KR102283733B1 - ＣＯＶＩＤ-19 바이러스 진단을 위한, ＳＡＲＳ-ＣｏＶ-2 포장 ＲＮＡ 표준물질, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

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배영경
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Abstract

본 발명은 COVID-19 바이러스 진단을 위한 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질을 이용한, COVID-19 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질 이의 제조방법 및 상기 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질을 이용한, COVID-19 바이러스 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법은 COVID-19 바이러스 진단 분야에서 폭 넓게 사용이 가능하다.
또한 COVID-19 바이러스 표준물질로서 신뢰성이 k=95%의 병간 균질도가 확인되었고 장기간 보존 가능성과 그 자체의 안정성이 확인되어 코로나19 바이러스 진단 및 진단키트의 위양성(가짜양성) 판정을 줄이고 신뢰성을 높이는 장점이 있다.

Description

ＣＯＶＩＤ-19 바이러스 진단을 위한, ＳＡＲＳ-ＣｏＶ-2 포장 ＲＮＡ 표준물질, 이의 제조방법 및 이의 용도{SARS-CoV-2 packaged RNA reference material for COVID-19 virus diagnosis, preparation method and use thereof}
본 발명은 COVID-19 바이러스 진단을 위한 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질을 이용한, COVID-19 바이러스감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
2019년 12월에 중국 후베이성 우한시에서 바이러스 폐렴 양상의 원인미상 폐렴이 무리 지어 발생하기 시작하였다. 상기 폐렴의 원인이 신종 코로나바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)로 밝혀졌고, 세계보건기구(World Health Organization, WHO)는 이를 코로나19 바이러스(corona virus disease 2019, COVID-19)로 명명하였다. 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스로 지정된, 코로나19 바이러스, SARS-CoV-2는 외피 바이러스로, 30kb의 포지티브 센스 단일 가닥 RNA 게놈으로, SARS-CoV-2는 함께 베타 코로나 바이러스 속에 속한다. SARS-CoV-2는 양성 single-stranded RNA, 4종류의 주요 구조 단백질(S-spike, E-envelope, M-membrane, N-nucleocapsid)와 16종류의 비구조 단백질 (NSP 1-16), 5 내지 8 종류의 보조 단백질로 구성되어 있다.
상기 SARS-CoV-2의 전파를 차단하려는 노력에도 불구하고 중국 전 지역으로 감염이 확산되었을 뿐만 아니라 태국, 일본, 한국, 싱가포르, 홍콩 등 주변 아시아국가로 퍼져 나갔다. 또한 중국과 경제적 교류가 많은 이탈리아를 통해 유럽으로, 다시 전 세계로 급격히 전파되었다. 우한에서 발생한 원인미상 폐렴의 원인이 새로운 코로나바이러스로 확인된 후 채 3개월이 되기도 전인 3월 11일에 약 114개국으로 감염이 확산되었으며 4,000명 이상이 사망하였다. 이와 같이 COVID-19 바이러스가 확산됨에 따라, COVID-19 바이러스 대한 고속 진단은 전염원, 제어 전염병 발생 상황 전파를 차단하는 중요한 수단이고, 상기 COVID-19 바이러스 진단 조사의 정확성 요구는 더 높아지고 있다.
하지만 현재 사용되는 COVID-19 바이러스 진단 검사는 진단시약의 “프라이머” 물질이 COVID-19 바이러스의 특이 DNA에 결합, 이를 증폭시키는 핵산증폭검사 또는 실시간 유전자 증폭검사(RT-PCR) 방식인데 진단키트마다 기준 값이 달라 양성 판정이 다르게 나오는 문제가 있다. 그러므로 COVID-19 바이러스의 정확하고 정량적인 분석을 위해서는 무엇보다 분석에 사용하는 표준물질, 기준값, 정량분석 방법이 중요하다.
