CN117511968B - 表达SARS-CoV-2的S、E和M蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

表达SARS-CoV-2的S、E和M蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病毒技术领域，具体涉及表达SARS‑CoV‑2的S、E和M蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法和应用。本发明提供的重组核酸分子、重组金丝雀痘病毒能够显著提高SARS‑CoV‑2的S基因、E基因和M基因的表达水平，实现S基因、E基因和M基因的同时高效稳定表达，同时具有较高的病毒样颗粒产量。本发明的重组金丝雀痘病毒及其产生的病毒样颗粒具有较好的免疫原性，能够诱导机体产生高水平的中和抗体，实现较好的免疫效果，为SARS‑CoV‑2感染的免疫预防提供了候选疫苗株。

Description

表达SARS-CoV-2的S、E和M蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建 方法和应用
技术领域
本发明涉及病毒技术领域，尤其涉及表达SARS-CoV-2的S、E和M蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法和应用。
背景技术
随着科学界对新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,SARS-CoV-2)的结构、功能和致病过程的深入研究以及针对SARS-CoV-2的治疗药物和单克隆抗体的开发，对SARS-CoV-2的治疗方法和治疗效果在不断改善，但仍存在治疗效果仍有待提升、成本较高以及存在一定副作用的问题。因此疫苗接种仍是预防和控制SARS-CoV-2最经济、有效的手段。病毒的不断突变使其具有更强的免疫逃逸能力。目前的报道表明，即使疫苗接种者体内存在高水平的中和抗体，面对受关注的变异株(VOCs)仍有较高的突破性感染的风险，提示诱导体液免疫的疫苗可能不足以对SARS-CoV-2实现有效的保护性免疫。
金丝雀痘病毒(Canarypox virus,CNPV)是痘病毒科(Poxviridae)、脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae,ChPV)、禽痘病毒属(Avipoxvirus,APV)的重要成员之一，其所在的禽痘病毒属是唯一仅感染非哺乳动物宿主的病毒属，具有较高的种属特异性与安全性。以金丝雀痘病毒作为载体生产的重组疫苗不会产生病毒载体的扩散，包括对非接种物和环境的影响。目前已构建了多种金丝雀痘病毒载体疫苗，如马流感病毒(equineinfluenza virus,EIV)，犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)，麻疹病毒(measlesvirus,MV)，尼帕病毒(Nipah virus,NiV)，艾滋病毒(human immunodeficiency virustype 1,HIV-1)，非洲马病病毒4型(African horse sickness virus type 4,AHSV-4)，蓝舌病毒17型(bluetongue virus serotype 17,BTV-17)，丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus,HCV)，巨细胞病毒(cytomelovirus,CMV)，狂犬病毒(rabies virus)和婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)等。与禽痘病毒作为载体相比，在诱导保护性免疫方面，金丝雀痘病毒比其高100倍。与现有商品化疫苗相比金丝雀痘病毒载体疫苗也具有明显优势。金丝雀痘病毒载体相比于腺病毒载体不存在预存抗体的干扰，且有文献表明，金丝雀痘病毒多次免疫不会影响免疫原性。相比于灭活和亚单位疫苗，金丝雀痘病毒能够诱导较高的细胞免疫，且无需添加佐剂。相比于核酸疫苗，金丝雀痘病毒在细胞质中复制，不存在基因组整合的风险，且在哺乳动物细胞中仅引发一过性感染，安全性更高。金丝雀痘病毒经过改造可以表达外源基因编码的抗原，进而诱导宿主产生持久的细胞免疫和体液免疫应答。因此，开发SARS-CoV-2重组CNPV载体疫苗进行新型冠状病毒感染的免疫预防具有重要意义。
发明内容
本发明提供表达SARS-CoV-2的S、E和M蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法和应用。
本发明以金丝雀痘病毒作为载体开发SARS-CoV-2的载体疫苗，构建表达SARS-CoV-2的S、E和M蛋白的重组金丝雀痘病毒，以期诱导高水平的针对SARS-CoV-2的细胞免疫和体液免疫，提高SARS-CoV-2疫苗的免疫效果。为保证SARS-CoV-2的S、E和M蛋白的高效表达，本发明首先对上述蛋白的启动子和表达盒结构进行了优化，显著提高了SARS-CoV-2的S、E和M蛋白的表达水平，进而更有利于提高重组病毒的免疫原性。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供重组核酸分子，所述重组核酸分子包含重组金丝雀痘病毒基因组；
所述重组金丝雀痘病毒基因组为在金丝雀痘病毒基因组的C6编码区整合SARS-CoV-2表达盒得到；
其中，所述SARS-CoV-2表达盒包含第一表达盒和第二表达盒；
