CN111004783A - 一种表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组羊口疮病毒，其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体讲，涉及一种表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒，其制备方法及应用。本发明的重组羊口疮病毒采用ORF121基因缺失的羊口疮病毒表达猪圆环病毒2型CAP蛋白，具有免疫率高和安全的技术效果。

Description

一种表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒，其制备 方法及应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体讲，涉及一种表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒，其制备方法及应用。
背景技术
羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)属于痘病毒科、副痘病毒属的嗜上皮型双链DNA病毒。该病毒在病毒结构和基因排列上与猪圆环病毒2型相似度较高。该病毒编码132个基因，有研究表明，其ORF121基因是ORFV基因组中外源基因的合适插入位点。猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)可引发猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征，同时也是引起断奶仔猪系统衰竭综合征的主要病原。1991年首次报道后，在多个国家均有爆发，给养猪产业造成了巨大经济损失。
虽然目前已经研制出了不少商品化灭活疫苗、亚单位疫苗和嵌合病毒灭活疫苗，但这些疫苗大多免疫成本高，所需注射次数多而且存在免疫失败的风险，因此研制高效廉价新型疫苗是减少经济支出和增强免疫效果的关键。活载体通常具有宿主范围广，表达外源基因效率高，能实现几种病毒的联合免疫且用较小的免疫剂量就可以达到较强的免疫效果等优点。鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒。
本发明的第二发明目的在于提供该表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒的制备方法。
本发明的第三发明目的在于提供该表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒的应用。
为了解决上述技术问题，采用的技术方案为：
本发明涉及一种表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒，其特征在于，所述重组羊口疮病毒采用ORF121基因缺失的羊口疮病毒表达猪圆环病毒2型CAP蛋白。
可选的，所述缺失为采用CRISPR/Cas9技术敲除，具体包括以下步骤：
(1)扩增羊口疮病毒ORF121基因的上游同源臂和下游同源臂、CAP基因和CMV基因，将所述上游同源臂和下游同源臂的基因片段、所述CAP基因的基因片段、所述CMV基因的基因片段连入载体，获得表达载体1；
(2)扩增EGFP基因，并将所述EGFP基因的基因片段连入所述表达载体1，获得表达载体2；
(3)设计用于特异性靶向敲除ORF121基因的sgRNA，将其与载体连接，转化提取得到ORF121-CRISPR/Cas9载体1；
(4)设计用于特异性靶向敲除EGFP基因的sgRNA，将其与载体连接，转化提取得到EGFP-CRISPR/Cas9载体2；
(5)将ORF121-CRISPR/Cas9载体1与表达载体2混合转染，得到转染细胞；
(6)将所述转染细胞感染羊口疮病毒，得到敲除羊口疮病毒ORF121基因并表达EGFP基因的羊口疮病毒基因重组病毒；
(7)将所述EGFP-CRISPR/Cas9载体2与所述表达载体1混合转染，得到转染细胞；
(8)将所述转染细胞感染所述羊口疮病毒基因重组病毒，得到表达外源蛋白的重组羊口疮病毒。
本发明还涉及该表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒的制备方法，所述制备方法至少包括以下步骤：
(1)以羊口疮病毒HT-01株基因组为模板，进行扩增得到ORF121基因上游同源臂和下游同源臂片段；
(2)以PCAGG-EGFP质粒为模板，扩增得到EGFP基因片段；
(3)以猪圆环病毒2型基因组为模板，扩增得到CAP基因片段；
(4)以pcDNA3.1为模板，扩增得到CMV基因片段；
(5)将所述ORF121基因上游同源臂和下游同源臂片段、所述CMV基因片段和所述CAP基因片段分别双酶切，分别连入pcDNA3.1载体，获得表达载体pcDNA-ORF121；
(6)将所述EGFP基因片段连入所述表达载体pcDNA-ORF121，获得表达载体pcDNA-ORF121-EGFP；
(7)设计互补引物ORF121-sgRNA1、ORF121-sgRNA2、EGFP-sgRNA1、EGFP-sgRNA2，经变性、退火后获得双链sgRNA；所述ORF121-sgRNA1，ORF121-sgRNA2、EGFP-sgRNA1、EGFP-sgRNA2序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8所示；
(8)酶切pSpCas9-2A-Puro载体，将ORF121-sgRNA1和ORF121-sgRNA2，EGFP-sgRNA1和EGFP-sgRNA 2分别连入酶切后的所述pSpCas9-2A-Puro载体，连接产物经转化、提取质粒后，得到CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA1、CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA2、CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA 1、CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA 2；
(9)将所述CRISPR-Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA1、所述CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA2和表达载体pcDNA-ORF121-EGFP共转染VERO细胞，接种羊口疮病毒，得到重组病毒ORFV CAP/EGFP；
