狂犬病病毒株JS-2012株公开于免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J].童武，张青占，郑浩等，中国动物传染病学报2013,21(3):1-7)；猪伪狂犬HeN1株，其保藏编号为CGMCCNO.6656，公开于专利申请CN102994458A；NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株公开于Pathogenic PseudorabiesVirus,Xiuling Yu,Zhi Zhou,DongmeiHu,et al.China,2012Emerging Infectious Diseases，www.cdc.gov/eid ol.20,No.1,January 2014；PRV TJ strain(PRV TJ)株，公开于Chun-Hua Wang,Jin Yuan,Hua-YangQin，et al，Anovel gE-deleted pseudorabies virus(PRV)provides rapid andcomplete protection from lethal challenge with the PRV variant emerging inBartha-K61-vaccinated swine population in China.Vaccine.32(2014)3379–3385中；猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01，其保藏编号为CGMCCNo.8170，公开于专利申请CN103627678A；猪伪狂犬病毒HN1201株(Pseudorabies virus,strain HN1201)，其保藏编号为CCTCC NO.V201311，公开于专利申请CN104004774A；猪伪狂犬病毒HN1202株(Pseudorabies virus,strain HN1202)，其保藏编号为CCTCC NO.V201335，公开于专利申请CN104328090A。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述伪狂犬变异株为HN1201株或HN1202株。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述活疫苗rPRV-Cap中，所述猪伪狂犬病病毒株为猪伪狂犬病病毒HN1201株的gI、gE、11K、28K、TK五基因缺失致弱株。所述猪伪狂犬病病毒HN1201株的gI、gE、11K、28K、TK五基因缺失致弱株公开于专利申请CN104862286A，在此通过引用的方式并入本文。
本发明涉及一种活疫苗rPRV-Cap，其中，所述活疫苗rPRV-Cap包括本发明所述的重组猪伪狂犬病病毒株。
本发明所述重组猪伪狂犬病病毒株重组有猪圆环病毒Cap蛋白基因，其中所述猪圆环病毒Cap蛋白基因为猪圆环病毒2型和/或3型Cap蛋白基因。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述活疫苗rPRV-Cap中，所述Cap蛋白基因为猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白基因，所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其简并序列。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述活疫苗rPRV-Cap中，所述Cap蛋白基因为猪圆环病毒3型Cap蛋白基因，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其简并序列。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述活疫苗rPRV-Cap中，所述Cap蛋白基因为猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白基因和猪圆环病毒3型Cap蛋白基因，所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其简并序列，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其简并序列。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述活疫苗rPRV-Cap中，所述猪伪狂犬病病毒株为猪伪狂犬病病毒HN1201株的gI、gE、11K、28K、TK五基因缺失致弱株。
优选地，所述重组猪伪狂犬病毒弱毒株抗原含量为≥106.0TCID50/头份。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述活疫苗rPRV-Cap中还包括冻干保护剂。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述活疫苗rPRV-Cap中还可以加入具有佐剂活性的一种或多种化合物。根据本发明的活的重组猪伪狂犬病毒不一定需要这种佐剂来实现功效，但是特别对应包含根据本发明的活的重组猪伪狂犬病毒和来自另一致病病毒或微生物的抗原性物质的组合疫苗，将值得加入佐剂。佐剂是免疫系统的非特异性刺激剂，它们增强宿主对疫苗的免疫应答。本领域中已知的佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs(免疫刺激复合体，参考例如欧洲专利EP 109942)、皂苷、矿物油、植物油，和卡波姆(Carbopol)。