所述第一表达盒包含桑灯蛾昆虫痘病毒42K启动子和SARS-CoV-2的S基因；
所述第二表达盒包含牛痘病毒H6启动子以及SARS-CoV-2的E基因和M基因。
上述第二表达盒中，SARS-CoV-2的E基因和M基因共用牛痘病毒H6启动子驱动转录。
本发明发现，在单一位点插入大片段外源基因会导致表达量的降低，与将S基因、E基因和M基因置于同一启动子下转录并添加IRES等独立起始翻译序列相比，各基因使用各自独立的启动子驱动转录的表达效果更优，然而，令人意外的是，与S基因、E基因和M基因均使用各自独立的启动子驱动转录相比，将S基因使用独立的启动子驱动转录，将E基因和M基因使用共同的启动子驱动转录的表达效果明显更优，而且更有利于病毒样颗粒的形成，能够显著提高重组病毒的病毒样颗粒的产量，且重组病毒作为免疫原具有更优的免疫效果。在上述发现的基础上，本发明进一步对启动子的选择进行了优化并发现，在众多的可选启动子中，第一表达盒和第二表达盒分别使用42K启动子和H6启动子驱动转录能够显著提高S基因、E基因和M基因的表达水平，保证其在重组病毒中高效稳定表达，同时更有利于病毒样颗粒的形成，能够显著提高重组病毒的病毒样颗粒的产量，且重组病毒作为免疫原具有更优的免疫效果。
优选地，所述第二表达盒还包含位于E基因和M基因之间的IRES序列。
IRES序列为自剪切自招募核糖体的序列，在共用启动子的E基因和M基因之间插入IRES序列能够使得两基因单独翻译，保证两基因编码蛋白的正确翻译和折叠。
优选地，所述第一表达盒与所述第二表达盒的转录方向相反。
本发明在研发过程中意外地发现，将S基因的表达盒与E基因和M基因的表达盒的方向设置为相反方向(即第一表达盒和第二表达盒头对头、直接或间接相连)能够更有利于病毒样颗粒的形成，显著提高重组病毒的病毒样颗粒的产量，同时保证SARS-CoV-2基因的高表达水平，重组病毒作为免疫原具有更优的免疫效果。
为实现筛选过程可视化进而方便筛选，本发明在SARS-CoV-2表达盒中还引入了标记蛋白。引入标记蛋白使重组病毒的筛选过程可视化，经过3-5轮病毒噬斑筛选，即可获得纯化的重组病毒，显著提高了获得重组病毒的效率。
优选地，在所述第一表达盒与所述第二表达盒之间还包含第三表达盒；所述第三表达盒包含启动子和标记蛋白编码基因。
优选地，所述第三表达盒的转录方向与所述第二表达盒相同。
优选地，所述第三表达盒的启动子为桑灯蛾昆虫痘病毒42K启动子，和/或，所述标记蛋白为荧光标记蛋白。
对于荧光标记蛋白的种类，本发明没有特殊限制。可选地，所述荧光标记蛋白选自红色荧光蛋白mCherry、绿色荧光蛋白EGFP或黄色荧光蛋白YFP。
在本发明的一些实施方式中，所述SARS-CoV-2表达盒的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明经实验验证，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的SARS-CoV-2表达盒能够保证SARS-CoV-2的S基因、E基因和M基因的高效稳定表达，同时具有较高的病毒样颗粒产量以及较好的重组病毒免疫效果。
在本发明的一些实施方式中，所述重组核酸分子由所述重组金丝雀痘病毒基因组组成。
本发明中，所述SARS-CoV-2包括但不限于Wuhan01株、阿尔法株、贝塔株、德尔塔株、奥密克戎及其分支毒株等。不同SARS-CoV-2的S蛋白、E蛋白、M蛋白及其编码基因的序列可能存在差异。本领域技术人员可通过数据库、基因测序等途径获得SARS-CoV-2野生株及其变异株的S蛋白、M蛋白、E蛋白及其编码基因的序列。
在本发明的一些实施方式中，所述金丝雀痘病毒分离自商品化疫苗Ferret Distemper。
在本发明的一些实施方式中，所述重组金丝雀痘病毒基因组为将分离自商品化疫苗Ferret Distemper的金丝雀痘病毒基因组C6编码区的犬瘟热基因表达盒替换为SARS-CoV-2表达盒得到。
第二方面，本发明提供生物材料，所述生物材料包含以上所述的重组核酸分子；所述生物材料为载体或宿主细胞。
上述载体优选为质粒载体，包括但不限于能够在细菌或哺乳动物中复制的质粒。
上述宿主细胞包括微生物细胞或动物细胞。对于宿主细胞的种类，本发明没有特殊限制，其中，微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母等；动物细胞包括但不限于鸡胚成纤维细胞(CEF细胞、DF-1细胞)等。
第三方面，本发明提供重组金丝雀痘病毒，所述重组金丝雀痘病毒的基因组为以上所述的重组核酸分子。
优选地，所述重组金丝雀痘病毒通过在金丝雀痘病毒基因组的C6编码区整合SARS-CoV-2表达盒得到，所述SARS-CoV-2表达盒为以上任一所述的SARS-CoV-2表达盒。
第四方面，本发明提供以上所述的重组金丝雀痘病毒的构建方法，所述方法包括：利用CRISPR/Cas9技术在金丝雀痘病毒基因组的C6编码区整合SARS-CoV-2表达盒。
目前传统的重组痘病毒构建方法的同源重组效率低，子代病毒中重组病毒所占比例不足0.1％，不易筛选获得重组病毒。CRISPR/Cas9作为一种基因编辑工具，具有高效、精准、廉价、易于使用等特点，可以增加病毒在复制过程中与同源片段的重组效率，进而快速构建重组病毒。因此，本发明优选采用CRISPR/Cas9技术在金丝雀痘病毒基因组中的C6编码区插入SARS-CoV-2表达盒。相较于传统的同源重组方法，本发明的构建方法提高了构建重组病毒的成功率。
具体地，所述方法包括：先将包含Cas9和gRNA的质粒导入金丝雀痘病毒，再将包含SARS-CoV-2表达盒以及C6编码区上下游同源臂的质粒导入金丝雀痘病毒，经筛选得到在金丝雀痘病毒基因组的C6编码区整合SARS-CoV-2表达盒的重组金丝雀痘病毒。