(10)将所述CRISPR-Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA1、所述CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA2和表达载体pcDNA-ORF121共转染VERO细胞，接种所述重组病毒ORFV CAP/EGFP，得到所述表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒。
可选的，在步骤(1)中，利用ORF121基因上游同源臂引物对和下游同源臂引物对进行扩增，所述ORF121基因上游同源臂引物对和下游同源臂引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:9～SEQ ID NO:12所示。
可选的，在步骤(2)中，利用EGFP上下游引物进行扩增，所述EGFP上下游引物序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示。
可选的，在步骤(3)中，利用CAP基因上下游引物进行扩增，所述CAP基因上下游引物序列如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16所示。
可选的，在步骤(4)中，利用CMV基因上下游引物进行扩增，所述CMV基因上下游引物序列如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示。
可选的，在步骤(4)中，
在步骤(5)中，所述ORF121基因上下游同源臂用Nhe1、HindⅢ、NotI、Xba1进行双酶切，所述CMV基因片段用HindIII、NcoI进行双酶切，所述CAP基因片段用NcoI、BamH I进行双酶切；
在步骤(6)中，利用BamH I、NotI内切酶酶切pcDNA-ORF121；
在步骤(9)中，用BbsI酶切pSpCas9-2A-Puro载体。
可选的，在步骤(9)中，24h后接种1MOI羊口疮病毒，待出现病变的细胞超过80％后，收集包含重组病毒ORFV CAP/EGFP的上清，得到重组病毒ORFV CAP/EGFP；
在步骤(10)中，24h后接种1MOI所述重组病毒ORFV CAP/EGFP，待出现病变的细胞超过80％后，收集包含重组病毒ORFV CAP的上清，得到所述表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒。
本发明还涉及上述表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒在猪圆环病毒2型疫苗制备中的应用。
本发明至少具有以下有益的效果：
本发明提供了一种制备免疫效率高和安全的表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒基因工程疫苗株。本发明选用的羊口疮病毒引起的损伤具有皮肤局限性、痊愈速度快、不会造成病毒感染的全身化。并且，本发明疫苗株表达外源基因效率高、能快速启动宿主体内的非特异性细胞免疫反应和特异性免疫反应。
附图说明
图1为表达载体构建示意图；
图2为CRISPR-Cas9载体构建示意图；
图3为121基因上下臂的酶切鉴定图，从左至右依次为：5000DNA marker，NheI和Xba1双酶切结果；
图4为重组质粒pORFV-3的酶切鉴定图，从左至右依次为：10000DNA marker、用HindⅢ单酶切鉴定结果、用HindⅢ、NotI双酶切鉴定结果；
图5为细胞中病毒生长曲线；
图6为上清中病毒生长曲线；
图7为重组羊口疮病毒的Western-blot实验结果，从左至右依次为marker、重组羊口疮病毒。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本发明的范围。
具体实施方式
本发明实施例提出一种表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒，重组羊口疮病毒采用ORF121基因缺失的羊口疮病毒表达猪圆环病毒2型的CAP蛋白。利用羊口疮病毒自然分离株在病毒复制非必需区存在同源重组和基因片段的缺失、丢失，可用外源基因取代这些复制非必需区进行重组疫苗的研制。Cap蛋白是PCV2唯一结构蛋白，构成了病毒核衣壳，且能与宿主细胞受体结合，是PCV2主要的免疫原性蛋白，能刺激机体产生抗体，可作为PCV2抗原研究的良好靶蛋白。鉴于此，本发明实施例利用ORF121基因缺失的羊口疮病毒表达猪圆环病毒2型的CAP蛋白，得到了该重组病毒，从而提出一种免疫效率高和安全的表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的羊口疮病毒基因工程重组疫苗株。
具体的，ORF121基因缺失为羊口疮病毒HT-01株基因组序列120649bp-121557bp位核苷酸序列的缺失。
具体的，本发明的重组羊口疮病毒为采用CRISPR/Cas9技术敲除得到，具体包括以下步骤：
(1)扩增羊口疮病毒ORF121基因的上游同源臂和下游同源臂、CAP基因和CMV基因，将上游同源臂和下游同源臂的基因片段、CAP基因的基因片段、CMV基因的基因片段连入载体，获得表达载体1；
(2)扩增EGFP基因，并将EGFP基因的基因片段连入表达载体1，获得表达载体2；
(3)设计用于特异性靶向敲除ORF121基因的sgRNA，将其与载体连接，转化提取得到ORF121-CRISPR/Cas9载体1；具体序列如表5所示；
(4)设计用于特异性靶向敲除EGFP基因的sgRNA，将其与载体连接，转化提取得到EGFP-CRISPR/Cas9载体2；具体序列如表5所示；
(5)将ORF121-CRISPR/Cas9载体1与表达载体2混合转染，得到转染细胞；
(6)将转染细胞感染羊口疮病毒，得到敲除羊口疮病毒ORF121基因并表达EGFP基因的羊口疮病毒基因重组病毒；
(7)将EGFP-CRISPR/Cas9载体2与表达载体1混合转染，得到转染细胞；
(8)将转染细胞感染所述羊口疮病毒基因重组病毒，得到表达外源蛋白的重组羊口疮病毒。
本发明实施例还涉及该表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒的制备方法，至少包括以下步骤：