本发明所述活疫苗rPRV-Cap中还可以包括药学上可用载体或者稀释剂，所述药学上可用载体或者稀释剂的其它实例包括稳定剂，如SPGA、糖类(例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白质(例如，白蛋白或者酪蛋白)、含有蛋白质的物质(例如，牛血清或者脱脂乳)和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。
特别当将这种稳定剂加入疫苗时，疫苗非常适于冷冻干燥。因此，在该实施方案的更优选的形式中，活疫苗是冷冻干燥的形式。
作为本发明的一个优选的实施方式，所述的疫苗组合物中还包括猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪细小病毒抗原、猪乙型脑炎病毒抗原。此外，本发明的活疫苗可与其它失活病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括猪伪狂犬病病毒和/或猪圆环病毒感染的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。
本发明所用的术语“联合疫苗”用于指从本发明的重组病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。
本发明所用术语“复合疫苗”指的是从病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的重组病毒可与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体混合或组合。
作为本发明的一种实施方式，所述疫苗进一步含有失活病原体或抗原组分。
优选地，所述抗原为猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原和/或副猪嗜血杆菌抗原或猪肺炎支原体抗原。
本发明的一个目的在于提供本发明所述的活疫苗rPRV-Cap在制备预防和/治疗猪圆环病毒和/或猪伪狂犬病病毒感染的药物中的应用。
猪伪狂犬病病毒感染可以指表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状，但不限于此。上述症状与现有技术中感染了普通猪伪狂犬病病毒后产生的症状差异在于：感染了后会造成感染后成年猪(体重在50kg以上猪)可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死；新生及4周龄以内的仔猪突然发病，发生大批死亡，死亡率达90％以上；发病仔猪主要表现为体温上升达41℃以上，食欲废绝，伴有明显的神经症状和腹泻；断奶前后仔猪主要为呼吸系统症状，表现呼吸困难、咳嗽、流鼻涕等。
猪圆环病毒感染可以指由猪圆环病毒2型和/或3型单独感染或混合感染引起的疾病。猪圆环病毒2型感染包括PCV2a、PCV2b、PCV2d、PCV2new基因亚型感染。非穷举性包括，断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，但不限于此。
本发明所述活疫苗能针对猪伪狂犬病病毒变异株、猪圆环病毒3型、不同地域来源和不同基因亚型的猪圆环病毒2型提供有效保护，扩大了疫苗的应用范围，能对猪伪狂犬病病毒变异株、猪圆环病毒3型、不同地域来源和不同基因亚型的猪圆环病毒2型的单独感染和混合感染进行预防。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1猪圆环病毒2型的分离鉴定及Cap蛋白基因的测定
1、病料来源
在国内一免疫商品化PCV2疫苗的猪场,零星出现母猪流产、木乃伊胎增加的现象。受影响的母猪表现出厌食症状，在流产的窝中含有不同胎龄的木乃伊化胎儿，与PCV2相关流产的症状一致。通过免疫组化和定量PCR检测，PCV2为阳性。在免疫PCV2商品化疫苗后依然从发病猪组织中检测到PCV2，原因值得深究，为进一步查清原因，选取各组织病料进行病原分离。
2、病毒株的分离与培养
将病料以1：10(体积比)加入DMEM培养液，研磨，制备组织悬液；组织悬液经反复3次冻融后，于12000r/min离心15min，收集上清液；上清液再经0.22μm滤膜滤器过滤，滤液在PK15细胞上传代，于37℃培养1h，替换加入含2％犊牛血清的DMEM培养液，于37℃培养5日。收获含病毒的培养液，经2次冻融后，收获病毒。
3、PCR及测序分析鉴定病毒
取以上步骤收获的病毒培养物，用核酸提取试剂盒提取病毒样品的核酸，使用PCV2特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果显示，PCR扩增出1.7kb目的条带。PCR产物送测序公司进行核苷酸序列测定，序列测定结果进行遗传进化分析。结果显示该病毒株全基因组序列同已经报道过的其它PCV2的同源性都少于96％，氨基酸序列少于94％，进一步的全基因组序列分析表明该毒株介于PCV2b与PCV2d之间，ORF2基因中存在突变或经不同基因亚型的ORF2基因之间重组而来，经遗传进化分析确定，其属于一个新的PCV2基因亚型。
4、Cap蛋白基因扩增