以上所述的包含SARS-CoV-2表达盒以及上下游同源臂的质粒作为转移修复载体，其中，上下游同源臂为C6编码区的上游同源臂和下游同源臂。
在本发明的一些实施方式中，所述质粒为pCAGGS质粒，所述第一表达盒位于NotⅠ酶切位点之间；所述第二表达盒位于MssⅠ与CpoⅠ酶切位点之间。
在本发明的一些实施方式中，所述金丝雀痘病毒分离自商品化疫苗Ferret Distemper。
第五方面，本发明提供以上所述的重组核酸分子或所述生物材料或所述重组金丝雀痘病毒的以下任一种应用：
(1)在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染或由SARS-CoV-2感染引起疾病的药物中的应用；
(2)在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染或由SARS-CoV-2感染引起疾病的疫苗中的应用；
(3)在制备SARS-CoV-2抗体中的应用；
(4)在制备用于诊断SARS-CoV-2感染或由SARS-CoV-2感染引起疾病的试剂中的应用；
(5)在制备用于检测SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的中和抗体在样品中存在或其水平的试剂中的应用。
上述(1)中，所述药物优选为SARS-CoV-2的治疗性药物。
上述(2)中，利用本发明提供的重组金丝雀痘病毒作为免疫原可制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染或由SARS-CoV-2感染引起疾病的疫苗。
上述(3)中，利用本发明提供的重组金丝雀痘病毒作为免疫原可制备结合SARS-CoV-2的特异性抗体，包括但不限于用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染或由SARS-CoV-2感染引起疾病的中和抗体。
上述(4)、(5)中，可通过检测血清等样本中的中和抗体是否存在和/或其水平诊断是否感染SARS-CoV-2或由SARS-CoV-2感染引起的疾病。
上述应用中，由SARS-CoV-2感染引起的疾病包括新型冠状病毒感染。
第六方面，本发明提供一种SARS-CoV-2疫苗，所述疫苗包含以上所述的重组金丝雀痘病毒或由所述重组金丝雀痘病毒制备得到。
上述SARS-CoV-2疫苗可仅以所述重组金丝雀痘病毒或其产生的病毒样颗粒作为免疫原，或者还包含其它免疫原。
上述SARS-CoV-2疫苗还可包含疫苗领域允许的辅料和/或佐剂。
第七方面，本发明提供一种检测试剂，所述检测试剂包含以上所述的重组金丝雀痘病毒。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供的重组核酸分子、重组金丝雀痘病毒能够显著提高SARS-CoV-2的S基因、E基因和M基因的表达水平，实现S基因、E基因和M基因的同时高效、稳定表达，并在感染细胞时形成病毒样颗粒，同时具有较高的病毒样颗粒产量。本发明的重组金丝雀痘病毒及其产生的病毒样颗粒具有较好的免疫原性，能够诱导机体产生高水平的中和抗体，实现较好的免疫效果，为SARS-CoV-2感染免疫预防提供候选疫苗株，为SARS-CoV-2疫苗开发提供了新的方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的重组金丝雀痘病病毒的构建流程示意图。
图2为本发明实施例2中转移修复载体的结构示意图，其中42KP代表昆虫痘病毒42K启动子，FRT代表Flp基因编辑位点，EGFP代表加强型绿色荧光基团。
图3为本发明实施例4中重组金丝雀痘病毒的绿色荧光蛋白表达检测，其中黑色为背景颜色，颜色较浅的区域为绿色荧光区域。
图4为本发明实施例4中重组金丝雀痘病毒表达的SARS-CoV-2S、E和M蛋白的Western Blot鉴定结果，其中，左侧图片为SARS-CoV-2S蛋白，中间图片为SARS-CoV-2M蛋白，右侧图片为SARS-CoV-2E蛋白。
图5为本发明实施例4中重组金丝雀痘病毒感染表达病毒样颗粒的电镜观察结果，其中，黑色箭头为SARS-CoV-2病毒样颗粒，灰色箭头为金丝雀痘病毒。
图6和图7为本发明实施例4中重组金丝雀痘病毒形成VLPs的浓度检测结果，其中，Single promoter代表重组金丝雀痘病毒1，Dual promoter代表重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM，Triple promoter代表重组金丝雀痘病毒2，Same direction代表表重组金丝雀痘病毒3，Opposite direction代表重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM。
图8为本发明实施例4中Balb/c小鼠的免疫方案。
图9为本发明实施例4中重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM，(即ALVAC-SEM)免疫6-8周龄Balb/c小鼠的中和抗体检测结果，其中，MOCK为空白对照。
图10和图11为本发明实施例4中重组金丝雀痘病毒免疫6-8周龄Balb/c小鼠的中和抗体检测结果，其中，Single promoter代表重组金丝雀痘病毒1，Dual promoter代表重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM，Triple promoter代表重组金丝雀痘病毒2，Same direction代表表重组金丝雀痘病毒3，Opposite direction代表重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM。