(1)以羊口疮病毒HT-01株基因组为模板，进行扩增得到ORF121基因上游同源臂和下游同源臂片段；
例如，利用ORF121基因上游同源臂引物对和下游同源臂引物对进行扩增，ORF121基因上游同源臂引物对和下游同源臂引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示。
具体序列如表1所示：
表1
核苷酸序号 序列名称 核苷酸序列
SEQ ID NO:9 L ORF121-F ctagctagctagggcaagcagttggatacgg
SEQ ID NO:10 L ORF121-R cagaattcgcaagcttggttgtgtgggccacagagttgag
SEQ ID NO:11 R ORF121-F attcttatgcggccgcggagcactgctcggaggagtgct
SEQ ID NO:12 R ORF121-R tgctctagagcaatcatgcgcagcgacgacatcatc
(2)以PCAGG-EGFP质粒为模板，扩增得到EGFP基因片段；
例如，利用EGFP上下游引物进行扩增，EGFP上下游引物序列如SEQ ID NO:13、SEQID NO:14所示。
具体序列如表2所示：
表2
Figure BDA0002323194060000061
Figure BDA0002323194060000071
(3)以猪圆环病毒2型基因组为模板，扩增得到CAP基因片段；
例如，利用CAP基因上下游引物进行扩增，CAP基因上下游引物序列如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16所示。
具体序列如表3所示：
表3
核苷酸序号 序列名称 核苷酸序列
SEQ ID NO:15 CAP上游引物 catgccatggcatgatgacgtatccaaggaggcgtttc
SEQ ID NO:16 CAP下游引物 cgcggatccgcgttaagggttaagtggggggtctttaag
(4)以pcDNA3.1为模板，扩增得到CMV基因片段；
例如，利用CMV基因上下游引物进行扩增，CMV基因上下游引物序列如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示；具体序列如表4所示：
表4
核苷酸序号 序列名称 核苷酸序列
SEQ ID NO:17 CMV上游引物 cccaagcttggggacattgattattgactagttatta
SEQ ID NO:18 CMV下游引物 catgccatggcatgaatcagacagaaagcgccgccgctg
(5)将ORF121基因上游同源臂和下游同源臂片段、CMV基因片段和CAP基因片段分别双酶切，分别连入pcDNA3.1载体，获得表达载体pcDNA-ORF121；
可选的，ORF121基因上下游同源臂用Nhe1、HindⅢ、NotI、Xba1进行双酶切，CMV基因片段用HindIII、NcoI进行双酶切，CAP基因片段用NcoI、BamH I进行双酶切。
(6)将EGFP基因片段连入表达载体pcDNA-ORF121，获得表达载体pcDNA-ORF121-EGFP；
可选的，利用BamH I、NotI内切酶酶切pcDNA-ORF121；
(7)设计互补引物ORF121-sgRNA1、ORF121-sgRNA2、EGFP-sgRNA1、EGFP-sgRNA2，经变性、退火后获得双链sgRNA；所述ORF121-sgRNA1，ORF121-sgRNA2、EGFP-sgRNA1、EGFP-sgRNA2序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8所示；
具体序列如表5所示：
表5
核苷酸序号 序列名称 核苷酸序列
SEQ ID NO:1 ORF121-sgRNA1上游引物 caccgcaccgcgagcccgggtttcggtcg
SEQ ID NO:2 ORF121-sgRNA1下游引物 aaacaaacccgcgaccgaaaccccgggctcgc
SEQ ID NO:3 ORF121-sgRNA2上游引物 caccgcaccgccacgtcggtgaagcactcgc
SEQ ID NO:4 ORF121-sgRNA2下游引物 aaacaaacccgcgagtgcttcaccgacgtggc
SEQ ID NO:5 EGFP-sgRNA1:上游引物 caccggtcgccctcgaacttcacct
SEQ ID NO:6 EGFP-sgRNA1下游引物 aaacaggtgaagttcgagggcgacc
SEQ ID NO:7 EGFP-sgRNA2上游引物 caccggttggggtctttgctcaggg
SEQ ID NO:8 EGFP-sgRNA2下游引物 aaacccctgagcaaagaccccaacc
(8)酶切pSpCas9-2A-Puro载体，将ORF121-sgRNA1和ORF121-sgRNA2，EGFP-sgRNA1和EGFP-sgRNA 2分别连入酶切后的所述pSpCas9-2A-Puro载体，连接产物经转化、提取质粒后，得到CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA1、CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA2、CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA 1、CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA 2；
(9)将CRISPR-Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA1、CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA2和表达载体pcDNA-ORF121-EGFP共转染VERO细胞，接种羊口疮病毒，得到重组病毒ORFV CAP/EGFP；
可选的，用BbsI酶切pSpCas9-2A-Puro载体。
(10)将CRISPR-Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA1、CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA2和表达载体pcDNA-ORF121共转染VERO细胞，接种重组病毒ORFV CAP/EGFP，得到表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒。