根据Cap蛋白基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，进行PCR。引物序列见表1。
表1猪圆环病毒2型Cap蛋白基因扩增引物
Figure BDA0001633202850000111
将PCR产物送Invitrogen公司测序，结果显示与现有技术中的PCV2的Cap蛋白氨基酸序列相比，Cap蛋白基因编码的氨基酸序列在52～64位、106～108位、131～137位发生基因突变或重组，根据测序结果对Cap蛋白基因进行密码子优化，优化后的Cap蛋白基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
实施例2猪圆环病毒3型的分离鉴定及Cap蛋白基因的测定
1、病料来源
在国内一商品化猪场，与历史平均值相比，出现母猪死亡率增加9.4％，受孕率降低了1.2％，木乃伊胎增加8.2％的现象。临床表现上，受影响的母猪表现出厌食，呈多灶性丘疹、斑点和表面皮炎的症状。在流产的窝中含有不同胎龄的木乃伊化胎儿，与PCV2相关流产的症状一致。虽然在母猪中观察到的总体临床表现以及流产症状与猪圆环病毒2型导致的繁殖障碍疾病一致，但所有母猪的不同组织，包括肾、淋巴结、肺、皮肤以及死胎，通过免疫组化和定量PCR对PCV2、PRRSV、PPV、CSFV、猪肺炎支原体检测均为阴性。为进一步查清原因，选取各组织病料进行病原分离。
2、病毒株的分离与培养
将病料以1：10(体积比)加入DMEM培养液，研磨，制备组织悬液；组织悬液经反复3次冻融后，于12000r/min离心15min，收集上清液；上清液再经0.22μm滤膜滤器过滤，滤液在PK15细胞上传代，于37℃培养1h，替换加入含2％犊牛血清的DMEM培养液，于37℃培养5日。收获含病毒的培养液，培养液经2次冻融后，收获病毒。
3、PCR及测序分析鉴定病毒种属
取以上步骤的病毒培养物，用核酸提取试剂盒提取病毒样品的核酸，使用圆环病毒种属特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果显示，PCR扩增出2000bp目的条带。PCR产物送测序公司进行核苷酸序列测定，序列测定结果进行遗传进化分析。结果显示该病毒株全基因组序列和氨基酸序列同已经报道过的其它圆环病毒的同源性都少于50％，而根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒属中同一种的病毒应该具有＞75％的基因组核苷酸序列的同源性，Cap蛋白应该具有＞70％的氨基酸序列的同源性，据此可以肯定，它是一种新的猪圆环病毒，也是目前猪体上发现的第三种圆环病毒。
4、Cap蛋白基因扩增
根据Cap蛋白基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，进行PCR。引物序列见表2。
表2猪圆环病毒3型Cap蛋白基因扩增引物
Figure BDA0001633202850000131
将PCR产物送Invitrogen公司测序，根据测序结果对Cap蛋白基因进行密码子优化，优化后的Cap蛋白基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
实施例3猪圆环病毒2型Cap蛋白基因重组猪伪狂犬病病毒活载体的构建
1、含GFP的中间转移载体的构建
猪伪狂犬病病毒HN1201株的gI、gE、11K、28K、TK五基因缺失致弱株公开于专利申请CN104862286A。以PRV五基因缺失病毒核酸为模板，以US6F和US6R引物扩增获得同源臂US6A，大小约为1005bp；以US2F和US2R引物扩增获得同源臂US2B，大小约为1200bp；将US6A用EcoRI和Small酶切处理，与同样酶切处理的pUC19质粒连接，经EcoRI和Small酶切鉴定获得插入US6A基因的质粒pUC-US6A；将US2B用SalI和HindIII酶切处理，与同样酶切处理的pUC-US6A质粒连接，经酶切鉴定获得插入同源臂US2B的质粒pUC-US6A-US2B质粒；以pAc-GFP-gpt质粒为模板，用CMVF和SV40R引物扩增获得大小约为2100bp的Cmv-GFP-gpt片段，将其用SmalI和SalIsI酶切处理，与同样酶切处理的pUC-US6A-US2B连接，经酶切鉴定获得pUC-US6A-US2B-GFP-gpt质粒。
以PCV2基因组为模板，用PCV2-Cap-F和PCV2-Cap-R引物扩增获得大小约为702bp的PCV2Cap蛋白基因，将其用NheI和BamHI酶切处理，与经NheI和BamHI酶切处理的pAc-GFP-C1质粒连接，获得含CMV启动子的PCV2Cap蛋白基因质粒pAc-PCV2-Cap；以pAc-PCV2-Cap质粒为模板，用CMVF和SV40R引物扩增获得大小约为1482bp的CMV-PCV2-Cap片段，将其用SmalI和SalIsI酶切处理，与同样酶切处理的pUC-US6A-US2B连接，经酶切鉴定获得pUC-US6A-US2B-PCV2-Cap质粒。
引物序列见表3。
表3转移载体构建所用引物
Figure BDA0001633202850000141
2、带GFP基因的重组病毒的获得
按照Lipofectamine 2000说明书，取5μg pUC-US6A-US2B-GFP-gpt质粒和3μg PRV五基因缺失病毒基因组共转染Vero细胞。待转染后细胞有绿色荧光的细胞病变达到90％时，收获并进行纯化，获得带GFP基因的重组病毒命名为rPRV-TK-/gI-/gE-/11K-/28K--GFP。