이와 같이, COVID-19 바이러스(SARS-CoV-2) 진단 또는 검출하는 방법에는 증폭시키는 핵산증폭검사 또는 실시간 유전자 증폭검사(RT-PCR) 방식 사용되고 있다. 하지만 COVID-19 바이러스(SARS-CoV-2)를 검출하고 정량하는데 필수적인 표준물질이 거의 실용화되지 못하고 있어, 상기 표준물질 개발이 시급하며, COVID-19 바이러스의 표준물질은 장기간 보존 가능성과 그 자체의 안정성(stability) 및 균질성(homogeneity)도 보장되어야 하는바, 검시시료에 따라 표준물질의 문제점 등을 극복할 수 있는 표준물질 개발이 요구되고 있다.
COVID-19 바이러스의 양성대조군 등이 현재 시판되고 있는 검출 키트에 포함되어 있지만, 대부분 SARS-CoV-2의 10% 이내의 유전자 특정부위가 플라스미드로 제시되는 것 일뿐, 실제 시료에서 검출되는 SARS-CoV-2와 유사하고 안전하며, SARS-CoV-2의 구조단백질 유전자인 S(spike), E(envelop), M(membrane) 및 N(nucleocapsid) 유전자와 COVID-19 바이러스의 복제 및 전사 유전자인 RdRP(RNA-dependent RNA polymerase, Nsp12) 유전자를 모두 포함하는 SARS-CoV-2의 포장 RNA 표준물질은 현재까지 알려진 바가 없다.
Shantanu Prakash et al. SARS-CoV-2 -RNA persists longer in faecal sample as compared to nasal and throat swab samples of COVID-19 patients'; an observational study Indian J Med Microbiol. 2020 Nov 16
본 발명의 목적은 COVID-19 바이러스 진단을 위한, SARS-CoV-2의 구조단백질유전자와 COVID-19 바이러스의 복제 및 전사 유전자를 모두 포함하는 재조합벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합벡터와 포장 벡터(packaging vector)를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SARS-CoV-2 포장 RNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질을 이용한 COVID-19 바이러스 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태는
재조합벡터로서, 상기 재조합벡터는 5'부터 3' 순으로,
5’ LTR(5′ LTR, 5′ long terminal repeat);
패키징 시그날(Ψ , packaging signal);
Rev-응답요소(RRE, Rev-response element);
cPPT/CTS 서열(central polypurine tract/central termination sequence);
EF1-lα 프로모터(EF-1α promoter, Human elongation factor 1 alpha promoter);
COVID-19 바이러스의 특정 유전자가 삽입된 다중클로닝 부위(MCS, Multiple cloning site);
바이러스 전사 후 조절요소 (WPRE, woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element); 및
3’ LTR (3′ LTR , 3′ long terminal repeat)를 포함하는 재조합벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 재조합벡터에 있어, 상기 재조합벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 재조합벡터에 있어, 상기 렌티바이러스 벡터는 HIV 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 재조합벡터에 있어, 상기 특정 유전자는 COVID-19 바이러스의 RdRp 유전자, S 유전자, E 유전자, M 유전자 및 N 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 재조합 벡터 일 수 있다.
본 발명의 일 양태는 상기 재조합벡터와 VSV-G 또는 Gag-Pol 유전자가 포함된 포장 벡터(packaging vector)를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태는 상기 숙주세포에서 정제 및 농축된 COVID-19 바이러스 진단을 위한, SARS-CoV-2 포장 RNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태는 COVID-19 바이러스의 특정 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터와 포장벡터를 숙주세포에 형질 감염시켜, 형질감염된 숙주세포를 제조하는 단계;
상기 형질감염된 숙주세포에서 SARS-CoV-2의 RNA를 농축하여, SARS-CoV-2 포장 RNA를 제조하는 단계;
표준물질 매트릭스(matrix)인, 인간 혈액세포주 유래 RNA와 상기 포장 RNA를 혼합하여 RNA 혼합물을 제조하는 단계; 및
상기 RNA 혼합물에서 상기 특정 유전자를 정량하는 단계를
포함하는 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법에 있어, 상기 특정유전자는 COVID-19 바이러스의 RdRp 유전자, S 유전자, E 유전자, M 유전자 및 N 유전자로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법에 있어, 상기 특정 유전자를 정량하는 단계는 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응(RT-dPCR)으로 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법에 있어, 상기 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응은 염기서열 1의 정방향 프라이머 및 염기서열 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 3의 염기서열의 프로브를 포함하는 분석용 조성물에 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법에 있어, 상기 프라이머 세트와 프로브는 S 유전자 일부 또는 전체 부위를 정량하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법에 있어, 상기 프로브는 양 말단에 리포터(Reporter) 및 소광자(Quencher)가 결합되어 있으며, 상기 리포터는 SYBR 그린(SYBR green), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, Cy3, NED, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질이고, 상기 소광자는 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, DDQ 1, DDQ, 2, MGB, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, 및 IRDye QC-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 소광 물질일 수 있다.