可选的，在步骤(9)中，24h后接种1MOI羊口疮病毒，待出现病变的细胞超过80％后，收集包含重组病毒ORFV CAP/EGFP的上清，得到重组病毒ORFV CAP/EGFP。
可选的，在步骤(10)中，24h后接种1MOI所述重组病毒ORFV CAP/EGFP，待出现病变的细胞超过80％后，收集包含重组病毒ORFV CAP的上清，得到表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒。
本发明还涉及上述表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒在猪圆环病毒2型疫苗制备中的应用。通过实验动物进行安全性和免疫效力试验，检测实验动物接种该疫苗后存活率和体内抗体表达水平等步骤，即可制备得到猪圆环病毒2型的疫苗。
下面通过实施例进一步说明本发明，这些实施例只是用于说明本发明，本发明不限于以下实施例。本发明实施例用到的制剂均为市售制剂。
实施例1羊口疮病毒ORF121基因缺失毒株的制备。
1、材料与方法
1.1实验材料
羊口疮病毒HT-01株，质粒pcDNA3.1购自Thermo(美国)，CRISPR/Cas9质粒pSpCas9-2A-Puro购自Addgene(美国)，大肠杆菌DH5α购自TransGen Biotec(北京)，限制性内切酶购自Thermo(美国)，质粒小提试剂盒、病毒基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司，胶回收试剂盒购自Thermo(美国)，pMD19T、lipofectamineTM3000均购自TaKaRa(大连)，DMEM培养基、MEM培养基、胎牛血清均购自Gibco(中国)。
1.2实验方法
1.2.1表达载体和切割质粒构建流程图，见图1和2。
1.2.1.1表达载体的构建
1)根据NCBI中发表的羊口疮病毒的ORF121基因阅读框架，利用Premier5.0设计一对上下游引物。
引物名称：上游引物为ORF121-F，下游引物为ORF121-R，引物序列如表6所示：
表6
Figure BDA0002323194060000091
Figure BDA0002323194060000101
2)以羊口疮病毒HT-01株基因组为模板扩增ORF121基因，PCR反应体系如表7所示：
表7
5×PS GXL Buffer 5μl
dNTP mix 2μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
模板 1μl
primer star GXL 0.5μl
ddH<sub>2</sub>O 14.5μl
PCR反应条件：94℃预变性2min，98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸90s，35个循环，72℃终延伸10min。PCR产物送华大基因有限公司测序。
3)根据ORF121基因在全基因组中的位置设计上下游同源臂，分别在上游同源臂(LORF121)引物5’端分别加入酶切位点Nhe1和HindⅢ，在下游同源臂(R ORF121)引物5’端分别加入NotI和Xba1。扩增目的基因片段上游同源臂长度为835bp，下游同源臂长度为835bp。
上游同源臂引物和下游同源臂引物如表1所示。
4)ORF121基因上、下游同源臂片段的扩增
以羊口疮病毒HT-01株基因组为模板，利用ORF121基因上游同源臂引物对和下游同源臂引物对进行扩增，得到ORF121基因上游同源臂和下游同源臂。
PCR反应体系如表8所示：
表8
Figure BDA0002323194060000102
Figure BDA0002323194060000111
PCR反应条件：94℃预变性2min，98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸90s，35个循环，72℃终延伸10min。
按以上体系PCR扩增5管，扩增的PCR产物用胶回收试剂盒按步骤进行胶回收。
回收的上游同源臂目的片段进行双酶切处理，体系如下：10×Buffer2μl，目的片段1μg，Nhe1和HindⅢ各1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，胶回收试剂盒回收目的片段。
回收的下游同源臂目的片段进行双酶切处理，体系如下：10×Buffer2μl，目的片段1μg，NotI和Xba1各1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，胶回收试剂盒回收目的片段。
5)pcDNA3.1基因扩增
以pcDNA3.1为模板，利用CMV上下游引物进行扩增，得到CMV基因片段。
PCR反应体系：5×PS GXL Buffer 10μl，dNTP mix 4μl，上游引物2μl，下游引物2μl，模板2μl，Primer star GXL1μl，ddH2O 29μl。
PCR反应条件：94℃预变性2min，98℃变性10s、66℃退火15s、72℃延伸90s，35个循环，72℃终延伸10min。
CMV上下游引物如表4所示。
按以上体系PCR扩增5管，扩增的PCR产物用胶回收试剂盒按步骤进行胶回收。
回收的目的片段进行双酶切处理，体系如下：10×Buffer 2μl，目的片段1μg，HindIII和NcoI各1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，胶回收试剂盒回收目的片段。
6)CAP基因扩增
以猪圆环病毒2型病毒为模板，利用CAP上下游引物进行扩增，得到CAP基因片段。
PCR反应体系：5×PS GXL Buffer 10μl，dNTP mix 4μl，上游引物2μl，下游引物2μl，模板2μl，Primer star GXL1μl，ddH2O 29μl。
PCR反应条件：94℃预变性2min，98℃变性10s、67℃退火15s、72℃延伸90s，35个循环，72℃终延伸10min。
CAP上下游引物如表3所示。
按以上体系PCR扩增5管，扩增的PCR产物用胶回收试剂盒按步骤进行胶回收。
回收的目的片段进行双酶切处理，体系如下：10×Buffer 2μl，目的片段1μg，NcoI和BamH I各1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，胶回收试剂盒回收目的片段。