图12为本发明实施例4中重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM(即ALVAC-SEM)与表达SARS-CoV-2S基因的重组金丝雀痘病毒(ALVAC-S)免疫6-8周龄Balb/c小鼠的中和抗体检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中使用的实验材料如下：DF-1细胞为鸡胚成纤维细胞系(ATCC ID：CRL-12203)；CEF细胞为分离自9-11日龄SPF鸡胚的原代鸡胚成纤维细胞；转移修复载体骨架质粒为pCAGGS；T4 DNA Polymerase购自NEB(M0203L)；DH5α感受态细胞(Code:No 9057)、核酸分子量Marker DL10000/DL5000/DL2000(Code:No 3584A/3428A/3427A)均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；禽Cas9/gRNA构建试剂盒购自北京唯尚立德生物科技公司(VK001-08)；质粒小提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司(CW2106)；DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA(D2500-01)；ClonExpress II One Step Cloning Kit、2×Phanta MaxMaster Mix(Dye Plus)购自诺唯赞公司，超保真DNA聚合酶购自NEB公司；LipofectamineTMCRISPRMAXTMCas9转染试剂、限制性内切酶CpoI(RsrII)、限制性内切酶MssI、限制性内切酶NotI、双抗(青霉素-链霉素)、DMEM粉末购自Thermo Scientific公司，病毒DNA提取试剂盒购自天根公司，West Dura持久性化学发光底物购自Thermo Scientific公司，Anti-SARS-CoV-2S antibody购自义翘神州公司、Anti-SARS-CoV-2E antibody、Mantibody购自Cell Signaling Technology公司、Goat Anti-Rabbit(HRP)购自Bioworld公司。低熔点琼脂糖购自LONZA(50100)；DMEM培养液购自Corning(10-013-CVR)；胎牛血清(FBS)购自BI(04-001-1A)。
以下实施例所使用的金丝雀痘病毒(ALVAC)分离自商品化疫苗FerretDistemper。
本发明中，所述重组金丝雀痘病毒的构建方法具体如下(图1)：
S1、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使金丝雀痘病毒基因组C6编码区发生断裂；利用金丝雀痘病毒基因组自身的修复机制，向金丝雀痘病毒复制的细胞中提供包含同源重组模板的转移修复载体，使得病毒在复制的过程中，通过与转移修复载体中包含的同源片段发生同源重组完成基因链的修复，并将SARS-CoV-2的S、E和M基因和荧光标记蛋白基因在金丝雀痘病毒基因组C6编码区的断裂位置引入金丝雀痘病毒基因组中，得到重组金丝雀痘病毒；
所述包含同源重组模板的转移修复载体中，所述同源重组模板以pCAGGS为载体，主要由上游同源臂C6L、带有昆虫痘病毒42K启动子的SARS-CoV-2S基因、带有牛痘病毒H6启动子的SARS-CoV-2E基因、带有IRES序列的SARS-CoV-2M基因和带有昆虫痘病毒42K启动子的荧光标记蛋白基因、下游同源臂C6R构成；其中，上游同源臂C6L的序列如SEQ ID NO.2所示，长度为482bp，位于C6编码区上游。带有昆虫痘病毒42K启动子的荧光标记蛋白EGFP基因的序列如SEQ ID NO.3所示，其中昆虫痘病毒42K启动子的长度为32bp，荧光标记蛋白EGFP基因的长度为720bp，其余是酶切位点以及FRT序列。牛痘病毒H6启动子的序列如SEQ IDNO.4所示，长度为124bp，位于多克隆酶切位点上游。下游同源臂C6R的序列如SEQ ID NO.5所示，长度为500bp，位于C6编码区下游。
S2、利用噬斑纯化技术，将步骤S1中收获的重组金丝雀痘病毒进行多轮噬斑纯化筛选，获得纯净的重组金丝雀痘病毒，即为可以同时表达SARS-CoV-2S、E和M蛋白以及荧光标记蛋白的重组金丝雀痘病毒。
本发明通过优化SARS-CoV-2的S、E和M基因表达盒的结构、组成和方向，获得了能够同时高效串联表达S、E和M蛋白的重组金丝雀痘病毒，其在感染细胞时能够高效形成病毒样颗粒，具有较高的病毒样颗粒产量。与单独表达SARS-CoV-2S基因的重组金丝雀痘病毒相比，本发明的重组病毒的免疫原性极大地提高，因此可为SARS-CoV-2感染的免疫预防提供候选疫苗株，应用于疫苗免疫时可以发挥较好的免疫效果。
本发明提供的表达SARS-CoV-2S、E和M蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法依托于CRISPR/Cas9基因编辑技术，将其应用于对双链DNA病毒——金丝雀痘病毒的基因组编辑。该方法相较于传统的同源重组方法不仅提高了构建重组病毒的成功率，同时引入的荧光标记蛋白使病毒的筛选过程可视化，经过3-5轮病毒噬斑筛选，即可获得纯化的重组病毒，缩短了获得重组病毒的时间。