본 발명의 일 양태는 상기 제조방법으로 제조된 COVID-19 진단을 위한 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질을 제공하는 것이다.
상기 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질은 SARS-CoV-2의 RdRp 유전자, S 유전자, E 유전자, M 유전자 및 N 유전자를 포함하는 SARS-CoV-2의 포장 RNA 및 인간 혈액세포주 유래 RNA를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태는 상기 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질을 포함하는 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 진단용 조성물에 있어, 상기 조성물은 염기서열 1의 정방향 프라이머 및 염기서열 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 3의 염기서열의 프로브, dNTP 및 역전사효소(Reverse transcriptase)를 포함하는 PCR 반응액을 더 포함 할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 a) 상기 진단용 조성물을 준비하는 단계; b) 상기 진단용 조성물로부터 수십 만개 미세액적(droplet)을 생성하는 단계; c) 상기 생성된 미세액적에서 특정 유전자 서열을 역전사하여 cDNA를 합성 한 후 증폭하는 단계; 및 d) 상기 특정 유전자를 정량하는 단계;를 포함하는, COVID-19 바이러스 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 정보 제공방법에 있어, 상기 프라이머 세트와 프로브는 S 유전자 일부 또는 전체 부위를 정량하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 정보 제공방법에 있어, 상기 특정 유전자는 COVID-19 바이러스의 RdRp 유전자, S 유전자, E 유전자, M 유전자 및 N 유전자로 이루어진 군에서 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 COVID-19 바이러스 특정 유전자가 삽입된 재조합 벡터는 COVID-19 바이러스 포장 RNA 표준물질 제조에 유용하며, 본 발명에 따른 COVID-19 바이러스 포장 RNA 표준물질은 COVID-19 바이러스의 감염 여부를 정확하게 진단할 수 있는 우수한 효과를 가지고 있다.
또한 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질을 이용한 COVID-19 진단을 위한 정보 제공방법은 COVID-19 바이러스 진단에 있어 SARS-CoV-2의 유전체 염기서열을 이용한 핵산 증폭 검사에 대한 기준을 제공하고, COVID-19 진단에서 위음성을 방지하고 정확한 진단에 유용하게 활용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질을 실제 시료에서 검출되는 SARS-CoV-2와 유사하고 안전하며, 장기간 보존 가능성과 그 자체의 안정성(stability) 및 균질성(homogeneity)이 확인되어 COVID-19 바이러스 진단 표준물질로 용이하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 실시예 3의 포장 RNA 표준물질의 제조방법을 도시화한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예 3의 포장 RNA 를 one-step RT qPCR로 수행하여 E 유전자에 대해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 3의 포장 RNA 에 대하여 one-step RT dPCR을 수행하여 병간 균질성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 실시예 5의 표준물질에 대한 단기 안정성을 dPCR로 수행하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 실시예 5의 표준물질에 대한 장기 안정성을 dPCR로 수행하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 재조합벡터로서, 상기 재조합벡터는 5'부터 3' 순으로,
좌측 5’ LTR (5′ LTR, 5′ long terminal repeat);
패키징 시그날 (Ψ ,packaging signal);
Rev-응답요소(RRE,Rev-response element);
cPPT/CTS 서열(central polypurine tract/central termination sequence);
EF1-lα 프로모터(EF-1α promoter, Human elongation factor 1 alpha promoter);
COVID-19 바이러스의 특정 유전자가 삽입된 다중클로닝 부위(MCS, Multiple cloning site);
바이러스 전사 후 조절요소 (WPRE, woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element); 및
우측 3’ LTR (3′ LTR , 3′ long terminal repeat)를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 일 수 있다. 상기 렌티바이러스의 골격을 사용하는 것으로 인정되는 어떤 변형된 벡터일 수 있다. 벡터의 다른 기능을 위하여 가해지는 어떠한 변형된 형태도 본 발명의 구성을 포함하는 한, 본 발명의 범위 안에 있다.