7)EGFP基因扩增
以PCAGG-EGFP质粒为模板，利用EGFP上下游引物进行扩增，得到EGFP基因片段。
PCR反应体系：5×PS GXL Buffer 10μl，dNTP mix 4μl，上游引物2μl，下游引物2μl，模板2μl，Primer star GXL1μl，ddH2O 29μl。
PCR反应条件：94℃预变性2min，98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸90s，35个循环，72℃终延伸10min。
EGFP上下游引物如表2所示。
按以上体系PCR扩增5管，扩增的PCR产物用胶回收试剂盒按步骤进行胶回收。
回收的目的片段进行双酶切处理，体系如下：10×Buffer 2μl，目的片段1μg，HindIII和KpnI各1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，胶回收试剂盒回收目的片段。
8)PCDNA3.1(+)质粒酶切
PCDNA3.1(+)质粒用Nhe1和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切处理，体系如下：10×Buffer 2μl，PCDNA3.1(+)质粒1μg，Nhe1和HindⅢ各1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，胶回收试剂盒回收目的载体。
9)载体PCDNA3.1(+)与目的片段(上游同源臂)的连接
反应体系：目的片段4μl，用Nhe1和HindⅢ酶切处理过的载体PCDNA3.1(+)1μl，SolutionI 5μl，混匀后16℃过夜。
10)连接产物的转化
取DH5α感受态细胞100μl，加入9)中的连接产物10μl，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入无氨苄抗生素的LB液体培养基900μl，37℃、220r/min活化1h，5000rpm离心5min，在生物安全柜中弃去900μl上清，吹打重悬沉淀，均匀涂布于含氨苄抗生素的LB固体平板上，置于37℃培养箱中倒置培养12h。
11)重组质粒的鉴定
将上述转化后的平板中挑取单个菌落并接种于含有千分之一氨苄抗生素的LB中37℃、220rmp/min培养12h，用质粒提取试剂盒进行提取。将提取的质粒命名为pORFV-1。将提取的质粒(pORFV-1)用Nhe1和HindⅢ酶进行酶切鉴定。
12)重组质粒(pORFV-1)的酶切
pORFV-1质粒用NotI和Xba1限制性内切酶进行双酶切处理，体系如下：10×Buffer2μl，pORFV-1质粒1μg，NotI和Xba1各1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，胶回收试剂盒回收目的载体。
13)载体pORFV-1与目的片段(下游同源臂)的连接
在10μl体系中加入：目的片段4μl，用NotI和Xba1酶切处理过的载体(pORFV-1)1μl，SolutionI 5μl，混匀后16℃过夜。
14)连接产物的转化
取DH5α感受态细胞100μl，加入13)中的连接产物10μl，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入无氨苄抗生素的LB液体培养基900μl，37℃、220r/min活化1h，5000rpm离心5min，在生物安全柜中弃去900μl上清，吹打重悬沉淀，均匀涂布于含氨苄抗生素的LB固体平板上，置于37℃培养箱中倒置培养12h。
15)重组质粒(pORFV-2)的鉴定
将上述转化后的平板中挑取单个菌落并接种于含有千分之一氨苄抗生素的LB中37℃、220rmp/min培养12h，用质粒提取试剂盒进行提取。提取的质粒用NheI和Xba1酶进行酶切鉴定，结果如图3所示。
按照12)13)14)15)步骤分别利用内切酶，HindIII、NcoI，NcoI、BamH I在获得的载体上连入CMV基因，CAP基因，将提取的质粒命名为pORFV-2。然后将提取的质粒(pORFV-2)用Nhe1和Xba1酶进行酶切鉴定。取酶切鉴定为阳性且插入方向正确的重组质粒pORFV-2送至华大基因有限公司进行测序，测序结果显示与预期一致，获得重组质粒pORFV-2。
16)重组质粒(pORFV-2)的酶切
pORFV-2质粒用BamH I和NotI限制性内切酶进行双酶切处理，体系如下：
10×Buffer 2μl，pORFV-2质粒1μg，BamH I和NotI各1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，后使用胶回收试剂盒回收目的载体。
17)载体pORFV-2与目的片段(EGFP)的连接
在10μl体系中加入：目的片段4μl，用BamH I和NotI酶切处理过的载体(pORFV-2)2μl，SolutionI 5μl，混匀后16℃过夜。
18)连接产物的转化
取DH5α感受态细胞100μl，加入15)中的连接产物10μl，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入不含氨苄抗生素的LB液体培养基900μl，37℃、220r/min活化1h，5000rpm离心5min，在生物安全柜中弃去900μl上清，利用剩余100μl上清重悬沉淀，均匀涂布于含氨苄抗生素的LB固体平板上，置于37℃培养箱中倒置培养12h。
19)重组质粒(pORFV-3)的鉴定
将上述转化后的平板中挑取单个白色菌落并接种于10mL含氨苄抗生素(千分之一)的LB液体培养基中37℃、220rmp/min培养12h，用质粒提取试剂盒进行提取。将提取的质粒命名为pORFV-3。以提取的质粒(pORFV-3)用HindⅢ单酶切鉴定和用HindⅢ、NotI双酶切鉴定(结果见图4)。取经PCR和酶切鉴定为阳性且插入方向正确的重组质粒pORFV-3送至华大基因有限公司进行测序，测序结果显示与预期一致，获得重组质粒pORFV-3。
1.2.1.2切割质粒构建
1)引物设计
根据羊口疮病毒ORF121基因序列，使用网站(http://crispr.mit.edu/)设计分数较高且GC含量约为50％的互补引物ORF121-sgRNA1、ORF121-sgRNA2。同理，根据EGFP基因序列，设计EGFP-sgRNA1，EGFP-sgRNA2。具体核苷酸序列如表5所示。将上述两对互补的单链引物进行高温变性(95℃，5min)，然后逐步退火至16℃，获得四条双链sgRNA。