实施例1Cas9和gRNA共表达质粒的构建
1、针对金丝雀痘病毒的C6编码区，共设计两条小向导RNA，将其分别命名为小向导RNA C6-sgRNA-1以及小向导RNA C6-sgRNA-2。
其中，小向导RNA C6-sgRNA-1的引物序列如下：
C6-sgRNA-1-F：CTCTTAGTCGCCTAACCGTCTCAAGGATC；
C6-sgRNA-1-R：CTCTAAAACGATCCTTGAGACGGTTAGGC；
上述C6-sgRNA-1-F中的序列GCCTAACCGTCTCAAGGATC、C6-sgRNA-R中的序列GATCCTTGAGACGGTTAGGC为C6-sgRNA的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒(ALVAC)基因组C6编码区的第383-402位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-1的引导下可将ALVAC基因组在C6编码区的第399-400位碱基之间切断；
小向导RNA C6-sgRNA-2的引物序列如下：
C6-sgRNA-2-F：5’-CTCTTAGTCGCCCACTTTTGAACTCCGGA-3’；
C6-sgRNA-2-R：5’-CTCTAAAACTCCGGAGTTCAAAAGTGGGC-3’；
上述C6-sgRNA-2-F中的序列GCCCACTTTTGAACTCCGGA、C6-sgRNA-2-R中的序列TCCGGAGTTCAAAAGTGGGC为C6-sgRNA-2的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C6编码区的第3912-3931位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-2的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C6编码区的第3928-3929位碱基之间切断。
2、oligo二聚体的形成
将C6-sgRNA-1-F 1μL、C6-sgRNA-1-R 1μL、Solution1 5μL、ddH2O 3μL加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃下保持3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后再在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体。
C6-sgRNA-2的oligo二聚体的形成的方法同上。
3、将oligo二聚体插入到Cas9/gRNA载体质粒中：将ddH2O、步骤2中获得的oligo二聚体、家禽Cas9/gRNA构建试剂盒中提供的线性化载体Cas9/gRNA混合，充分混合后，室温(25℃)静置5min。
4、转化：
取5μL步骤3中得到的最终产物加入到刚解冻的50μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min后，直接涂于氨苄抗性的平板，平板放置于37℃温箱培养12h左右，观察菌落生长情况；然后挑取5-10个单菌落，接种至4mL无菌氨苄抗性LB培养液中，37℃摇床摇菌12h左右，按康为世纪质粒小提试剂盒说明书提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，送至测序公司进行测序鉴定，鉴定引物为sqprimer：TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG。鉴定正确的载体质粒分别命名为Cas9-C6gRNA-1和Cas9-C6gRNA-2。Cas9-C6gRNA-1、Cas9-C6gRNA-2载体质粒能够同时通过pCAG启动表达Cas9蛋白以及家禽的U6启动子表达gRNA，实现利用CRISPR/Cas9技术进行目标基因的敲除和编辑。
实施例2转移修复载体的构建
1、利用pUC57载体质粒合成包含上游同源臂C6L、下游同源臂C6R、42k启动子、荧光蛋白基因EGFP、H6启动子、多克隆位点的基因的载体质粒，载体质粒命名为pUC57-C6-H6。
2、将合成的C6-H6基因片段用SacⅠ/BgIII双酶切从步骤1中的pGH-C6-H6载体质粒上消化并回收：
酶切体系包括：pGH-C6-H6载体质粒5μg、SacⅠ5μL、BgIII5μL、10×buffer 5μL、ddH2O补足至50μL；置于37℃，酶切1h，琼脂糖凝胶电泳回收C6-H6片段；
3、用SacⅠ/BgIII双酶切消化并回收线性化pCAGGS载体质粒；酶切体系包括：pCAGGS载体质粒5μg、SacⅠ5μL、BgIII5μL、10×buffer 5μL，用ddH2O补足至50μL；
4、将步骤2中回收的C6-H6片段连接至步骤3得到的线性化pCAGGS载体；连接反应体系为：线性化pCAGGS载体2μL、C6-H6片段6μL、T4连接酶1μL、T4连接酶buffer 1μL；连接条件为25℃下反应2h；
5、将步骤4最终的连接产物进行转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；酶切及测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C6-H6，-20℃下保存待用；
6、合成用于构建包含SARS-CoV-2S、E和M蛋白基因的质粒的引物，引物序列如下所示：