상기 렌티바이러스는 상기 렌티바이러스와 유사한 레트로바이러스와 달리, 그 자체로 비독성이며, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency viruses: HIV), 원숭이 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus: SIV), 말 전염 뇌염 바이러스(equine infectious encephalitis virus: EIAV), 염소관절염 뇌염 바이러스(caprine arthritis encephalitis virus: CAEV), 소 면역결핍 바이러스(bovine immunodeficiency virus: BIV) 및 고양이 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV)를 일 수 있으나, 이에 제한되지 않으나, 상기 렌티바이러스는 HIV 인 것이 바람직하다.
또한 상기 렌티바이러스는 일생의 감염과정 동안 다양한 속도로 지속적으로 복제가 가능하다.
상기 재조합벡터에 있어, LTR은 긴 말단 반복부위 (long terminal repeat)로, 구체적으로는 렌티 바이러스의 유전자의 발현 (예를 들어, 촉진, 개시 및 유전자 전사물의 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제에 기본적인 기능을 제공한다. 상기 LTR은 전사 조절 요소, 폴리아데닐화 시그날 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 서열을 포함한 다수의 조절 시그날을 함유한다.
상기 재조합벡터에 있어, 패키징 시그날은 바이러스 RNA를 바이러스 캡시드 또는 입자 내로 삽입하는데 필요한 것으로, 특히 렌티바이러스 게놈 내에 위치한 서열을 나타낸다.
더욱 구체적으로는 몇 가지의 렌티바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 캡시드화 (encapsidation)에 필요한 최소 패키징 시그날 (또한 프사이 [Ψ] 서열로도 불린다)을 사용할 수 있다. 'Ψ'는 바이러스 입자 형성 중에 렌티바이러스 RNA 스트랜드의 캡시드화에 필요한 비-코딩 서열과 관련하여 사용될 수 있다.
상기 재조합벡터에 있어, Rev-응답요소(RRE,Rev-response element)는 스플라이싱(splicing) 과정을 거치지 않은 viral RNA (unspliced virus RNA)의 핵 외로의 이동을 증가시켜 바이러스 역가를 향상시킬 수 있다.
상기 재조합벡터에 있어, cPPT/CTS 서열은 동안 viral genome이 핵 내로 유입 되는 것을 촉진시켜 vector의 완성(integration)과 형질도입 효율을 증가시킬 수 있다.
상기 재조합벡터에 있어, 상기 EF1α 프로모터는 COVID-19 바이러스의 유전자를 숙주세포에서 특이적으로 발현시킬 수 있으며, 렌티바이러스 벡터에서 유전자 발현의 침묵현상인 사일런싱(silencing) 을 줄여줄 수 있다.
상기 재조합벡터에 있어, 상기 특정 유전자는 COVID-19 바이러스의 RdRp 유전자, S 유전자, E 유전자, M 유전자 및 N 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 재조합 벡터 일 수 있다.
또한 상기 재조합벡터에 있어, 상기 다중클로닝 부위 (MCS, Multiple cloning site) 뒤에 AcGFP(human-codon-optimized)가 더 포함될 수 있다.
상기 재조합벡터에 있어, 상기 WPRE는 RNA의 processing과 핵외로의 이동(nuclear export)을 촉진시키며, viral genomic RNA에 작용하여 vector pacakaging 효율과 바이러스 역가를 높여줄 수 있다.