2)pSpCas9-2A-Puro质粒酶切
pSpCas9-2A-Puro质粒用BbsI限制性内切酶进行酶切处理，体系如下：10×Buffer2μl，pSpCas9-2A-Puro质粒1μg，BbsI 1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，胶回收试剂盒回收目的载体。
3)pSpCas9-2A-Puro质粒与ORF121-sgRNA1的连接
反应体系：目的片段ORF121-sgRNA1 4μl，用BbsI酶切处理过的载体(pSpCas9-2A-Puro)1μl，SolutionI 5μl，混匀后16℃过夜。
4)连接产物的转化
取stableIII感受态细胞100μl，加入3)中的连接产物10μl，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入不含氨苄抗生素的LB液体培养基900μl，37℃、220r/min活化1h，5000rpm离心5min，在生物安全柜中弃去900μl上清，吹打重悬沉淀，均匀涂布于含氨苄抗生素(100μg/mL)的LB固体平板上，置于37℃培养箱中倒置培养12h。
5)切割质粒(pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA1)的鉴定
将上述转化后的平板中挑取单个白色菌落并接种于10ml含有氨苄抗生素(千分之一)的LB液体培养基中37℃、220rmp/min培养12h，用质粒提取试剂盒进行提取，命名为pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA 1。将提取的质粒送至华大基因有限公司进行测序鉴定。测序结果显示与预期一致。
用相同的原理分别合成pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA 2、pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA 1、pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA 2，测序鉴定。测序结果显示与预期一致。
1.2.2重组病毒构建
1)将CRISPR-Cas9载体ORF121-sgRNA1、ORF121-sgRNA2和表达载体pcDNA-ORF121-EGFP按照1:1:3共转染VERO细胞，培养6h后更换细胞培养液，24h后接种1MOI羊口疮病毒，待出现病变的细胞超过80％后,收集包含重组病毒ORFV CAP/EGFP的上清。
2)将CRISPR-Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA1、pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA2和表达载体pcDNA-ORF121按照1:1:3共转染VERO细胞，培养6h后更换细胞培养液，24h后接种1MOI ORFV CAP/EGFP，待出现病变的细胞超过80％后，收集包含重组病毒ORFVCAP的上清。
3)重组病毒筛选、鉴定、纯化
将2)收取的ORFV CAP/EGFP和ORFV CAP，分别以0.1MOI感染6孔板中的山羊皮肤成纤维细胞；培养1h，弃上清，加入含1％低熔点琼脂糖和2％FBS的MEM，置于37℃、5％CO2培养箱培养，2d后进行荧光观察；挑取荧光斑细胞并置于200μL DMEM，反复冻融裂解细胞3次，分别以10-1、10-2、10-3和10-4稀释比例接入96孔板，每个稀释度设置2个平行重复；36h后收取孔内出现1个噬斑的细胞，反复冻融3次。将此病毒液接种于山羊皮肤成纤维细胞并扩大培养，以提取的病毒基因组作为模板，用引物ORF121-F/R(SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:20)进行PCR扩增鉴定。PCR反应体系同1.2.1.1。
PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸110s，35个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。取阳性PCR产物进行测序分析。将PCR阳性重组病毒进行5代噬斑克隆纯化，获得ORFV CAP/EGFP和ORFV CAP重组病毒，扩大培养后于-80℃保存。
PCR扩增鉴定的结果为：无ORF121基因PCR产物，证明成功敲除ORF121基因。
1.2.3重组病毒生物学特性分析
1.2.3.1一步生长曲线绘制
将山羊皮肤成纤维细胞接种至12孔板，待细胞长至单层，将培养液弃去，更换无血清DMEM营养液；每孔按0.01MOI分别接种重组病毒ORFV CAP和羊口疮病毒HT-01株。置于培养箱中孵育2h，弃去上清，PBS洗三次，每孔中加入1mL含2％FBS的DMEM维持液。于接种后0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h分别收集上清培养液和细胞冻融裂解液，各吸取500μL，接种于汇合度为80％的羊成纤维细胞。感染2h后加入37℃含有2％FBS和1％低熔点琼脂糖的MEM，3d后以10％甲醛室温固定，4h后PBS冲洗3次并加入8％结晶紫染色，30min后洗涤晾干，记录噬斑数并按下式计算病毒滴度(virus plaque forming unit,PFU/mL)测定病毒滴度，软件GraphPad Prism5.0绘制病毒一步生长曲线。如图5和图6所示。
病毒滴度(PFU/mL)＝(每孔平均噬斑个数×病毒稀释倍数)/每孔病毒接种量(mL)
实施例2重组羊口疮病毒CAP蛋白表达检测
2.1实验材料与试剂
硝酸纤维素膜(NC膜)购自Solarbio(北京)；TEMED、APS、Glycine均购自SIGMA(中国)；BSA、Tris、SDS均购自Coolaber(北京)；甲醇、Nacl均购自西陇科学(广东)；Tween-20购自Beyotime；4×SDS-PAGE Stacking Gel Buffer、SDS-PAGE Separating Gel Buffer(4×)均购自(CWBIO)；一抗二抗购自ABclonal；30％Acr-Bis购自biosharp(北京)。
2.2蛋白提取