SARS-CoV-2-S(NotI)-F：
5’-AAACAGCTGGGGCCCGCGGCCGCGCCACCATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGC-3’；
SARS-CoV-2-S(NotI)-R：
5’-CCCGATCCATAAAAATCAGCGGCCGCTTATGTGTAATGTAATTTGACTCC-3’；
SARS-CoV-2-EM(MssI)-F：
5’-GTATCGTACCGCGGGTTTAAACGCCACCATGTACTCATTCGTTTCGG-3’；
SARS-CoV-2-EM(CpoI)-R：
5’CCGGGATAAAAATTACGGTCCGTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACTGTACAAGCAAAGCAATATTG-3’；
7、PCR扩增SARS-CoV-2S基因以及SARS-CoV-2EM片段
PCR反应体系包括：5×Phusion HF缓冲液10μL、10mM dNTPs 1μL、SARS-CoV-2S(NotI)-F 2.5μL、SARS-CoV-2S(NotI)-R 2.5μL、Phusion DNA聚合酶0.5μL、SARS-CoV-2质粒2.5μL、ddH2O补至50μL。
PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性5s，退火55℃10s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸10min。
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收SARS-CoV-2S片段。
参考上述方法扩增得到SARS-CoV-2EM片段，其中含有SARS-CoV-2E基因、M基因以及位于E基因和M基因之间的IRES序列。
8、用NotI酶切消化步骤5构建的质粒pCA-C6-H6，酶切体系包括：pCA-C6-H6 5μg、NotI 10μL、10×buffer 5μL，用ddH2O补足至总体积为50μL；置于37℃酶切1h，进行琼脂糖凝胶电泳，回收pCA-C6-H6线性化质粒。
9、利用无缝克隆将SARS-CoV-2S片段连接至线性化质粒pCA-C6-H6，连接体系包括：5×CEIIbuffer 4μL、线性化载体2μL、插入片段1μL、ExnaseII2μL、ddH2O补至20μL；连接条件为37℃反应30min，冰上放置3min后进行转化，然后挑取细菌单克隆进行质粒提取；测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C6-H6-SARS-CoV-2-S。
10、用MssⅠ/CpoⅠ双酶切消化步骤9构建的质粒pCA-C6-H6-SARS-CoV-2S，酶切体系包括：pCA-C6-H6-SARS-CoV-2S 5μg、MssⅠ5μL、CpoⅠ5μL、10×buffer 5μL，用ddH2O补足至总体积为50μL；置于37℃酶切1h，进行琼脂糖凝胶电泳，回收pCA-C6-H6-SARS-CoV-2S线性化质粒。
11、利用无缝克隆将片段SARS-CoV-2EM连接至线性化质粒pCA-C6-H6-SARS-CoV-2S，连接体系包括：5×CEIIbuffer 4μL、线性化载体2μL、插入片段1μL、ExnaseII2μL、ddH2O补至20μL；连接条件为37℃反应30min，冰上放置3min后进行转化，然后挑取细菌单克隆进行质粒提取；测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C6-H6-SARS-CoV-2SEM，质粒图谱如图2所示，其中含有SARS-CoV-2表达盒(序列如SEQ ID NO.1所示)以及上游同源臂C6L(序列如SEQ IDNO.2所示)和下游同源臂C6R(序列如SEQ ID NO.5所示)。
实施例3重组金丝雀痘病毒的构建
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使金丝雀痘病毒基因组的C6编码区发生断裂；利用细胞内同源重组的基因修复机制，向细胞提供实施例2构建得到的质粒pCA-C6-H6-SARS-CoV-2SEM，在金丝雀痘病毒C6编码区整合含有SARS-CoV-2的S和E、M基因的表达盒。
具体过程如下：
1、将DF-1细胞铺至6孔板，24h后利用Thermo LipofectamineTM CRISPR MAXTMCas9转染Cas9-C6gRNA，37℃培养24h后接种金丝雀痘病毒，37℃吸附1h，补加细胞维持液(5％FBSDMEM)1mL，37℃继续培养2h后，继续转染pCA-C6-H6-SARS-CoV-2SEM，6h后弃去转染液，补加2mL细胞维持液，37℃继续培养72h，-80℃反复冻融三次收获重组金丝雀痘病毒。
2、利用噬斑纯化技术，将步骤1收获的重组金丝雀痘病毒接种至CEF细胞，将表达绿色荧光蛋白的噬斑接种CEF细胞，继续进行3-5轮噬斑纯化筛选，获得纯净的重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM，即获得可以同时表达SARS-CoV-2S、E和M蛋白的重组金丝雀痘病毒。
其中，噬斑纯化的具体步骤如下：
(1)将CEF细胞铺至6孔板直到长满单层；
(2)将步骤1中收获的重组金丝雀痘病毒混合后用无血清DMEM进行10倍系列稀释，分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6；