3、含PCV2Cap蛋白基因重组伪狂犬病毒的获得
按照Lipofectamine 2000说明书，取3μg rPRV-TK-/gI-/gE-/11K-/28K--GFP基因组和5μg pUC-US6A-US2B-PCV2-Cap共转染Vero细胞。待转染后细胞有部分无绿色荧光的细胞病变出现，说明获得含PCV2Cap蛋白基因的重组伪狂犬病毒，待细胞病变达到90％时，收获并进行纯化，获得含PCV2Cap蛋白基因的重组病毒命名为rPRV-TK-/gI-/gE-/11K-/28K--PCV2-Cap(简称重组病毒1)。
经PCR检测重组病毒感染细胞上清可知获得GFP基因删除，插入PCV2Cap蛋白基因的重组伪狂犬病毒。
实施例4猪圆环病毒3型Cap蛋白基因重组猪伪狂犬病病毒活载体的构建
以PCV3基因组为模板，用PCV3-Cap-F和PCV3-Cap-R引物扩增获得大小约为645bp的PCV3Cap蛋白基因，将其用NheI和BamHI酶切处理，与经NheI和BamHI酶切处理的pAc-GFP-C1质粒连接，获得含CMV启动子的PCV3Cap蛋白基因质粒pAc-PCV3-Cap；以pAc-PCV3-Cap质粒为模板，用CMVF和SV40R引物扩增获得大小约为1425bp的CMV-PCV3-Cap片段，将其用SmalI和SalIsI酶切处理，与同样酶切处理的pUC-US6A-US2B连接，经酶切鉴定获得pUC-US6A-US2B-PCV3-Cap质粒。
根据实施例3方法将rPRV-TK-/gI-/gE-/11K-/28K--GFP基因组和pUC-US6A-US2B-PCV3-Cap共转染Vero细胞，构建猪圆环病毒3型Cap蛋白基因重组猪伪狂犬病病毒活载体，经鉴定获得含PCV3Cap蛋白基因的重组病毒命名为rPRV-TK-/gI-/gE-/11K-/28K--PCV3-Cap(简称重组病毒2)。
实施例5猪圆环病毒2型、3型Cap蛋白基因重组猪伪狂犬病病毒活载体的构建
以PCV2基因组为模板，用PCV2-Cap-F和PCV2-Cap-R引物扩增获得大小约为702bp的PCV2Cap蛋白基因，将其用NheI和BamHI酶切处理，与经NheI和BamHI酶切处理的pAc-GFP-C1质粒连接，获得含CMV启动子的PCV2Cap蛋白基因质粒pAc-PCV2-Cap；
以PCV3基因组为模板，用PCV3-Cap-F和PCV3-Cap-R引物扩增获得大小约为645bp的PCV3Cap蛋白基因，将其BsaI酶切处理，与经BamHI酶切处理的pAc-PCV2-Cap质粒连接，获得含CMV启动子的PCV2Cap蛋白基因和PCV3Cap蛋白基因质粒pAc-PCV2-Cap-PCV3-Cap；
以pAc-PCV2-Cap-PCV3-Cap质粒为模板，用CMVF和SV40R引物扩增获得大小约为2127bp的CMV-PCV2-Cap-PCV3-Cap片段，将其用SmalI和SalIsI酶切处理，与同样酶切处理的pUC-US6A-US2B连接，经酶切鉴定获得pUC-US6A-US2B-PCV2-Cap-PCV3-Cap质粒。
根据实施例3方法将rPRV-TK-/gI-/gE-/11K-/28K--GFP基因组和pUC-US6A-US2B-PCV2-Cap-PCV3-Cap共转染Vero细胞，构建猪圆环病毒2型、3型Cap蛋白基因重组猪伪狂犬病病毒活载体，经鉴定获得含PCV2、PCV3Cap蛋白基因的重组病毒命名为rPRV-TK-/gI-/gE-/11K-/28K--PCV2-Cap-PCV3-Cap(简称重组病毒3)。
实施例6猪圆环病毒2型、3型Cap蛋白病毒样颗粒疫苗的制备
分别将序列表SEQ ID NO.1、序列表SEQ ID NO.2所示PCV2、PCV3Cap蛋白基因送苏州泓迅生物科技股份有限公司进行全序列合成，并连接到pET28a质粒上。连接后的质粒和分子伴侣质粒pG-Tf2共转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建大肠杆菌表达菌株pET28a-PCV2-Cap/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3)、pET28a-PCV3-Cap/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3)，并进行目的蛋白可溶性表达。表达的PCV2、PCV3Cap蛋白通过200KV透射电镜，放大倍数60000倍，观察经5％磷钨酸负染、固定于喷碳的铜网上的PCV2、PCV3病毒样颗粒，结果显示大量的病毒样颗粒，且大小均匀，呈现为空心粒子状态。
将上述制备的PCV2Cap蛋白、PCV3Cap蛋白按比例混合后缓缓加入到水溶性佐剂Gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀。PCV2、PCV3Cap蛋白病毒样颗粒疫苗的具体配方见表4。
表4 PCV2、PCV3Cap蛋白病毒样颗粒疫苗配比
组分 疫苗1 疫苗2
PCV2-Cap蛋白(μg/ml) 100 -
PCV3-Cap蛋白(μg/ml) - 100
Gel佐剂(V/V％) 10％ 10％
实施例7重组病毒的免疫原性试验
1、PCV2部分