PBS清洗重组病毒感染的细胞，加入1mL Trizol充分裂解细胞，室温静置5min。将获得的细胞裂解液转移至离心管中，在匀浆器中匀浆30s，加入200μL三氯甲烷，混匀，置于室温静置5min；4℃，12000rpm离心10min。弃上清，剩下的中间层及有机层留下用来提取蛋白质。在有机相中加入300μL 100％乙醇，颠倒混匀，室温放置2-3min，4℃,12000rpm，离心5min，取上清液。加入1.5mL异丙醇，于室温放置10min，4℃,12000rpm，离心10min，再弃去上清。用2mL含0.3M盐酸胍的95％乙醇洗涤蛋白质三次。每次洗涤都需要室温放置20min，4℃，12000rpm离心5min。洗涤三次后，加入2mL无水乙醇悬浮蛋白沉淀，室温放置20min，倒掉乙醇废液。将蛋白质沉淀晾干5-10min，加入1％SDS溶液，50℃保温一段时间，直到蛋白质完全溶解，-20℃保存。
2.3Western-blot
用SDS-PAGE预制胶根据说明书配制10％的分离胶和5％的浓缩胶，用2.2提取的蛋白点样，150V，60min电泳。切滤纸和PVDF膜，并浸泡于转膜液中。按海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵顺序排列装好后，放置在转膜电泳槽中，冰水浴120V转膜1h。转膜后，1×TBST洗PVDF膜10min，用含有5％BSA的TBST封闭液封闭过夜。将封闭好的PVDF膜置于稀释的一抗中，室温孵育1h。1×TBST洗涤一抗(10min×3次，摇床)，再用稀释后的二抗室温孵育1h，结束后1×TBST(10min×3次，摇床)洗涤二抗。避光染色5min。曝光显影。结果如图7所示。
如图7所示，本实施例成功构建表达猪圆环病毒2型病毒CAP蛋白的重组羊口疮病毒。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。
序列表
<110> 内蒙古元山生物科技有限公司
<120> 一种表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒，其制备方法及应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccgcaccg cgagcccggg tttcggtcg 29
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaacaaaccc gcgaccgaaa ccccgggctc gc 32
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccgcaccg ccacgtcggt gaagcactcg c 31
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacaaaccc gcgagtgctt caccgacgtg gc 32
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccggtcgc cctcgaactt cacct 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacaggtga agttcgaggg cgacc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccggttgg ggtctttgct caggg 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaacccctga gcaaagaccc caacc 25
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctagctagct agggcaagca gttggatacg g 31
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagaattcgc aagcttggtt gtgtgggcca cagagttgag 40
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
attcttatgc ggccgcggag cactgctcgg aggagtgct 39
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgctctagag caatcatgcg cagcgacgac atcatc 36
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcggatccg cggcaaaaaa gaaaaagga 29
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
attcttatgc ggccgcgcaa ctagaaggca cag 33
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
catgccatgg catgatgacg tatccaagga ggcgtttc 38
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgcggatccg cgttaagggt taagtggggg gtctttaag 39
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cccaagcttg gggacattga ttattgacta gttatta 37
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
catgccatgg catgaatcag acagaaagcg ccgccgctg 39
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggcaagcagt tggatacgg 19
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atcatgcgca gcgacgacat catc 24

Claims (10)

1.一种表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒，其特征在于，所述重组羊口疮病毒采用ORF121基因缺失的羊口疮病毒表达猪圆环病毒2型CAP蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组羊口疮病毒，所述缺失为采用CRISPR/Cas9技术敲除，具体包括以下步骤：