(3)吸弃6孔板中的培养液，用无血清DMEM清洗细胞2次，加入步骤(2)中稀释好的病毒液，每孔500μL；37℃吸附2h，期间将置于75℃融化的3％低熔点琼脂糖与含2％双抗(青霉素-链霉素)、4％FBS的2×DMEM按体积比1:1混合，得到半固体培养基，37℃保温待用；
(4)吸弃6孔板中的病毒液，用无血清DMEM清洗一次，之后每孔加入2mL半固体培养基，室温放置30min，待半固体培养基充分凝固后，将6孔板置于37℃5％CO2细胞培养箱培养；
(5)48-72h内观察噬斑及绿色荧光蛋白表达情况，吸取表达绿色荧光蛋白的单个噬斑吹打入500μL含1％双抗的无血清DMEM，反复冻融两次；
(6)将步骤(5)中挑取的噬斑接种至新鲜的6孔板CEF细胞，重复步骤(2)-(5)，重复进行3-5轮噬斑筛选获得纯化的重组金丝雀痘病毒，命名为ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM，即获得可以同时表达SARS-CoV-2S、E和M三种蛋白的重组金丝雀痘病毒。
作为对照，参考实施例1、2、3的方法构建以下重组金丝雀痘病毒：
1、与重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM的区别仅在于：SARS-CoV-2的S、E和M基因共用一个启动子驱动转录，使用的启动子为42K启动子，将该重组病毒命名为重组金丝雀痘病毒1。
2、与重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM的区别仅在于：SARS-CoV-2的S、E和M基因分别使用各自的启动子驱动转录，S、E和M基因使用的启动子分别为42K、H6和7.5k启动子(即在重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM基础上，在M基因前引入7.5k启动子)，将该重组病毒命名为重组金丝雀痘病毒2。
3、与重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM的区别仅在于：第一表达盒(S基因表达盒)和第二表达盒(E和M基因表达盒)的转录方向相同，将该重组病毒命名为重组金丝雀痘病毒3。
实施例4重组金丝雀痘病毒的性能评价
对实施例3构建的重组金丝雀痘病毒进行性能评价，具体如下：
1、绿色荧光蛋白表达检测
利用荧光显微镜观察重组金丝雀痘病毒的绿色荧光蛋白表达，结果如图3所示，重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM能够表达绿色荧光蛋白。
2、SARS-CoV-2S、E和M蛋白的表达检测
利用Western Blot检测重组金丝雀痘病毒表达SARS-CoV-2S、E和M蛋白的情况，结果如图4所示，重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM能够同时表达SARS-CoV-2S、E和M蛋白，且具有较高的表达水平。
3、病毒样颗粒(VLPs)的形成
将实施例3构建的重组金丝雀痘病毒感染细胞后可形成病毒样颗粒，其中，重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM形成病毒样颗粒的电镜观察结果如图5所示。
进一步地，将实施例3构建的重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM、重组金丝雀痘病毒1、2、3分别感染100mL CEF细胞，经培养60h后，反复冻融3次后收集细胞上清进行超速离心。然后将超速离心产物经过尺寸排阻色谱分离后，对VLPs进行定量检测。利用BCA蛋白浓度检测方法对形成的SARS-CoV-2VLPs进行浓度检测。结果如图6和图7所示，重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM形成VLPs的浓度显著高于重组金丝雀痘病毒1和2(图6)，表明与S、E、M基因共用同一个启动子和分别单独使用各自的启动子相比，将S、E、M基因进行分组表达，即E、M基因共用启动子表达而S基因单独使用启动子表达，形成VLPs的效率更高。
重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM形成VLPs的浓度显著高于重组金丝雀痘病毒3(图7)，表明相较于S基因表达盒与E、M基因表达盒同向连接，两个表达盒方向相反的重组病毒形成SARS-CoV-2VLPs的浓度明显更高。
综上所述，重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM应用于免疫时可以发挥其免疫效应，为SARS-CoV-2感染的免疫预防提供候选疫苗株，为SARS-CoV-2疫苗药物开发提供了新的方向。
4、免疫效果评价
将上述重组金丝雀痘病毒以106.5TCID50/只的剂量以肌肉注射方式免疫6-8周龄Balb/c小鼠，第一次免疫记为0d，第二次免疫为14d(图8)。加强免疫后(28d)收集小鼠血清，使用固定病毒稀释血清法(VSV为载体的假病毒)检测SARS-CoV-2中和抗体。
SARS-CoV-2中和抗体检测结果显示(图9)，上述重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM能够诱导强烈的免疫反应，表明重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM具有开发为新型SARS-CoV-2疫苗的潜力。