본 발명의 재조합벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 퓨로마이신, 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 바람직하게는 퓨토마이신, 암피실린 또는 테트라사이클린 일 수 있다.
본 발명의 일 양태는, 상기 재조합벡터와 VSV-G 또는 Gag-Pol 유전자가 포함된 포장 벡터(packaging vector)를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
상기 포장벡터는 gag, pol 및 VSV-G와 같은 구성을 인코딩(encoding)하는 하나 이상의 포장 벡터 일 수 있으며, 상기와 같은 구성일 경우 안정한 숙주세포를 제공할 수 있다.
본 발명에 있어, ‘숙주 세포‘는 본 발명의 재조합벡터 의해 생체내 또는 시험관내에서 형질도입이 된 세포를 포함한다. 상기 형질도입이란, 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질을 변화시키는 것을 의미한다. 또한 외인성, DNA가 세포, 조직, 성체 등의 숙주 유기체에 도입되어, 안정적으로 유전되며, 표현형의 변화를 나타내는 것을 의미한다. 또한 상기 숙주세포에 상기 재조합 벡터를 도입하기 위한 방법을 의미할 수 있다. 형질도입 하기 위한 방법으로는 종래 알려진 다양한 방법, 예를 들면, 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 정자를 이용하는 방법(sperm-mediated gene transfer), 바이러스 감염법(viral infection), 직접근육주입법(direct muscle injection), 인슐레이터(insulator), G-fectin, Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀을 포함하는 전달시약과 함께 세포 내로 도입되거나, 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 숙주 세포 내 흡수를 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 당 분야에 인식된 다양한 기법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.
상기 숙주세포는 상기 재조합벡터 입자로, 바이러스 게놈 RNA의 렌티바이러스 포장(packaging)을 위해, 인 트랜스로 요구되는 구성을 제공한다. 상기 숙주세포의 일 예로, 베로세포, Per.C6 세포, BHK 세포, Cf2Th 세포, HeLa 세포, D17세포, PCK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포, 293 세포(예, HEK 293T 세포), 및 COS 세포 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 HEK 293T 세포 일 수 있다.
본 발명의 일 양태는 상기 숙주세포에서 정제 및 농축된 COVID-19 바이러스 진단을 위한, SARS-CoV-2 포장 RNA를 제공하는 것이다.
본 발명에 있어, '포장 RNA'(Packaged RNA)는 바이러스 RNA (Virus RNA)를 바이러스 구조 단백질로 이루어진 껍질(capsid)로 포장한 RNA를 의미할 수 있다.
상기 SARS-CoV-2 포장 RNA는 상기의 재조합 벡터, 포장 벡터 등을 이용한 렌티바이러스 포장 시스템으로 제조될 수 있다. 상기 렌티바이러스 포장 시스템은 렌티바이러스의 대표인 HIV (human immunodeficiency virus) 바이러스 유전체 중 바이러스 유전자를 제거한 후 개량하여 만든 벡터를 이용하여 COVID-19 바이러스의 특정 유전자를 포장하여 전달하는 시스템을 의미할 수 있다. 상기 특정 유전자를 RNA 형태로 포장한 포장 RNA를 배양액으로 배출할 수 있으며, 포장 RNA가 들어있는 배양액을 수집 및 여과하여 그대로 사용할 수도 있고 또는 농축하여 사용할 수 있다.
상기 COVID-19 바이러스 진단을 위한, SARS-CoV-2 포장 RNA는 도 1과 같이, 정제 및 농축되어 제조 될 수 있다.