将28～30日龄经ELISA检测PRV、PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪40头随机分成8组，5头/组。第1～2组免疫实施例3构建的重组病毒1，第3～4组免疫实施例5构建的重组病毒3，第5～6组免疫实施例6制备的疫苗1，第7～8组不免疫作为攻毒对照组。重组病毒免疫组注射1ml/头(含106.0TCID50)，疫苗1免疫组注射2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。第1组、第3组、第5组免疫后21日连同攻毒对照组第7组攻毒，第2组、第4组、第6组免疫后28日连同攻毒对照组第8组攻毒，攻毒毒株为猪圆环病毒2型HH3株(PorcineCircovirus type 2，Strain HH3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201726，保藏日期为2017年6月4日，保藏地址：中国武汉·武汉大学)，攻毒剂量均为105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测结果进行判定，具体结果见表5、表6。
表5免疫后21日PCV2攻毒保护试验结果
Figure BDA0001633202850000171
Figure BDA0001633202850000181
表6免疫后28日PCV2攻毒保护试验结果
Figure BDA0001633202850000182
结果显示，重组病毒免疫猪只后21日即可得到100％保护，攻毒后所有猪只均未检测到病毒；病毒样颗粒疫苗1免疫猪只后21日2/5病毒检测阳性。表明重组病毒免疫猪只后，抗体产生更快，至少提前1周提供针对PCV2的完全保护。
2、PCV3部分
将28～30日龄经ELISA检测PRV、PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪40头随机分成8组，5头/组。第9～10组免疫实施例4构建的重组病毒2，第11～12组免疫实施例5构建的重组病毒3，第13～14组免疫实施例6制备的疫苗2，第15～16组不免疫作为攻毒对照组。重组病毒免疫组注射1ml/头(含106.0TCID50)，疫苗2免疫组注射2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。第9组、第11组、第13组免疫后21日连同攻毒对照组第15组攻毒，第10组、第12组、第14组免疫后28日连同攻毒对照组第16组攻毒，攻毒毒株为猪圆环病毒3型SG株(Porcine Circovirus type 3，Strain SG，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201712，保藏日期为2017年3月23日，保藏地址：中国武汉·武汉大学)，攻毒剂量均为105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测结果进行判定，具体结果见表7、表8。
表7免疫21日PCV3攻毒保护试验结果
Figure BDA0001633202850000191
表8免疫后28日PCV3攻毒保护试验结果
Figure BDA0001633202850000192
Figure BDA0001633202850000201
结果显示，重组病毒免疫猪只后21日即可得到100％保护，攻毒后所有猪只均未检测到病毒；病毒样颗粒疫苗2免疫猪只后21日2/5病毒检测阳性。表明重组病毒免疫猪只后，抗体产生更快，至少提前1周提供针对PCV3的完全保护。
3、PRV部分
将9日龄经ELISA检测PRV、PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪50头随机分成10组，5头/组。第17～18组免疫实施例3构建的重组病毒1，第19～20组免疫实施例4构建的重组病毒2，第21～22组免疫实施例5构建的重组病毒3，第23～24组免疫猪伪狂犬病病毒HN1201株的gI、gE、11K、28K、TK五基因缺失致弱株，第25～26组不免疫作为攻毒对照组。重组病毒免疫组注射1ml/头(含106.0TCID50)，五基因缺失致弱株免疫组注射1ml/头(含106.0TCID50)，攻毒对照组接种DMEM培养基1ml/头。第17组、第19组、第21组、第23组免疫后21日连同攻毒对照组第25组攻毒，第18组、第20组、第22组、第24组免疫后28日连同攻毒对照组第26组攻毒，攻毒毒株为猪伪狂犬病病毒HN1201株，攻毒剂量均为107.0TCID50/头，攻毒后连续观察临床症状和死亡情况见表9、表10，攻毒后每日测定仔猪体温并观察临床症状。
表9免疫后21日PRV攻毒保护试验结果
Figure BDA0001633202850000202
Figure BDA0001633202850000211
表10免疫后28日PRV攻毒保护试验结果
Figure BDA0001633202850000212
结果显示，重组病毒和猪伪狂犬病病毒五基因缺失株免疫仔猪后，无论是免疫后21日攻毒还是免疫后28日攻毒，均可阻断猪伪狂犬病病毒感染(出现临床症状)，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照仔猪攻毒后5日全部死亡。表明重组病毒免疫猪只后，显示出很好的免疫保护，重组的外源基因不影响其免疫原性。
实施例8重组病毒广谱性保护试验
1、PCV2部分