为对比SARS-CoV-2的S、E、M基因的不同表达方式的免疫效果差异，利用重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM以及重组金丝雀痘病毒1、2以上述相同方式免疫6-8周龄Balb/c小鼠，SARS-CoV-2中和抗体检测结果如图10所示，与S、E、M基因共用同一个启动子(重组金丝雀痘病毒1)和分别单独使用各自的启动子(重组金丝雀痘病毒2)相比，将S、E、M基因进行分组表达，即E、M基因共用启动子表达而S基因单独使用启动子表达(重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM)的中和抗体水平明显更高，免疫效果最优。
为对比不同S基因表达盒与E和M基因表达盒的连接方向对免疫效果的影响，利用重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM以及重组金丝雀痘病毒3以上述相同方式免疫6-8周龄Balb/c小鼠，SARS-CoV-2中和抗体检测结果如图11所示，相较于S基因表达盒与E、M基因表达盒同向连接(重组金丝雀痘病毒3)，两个表达盒方向相反的重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM的中和抗体水平明显更高，免疫效果最优。
此外，将重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM与仅表达SARS-CoV-2S基因的重组金丝雀痘病毒的免疫效果进行比较，将仅表达SARS-CoV-2S基因的重组金丝雀痘病毒以相同剂量、相同免疫方案免疫6-8周龄Balb/c小鼠，SARS-CoV-2中和抗体检测结果显示(图12)，重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-SARS-CoV-2SEM诱导的中和抗体显著高于单独表达SARS-CoV-2S基因的重组金丝雀痘病毒，表明基于本发明的重组金丝雀痘病毒的病毒样颗粒疫苗具有优异的免疫效果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (14)

1.重组核酸分子，其特征在于，所述重组核酸分子包含重组金丝雀痘病毒基因组；
所述重组金丝雀痘病毒基因组为在金丝雀痘病毒基因组的C6编码区整合SARS-CoV-2表达盒得到；
其中，所述SARS-CoV-2表达盒包含第一表达盒和第二表达盒；
所述第一表达盒包含桑灯蛾昆虫痘病毒42K启动子和SARS-CoV-2的S基因；
所述第二表达盒包含牛痘病毒H6启动子以及SARS-CoV-2的E基因和M基因。
2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其特征在于，所述第二表达盒还包含位于E基因和M基因之间的IRES序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组核酸分子，其特征在于，所述第一表达盒与所述第二表达盒的转录方向相反。
4.根据权利要求1或2所述的重组核酸分子，其特征在于，在所述第一表达盒与所述第二表达盒之间还包含第三表达盒；
所述第三表达盒包含启动子和标记蛋白编码基因。
5.根据权利要求4所述的重组核酸分子，其特征在于，所述第三表达盒的转录方向与所述第二表达盒相同。
6.根据权利要求4所述的重组核酸分子，其特征在于，所述第三表达盒的启动子为桑灯蛾昆虫痘病毒42K启动子，和/或，所述标记蛋白为荧光标记蛋白。
7.根据权利要求1或2所述的重组核酸分子，其特征在于，所述SARS-CoV-2表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求1～7任一项所述的重组核酸分子；
所述生物材料为载体或宿主细胞。
9.重组金丝雀痘病毒，其特征在于，所述重组金丝雀痘病毒的基因组为权利要求1～7任一项所述的重组核酸分子。
10.根据权利要求9所述的重组金丝雀痘病毒，其特征在于，所述重组金丝雀痘病毒通过在金丝雀痘病毒基因组的C6编码区整合SARS-CoV-2表达盒得到，所述SARS-CoV-2表达盒如权利要求1～7任一项中所述。
11.权利要求9或10所述的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其特征在于，所述方法包括：利用CRISPR/Cas9技术在金丝雀痘病毒基因组的C6编码区整合SARS-CoV-2表达盒。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包括：先将包含Cas9和gRNA的质粒导入金丝雀痘病毒，再将包含SARS-CoV-2表达盒以及C6编码区上下游同源臂的质粒导入金丝雀痘病毒，经筛选得到在金丝雀痘病毒基因组的C6编码区整合SARS-CoV-2表达盒的重组金丝雀痘病毒。
13.权利要求1～7任一项所述的重组核酸分子或权利要求8所述的生物材料或权利要求9或10所述的重组金丝雀痘病毒的以下任一种应用：
(1)在制备用于预防SARS-CoV-2感染的药物中的应用；
(2)在制备用于预防SARS-CoV-2感染的疫苗中的应用；
(3)在制备SARS-CoV-2抗体中的应用。
14.一种SARS-CoV-2疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求9或10所述的重组金丝雀痘病毒或由权利要求9或10所述的重组金丝雀痘病毒制备得到。
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