(1)扩增羊口疮病毒ORF121基因的上游同源臂和下游同源臂、CAP基因和CMV基因，将所述上游同源臂和下游同源臂的基因片段、所述CAP基因的基因片段、所述CMV基因的基因片段连入载体，获得表达载体1；
(2)扩增EGFP基因，并将所述EGFP基因的基因片段连入所述表达载体1，获得表达载体2；
(3)设计用于特异性靶向敲除ORF121基因的sgRNA，将其与载体连接，转化提取得到ORF121-CRISPR/Cas9载体1；
(4)设计用于特异性靶向敲除EGFP基因的sgRNA，将其与载体连接，转化提取得到EGFP-CRISPR/Cas9载体2；
(5)将ORF121-CRISPR/Cas9载体1与表达载体2混合转染，得到转染细胞；
(6)将所述转染细胞感染羊口疮病毒，得到敲除羊口疮病毒ORF121基因并表达EGFP基因的羊口疮病毒基因重组病毒；
(7)将所述EGFP-CRISPR/Cas9载体2与所述表达载体1混合转染，得到转染细胞；
(8)将所述转染细胞感染所述羊口疮病毒基因重组病毒，得到表达外源蛋白的重组羊口疮病毒。
3.如权利要求1或2所述的表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括以下步骤：
(1)以羊口疮病毒HT-01株基因组为模板，进行扩增得到ORF121基因上游同源臂和下游同源臂片段；
(2)以PCAGG-EGFP质粒为模板，扩增得到EGFP基因片段；
(3)以猪圆环病毒2型基因组为模板，扩增得到CAP基因片段；
(4)以pcDNA3.1为模板，扩增得到CMV基因片段；
(5)将所述ORF121基因上游同源臂和下游同源臂片段、所述CMV基因片段和所述CAP基因片段分别双酶切，分别连入pcDNA3.1载体，获得表达载体pcDNA-ORF121；
(6)将所述EGFP基因片段连入所述表达载体pcDNA-ORF121，获得表达载体pcDNA-ORF121-EGFP；
(7)设计互补引物ORF121-sgRNA1、ORF121-sgRNA2、EGFP-sgRNA1、EGFP-sgRNA2，经变性、退火后获得双链sgRNA；所述ORF121-sgRNA1，ORF121-sgRNA2、EGFP-sgRNA1、EGFP-sgRNA2序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8所示；
(8)酶切pSpCas9-2A-Puro载体，将ORF121-sgRNA1和ORF121-sgRNA2，EGFP-sgRNA1和EGFP-sgRNA 2分别连入酶切后的所述pSpCas9-2A-Puro载体，连接产物经转化、提取质粒后，得到CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA1、CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA2、CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA 1、CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA 2；
(9)将所述CRISPR-Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA1、所述CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-ORF121-sgRNA2和表达载体pcDNA-ORF121-EGFP共转染VERO细胞，接种羊口疮病毒，得到重组病毒ORFV CAP/EGFP；
(10)将所述CRISPR-Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA1、所述CRISPR/Cas9载体pSpCas9-2A-Puro-EGFP-sgRNA2和表达载体pcDNA-ORF121共转染VERO细胞，接种所述重组病毒ORFV CAP/EGFP，得到所述表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，利用ORF121基因上游同源臂引物对和下游同源臂引物对进行扩增，所述ORF121基因上游同源臂引物对和下游同源臂引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，利用EGFP上下游引物进行扩增，所述EGFP上下游引物序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，利用CAP基因上下游引物进行扩增，所述CAP基因上下游引物序列如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16所示。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，利用CMV基因上下游引物进行扩增，所述CMV基因上下游引物序列如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，
在步骤(5)中，所述ORF121基因上下游同源臂用Nhe1、HindⅢ、NotI、Xba1进行双酶切，所述CMV基因片段用HindIII、NcoI进行双酶切，所述CAP基因片段用NcoI、BamH I进行双酶切；
在步骤(6)中，利用BamH I、NotI内切酶酶切pcDNA-ORF121；
在步骤(9)中，用BbsI酶切pSpCas9-2A-Puro载体。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
在步骤(9)中，24h后接种1MOI羊口疮病毒，待出现病变的细胞超过80％后，收集包含重组病毒ORFV CAP/EGFP的上清，得到重组病毒ORFV CAP/EGFP；
在步骤(10)中，24h后接种1MOI所述重组病毒ORFV CAP/EGFP，待出现病变的细胞超过80％后，收集包含重组病毒ORFV CAP的上清，得到所述表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒。
10.如权利要求1所述的表达猪圆环病毒2型CAP蛋白的重组羊口疮病毒在猪圆环病毒2型疫苗制备中的应用。
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