将28～30日龄经ELISA检测PRV、PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪75头随机分成15组，5头/组。第27～31组免疫实施例3构建的重组病毒1，第32～36组免疫实施例5构建的重组病毒3，第37～41组不免疫作为攻毒对照组。重组病毒免疫组注射1ml/头(含106.0TCID50)，攻毒对照组接种DMEM培养基1ml/头。第27组、第32组免疫后21日连同攻毒对照组第37组用新近从中国河南省分离的猪圆环病毒2a基因亚型HN06株强毒株攻毒，第28组、第33组免疫后21日连同攻毒对照组第38组用新近从中国江苏省分离的猪圆环病毒2b基因亚型JS04株强毒株攻毒，第29组、第34组免疫后21日连同攻毒对照组第39组用新近从中国吉林省分离的猪圆环病毒2d基因亚型JL13株强毒株攻毒，第30组、第35组免疫后21日连同攻毒对照组第40组用新近从中国重庆市分离的猪圆环病毒2new基因亚型CQ14株强毒株攻毒，第31组、第36组免疫后21日连同攻毒对照组第41组用新近从中国广东省分离的猪圆环病毒2new基因亚型GD15株强毒株攻毒，攻毒剂量均为105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测结果进行判定，具体结果见表11。
表11重组病毒针对PCV2感染广谱性保护试验结果
Figure BDA0001633202850000221
Figure BDA0001633202850000231
结果显示，第37～41组攻毒对照组攻毒后均不同程度出现体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓等临床症状，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点的病理变化，通过各脏器组织进行PCR检测，可再次分离到猪圆环病毒2型病毒；而第27～36组免疫组攻毒后无异常临床症状，剖检各组织器官也无异常，通过各脏器组织进行PCR检测，均显示PCV2阴性。表明本发明提供的重组病毒一次免疫21日，即可使得猪只针对不同地域来源、不同基因亚型的猪圆环病毒2型攻毒提供有效的、完全免疫保护，且从各脏器组织中不能检出攻毒的PCV2。
2、PCV3部分
将28～30日龄经ELISA检测PRV、PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪75头随机分成15组，5头/组。第42～46组免疫实施例4构建的重组病毒2，第47～51组免疫实施例5构建的重组病毒3，第52～56组不免疫作为攻毒对照组。重组病毒免疫组注射1ml/头(含106.0TCID50)，攻毒对照组接种DMEM培养基1ml/头。第42组、第47组免疫后21日连同攻毒对照组第52组用新近从中国河南省分离的猪圆环病毒3型HN12株强毒株攻毒，第43组、第48组免疫后21日连同攻毒对照组第53组用新近从中国江苏省分离的猪圆环病毒3型JS08株强毒株攻毒，第44组、第49组免疫后21日连同攻毒对照组第54组用新近从中国吉林省分离的猪圆环病毒3型JL11株强毒株攻毒，第45组、第50组免疫后21日连同攻毒对照组第55组用新近从中国重庆市分离的猪圆环病毒3型CQ04株强毒株攻毒，第46组、第51组免疫后21日连同攻毒对照组第56组用新近从中国广东省分离的猪圆环病毒3型GD05株强毒株攻毒，攻毒剂量均为105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测结果进行判定，具体结果见表12。
表12重组病毒针对PCV3感染广谱性保护试验结果
Figure BDA0001633202850000241
Figure BDA0001633202850000251
结果显示，第52～56组攻毒对照组攻毒后均不同程度出现体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓等临床症状，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点的病理变化，通过各脏器组织进行PCR检测，可再次分离到猪圆环病毒3型病毒；而第42～51组免疫组攻毒后无异常临床症状，剖检各组织器官也无异常，通过各脏器组织进行PCR检测，均显示PCV3阴性。表明本发明提供的重组病毒一次免疫21日，即可使得猪只针对不同地域来源的猪圆环病毒3型攻毒提供有效的、完全免疫保护，且从各脏器组织中不能检出攻毒的PCV3。
表明，本发明提供的重组病毒具有广谱的免疫原性，对于流行的猪圆环病毒3型、2型野毒均能提供完全保护。且当免疫本发明的重组病毒后，即便野毒感染了免疫的猪只，也不会对猪的发育生长、进食增肥产生影响。
实施例9重组病毒混合感染保护试验
将9日龄经ELISA检测PRV、PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪35头随机分成7组，5头/组。第57组免疫实施例3构建的重组病毒1，第58组免疫实施例4构建的重组病毒2，第59组免疫实施例5构建的重组病毒3，第60组免疫实施例6制备的疫苗1，第61组免疫实施例6制备的疫苗2，第62组免疫猪伪狂犬病病毒HN1201株的gI、gE、11K、28K、TK五基因缺失致弱株，第63组不免疫作为攻毒对照组。重组病毒和五基因缺失致弱株免疫组注射1ml/头(含106.0TCID50)，疫苗1和疫苗2免疫组注射2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。第57组和第60组免疫后21日攻毒，攻毒毒株为猪伪狂犬病病毒HN1201株和猪圆环病毒2型HH3株混合病毒液；第58组和第61组免疫后21日攻毒，攻毒毒株为猪伪狂犬病病毒HN1201株和猪圆环病毒3型SG株混合病毒液；第59组和第62组免疫后21日连同对照组第63组攻毒，攻毒毒株为猪伪狂犬病病毒HN1201株、猪圆环病毒2型HH3株和猪圆环病毒3型SG株混合病毒液；HN1201株攻毒剂量为107.0TCID50/头，HH3株攻毒剂量为105.0TCID50/头，SG株攻毒剂量为105.0TCID50/头；攻毒后连续观察临床症状和死亡情况见表13，攻毒后每日测定仔猪体温并观察临床症状。
表13重组病毒混合感染保护试验结果
Figure BDA0001633202850000261
Figure BDA0001633202850000271
结果显示，第63组攻毒对照组攻毒后4日全部死亡；第57组、第58组、第59组重组病毒免疫仔猪后，免疫后21日攻毒，均可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为仔猪提供100％(5/5)保护；而第60组、第61组、第62组免疫组不能有效阻止PRV和PCV2和/或PCV3的混合感染，依然呈发病或死亡状态。表明本发明提供的重组病毒一次免疫就可对猪只针对PRV、PCV2、PCV3联合攻毒提供有效的、完全免疫保护。且当免疫本发明的重组病毒后，即便混合野毒感染了免疫的猪只，也不会对猪的发育生长、进食增肥产生影响。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 普莱柯生物工程股份有限公司
<120> 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒株、疫苗及其制备方法和应用
<130> 1
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 702
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒2型new基因亚型（Porcine Circovirus type 2，new subtype)
<400> 1
atgacctacc cgcgtcgtcg ttaccgtcgt cgtcgtcacc gtccgcgttc tcacctgggt 60
cagatcctgc gtcgtcgtcc gtggctggtt cacccgcgtc accgttaccg ttggcgtcgt 120
aaaaacggta tcttcaacac ccgtctgtct cgttctttcg gttacaccgt tgttacctct 180
accgttaccc cgccgtcttg ggctgttgac atgatgcgtt tcaacatcaa cgacttcctg 240
ccgccgggtg gtggttctaa cccgcgttct gttccgttcg aatactaccg tatccgtaaa 300
gttaaagttg aattcttcgc tcgttctccg atcacccagg gtgaccgtgg tgttggttct 360
tctgctgtta tcctggacga caacttcgtt aacaaaacca acgctctgtc ttacgacccg 420
tacgttaact actcttctcg tcacaccatc acccagccgt tctcttacca ctctcgttac 480
ttcaccccga aaccggttct ggactctacc atcgactact tccagccgaa caacaaacgt 540
aaccagctgt ggctgcgtct gcagaccacc ggtaacgttg accacgttgg tctgggtacc 600
gctttcgaac actctatcta cgaccaggct tacaacatcc gtgttaccat gtacgttcag 660
ttccgtgaat tcaacctgaa agacccgccg ctgaacccgt aa 702
<210> 2
<211> 645
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型（Porcine Circovirus type 3）
<400> 2
atgcgtcacc gtgctatctt ccgtcgtcgt ccgcgtccgc gtcgtcgtcg tcgtcaccgt 60
cgtcgttacg ctcgtcgtaa actgttcatc cgtcgtccga ccgctggtac ctactacacc 120
aaaaaatact ctaccatgaa cgttatctct gttggtaccc cgcagaacaa caaaccgtgg 180
cacgctaacc acttcatcac ccgtctgaac gaatgggaaa ccgctatctc tttcgaatac 240
tacaaaatcc tgaaaatgaa agttaccctg tctccggtta tctctccggc tcagcagacc 300
aaaaccatgt tcggtcacac cgctatcgac ctggacggtg cttggaccac caacacctgg 360
ctgcaggacg acccgtacgc tgaatcttct acccgtaaag ttatgacctc taaaaaaaaa 420
cactctcgtt acttcacccc gaaaccgctg ctggctggta ccacctctgc tcacccgggt 480
cagtctctgt ctttcttctc tcgtccgacc ccgtggctga acacctacga cccgaccgtt 540
cagtggggtg ctctgctgtg gtctatctac gttccggaaa aaaccggtat gaccgacttc 600
tacggtacca aagaagtttg gatccgttac aaatctgttc tgtaa 645
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cccatgccct gaatttcca 19
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cagcgcactt ctttcgtttt cag 23
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ccacagaagg cgctatgtc 19
<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ccgcataagg gtcgtcttg 19
<210> 7
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cccgggtagt tattaatagt aatcaattac g 31
<210> 8
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gtcgacctag aatgcagtga aaaaaatgc 29
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<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ccggaattcg caggtggacc ggctgctgaa cgag 34
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtcgactgcg gacgcggtcc gaccccacgg 30
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
cccaagcttg acgaggaaga ggaggacgag gaag 34

Claims (7)

1.一种重组猪伪狂犬病病毒株，所述重组猪伪狂犬病病毒株重组有猪圆环病毒Cap蛋白基因，其特征在于，所述猪圆环病毒Cap蛋白基因为猪圆环病毒2型和/或3型Cap蛋白基因，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白基因为猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白基因；所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白为SEQ ID NO. 1编码的蛋白，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白为序列SEQ ID NO. 2编码的蛋白，所述猪伪狂犬病病毒株为伪狂犬变异株的gI、gE、11K、28K、TK五基因缺失致弱株，所述伪狂犬变异株为HN1201株或HN1202株。
2.根据权利要求1所述的重组猪伪狂犬病病毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒株为猪伪狂犬病病毒HN1201株的gI、gE、11K、28K、TK五基因缺失致弱株。
3.一种活疫苗rPRV-Cap，其特征在于，所述活疫苗rPRV-Cap包括免疫量的权利要求1~2任一项所述的重组猪伪狂犬病病毒株;所述重组猪伪狂犬病病毒致弱株抗原含量为≥106.0TCID50/头份。
4.根据权利要求3所述的活疫苗rPRV-Cap，其特征在于，所述活疫苗rPRV-Cap进一步包括冻干保护剂。
5.根据权利要求3所述的活疫苗rPRV-Cap，其特征在于，所述活疫苗rPRV-Cap进一步含有失活病原体或抗原组分;所述抗原为猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪圆环病毒抗原和/或副猪嗜血杆菌抗原或猪肺炎支原体抗原。
6.一种活疫苗rPRV-Cap的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤（1）克隆所述猪圆环病毒2型Cap蛋白基因和／或克隆所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因，并将所述猪圆环病毒2型Cap蛋白基因和／或所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因重组到伪狂犬病病毒活载体以获得权利要求1~2任一项所述重组猪伪狂犬病病毒株；以及
步骤（2）在所述重组猪伪狂犬病病毒株中加入冻干保护剂。
7.根据权利要求3~5任一项所述的活疫苗rPRV-Cap在制备预防猪圆环病毒和/或猪伪狂犬病病毒感染的药物中的应用。
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