본 발명의 일 양태는 COVID-19 바이러스의 특정 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터와 포장벡터를 숙주세포에 형질 감염시켜, 형질도입된 숙주세포를 제조하는 단계;
상기 형질감염된 숙주세포에서 SARS-CoV-2의 RNA를 농축하여, SARS-CoV-2 포장 RNA를 제조하는 단계;
표준물질 매트릭스(matrix)인, 인간 혈액세포주 유래 RNA와 상기 포장 RNA를 혼합하여 RNA 혼합물을 제조하는 단계; 및
상기 RNA 혼합물에서 상기 특정 유전자를 정량하는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 제조방법에 있어, 상기 특정유전자는 COVID-19 바이러스의 RdRp 유전자, S 유전자, E 유전자, M 유전자 및 N 유전자로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 포함하는 것 일 수 있으며, COVID-19 바이러스의 복제 및 전사에 관련한 유전자 또는 바이러스를 구성하는 유전자라면 모두 가능하며, 이에 제한되지 않는다.
상기 제조방법에 있어, COVID-19 바이러스의 특정 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터는 상기 렌티바이러스 벡터의 다중클로닝 부위인 MCS에 상기 COVID-19 바이러스의 특정 유전자를 삽입 및 클로닝(cloning) 하여 제작 될 수 있다. 상기 COVID-19 바이러스의 특정 유전자는 RdRp 유전자, S 유전자, E 유전자, M 유전자 및 N 유전자가 모두 포함하여 삽입 및 클로닝 될 수 있고 E M N 유전자, RdRp 유전자 및 S 유전자로 나눠서 삽입 및 클로닝 될 수 있으며, RdRp 유전자, S 유전자, E 유전자, M 유전자 및 N 유전자 각각의 유전자를 삽입 및 클로닝하여 제조될 수 있다. 바람직하게는 있고 E M N 유전자, RdRp 유전자 및 S 유전자로 나눠서 삽입 및 클로닝 될 수 있으며, 이 경우 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질을 안전하게 제조할 수 있고, 신뢰성 있게 상기 특정 유전자를 정량할 수 있다.
상기 제조방법에 있어, COVID-19 바이러스의 특정 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터와 포장벡터를 숙주세포에 형질 감염시켜, 형질도입된 숙주세포를 제조단계 후에 시퀀싱(Sequensing) 단계를 더 포함할 수 있고 있으며 상기 시퀀싱 단계에서 COVID-19 바이러스의 특정 유전자의 유무 및 돌연변이를 확인 할 수 있다. 상기 시퀀싱 단계는 sanger 시퀀싱 또는 NGS(Next generation sequencing) 시퀀싱 방법으로 수행될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 제조방법에 있어, 표준물질 매트릭스(matrix)인, 인간 혈액세포주 유래 RNA와 상기 포장 RNA를 혼합하여 RNA 혼합물을 제조 할 경우, COVID-19 바이러스의 특정 유전자의 RNA 분해를 막아, 안정성을 유지 시킬 수 있으며, 실제 진단 시 사용되는 시료의 형태와 유사한 조건이 된다.
상기 제조방법에 있어, 상기 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응은 염기서열 1의 정방향 프라이머 및 염기서열 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 3의 염기서열의 프로브를 포함하는 분석용 조성물에 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어 '프라이머'란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3'hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 염기서열 1의 정방향 프라이머 및 염기서열 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 COVID-19 바이러스의 S 유전자를 높은 특이도와 민감도로 검출할 수 있다.
본 발명에 있어 ‘프로브’란 상보적인 염기서열과 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염 기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 염기서열의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA)프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 등의 형태로 제작될 수 있다. 또한 단일가닥의 염기서열로 구성되어 상보적인 서열을 가진 단일가닥 DNA 또는 RNA에 특이적으로 결합하여 혼성화 할 수 있으며, 혼성화한 프로브의 표지 신호를 탐지하는 방식을 통해 타겟을 검출할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트와 서열번호 3의 염기서열의 프로브를 이용하여 COVID-19 바이러스의 S 유전자를 높은 민감도와 특이도로, COVID-19 바이러스의 DNA 또는 RNA에 특이적으로 결합하여 검출이 가능하다.
상기 제조방법에 있어, 상기 프라이머 또는 상기 프로브는 포스포아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르,포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
상기 제조방법에 있어, 상기 프라이머 세트와 프로브는 S 유전자 일부 또는 전체 부위를 정량하는 것 일 수 있다.
상기 제조방법에 있어, 상기 프로브는 양 말단에 리포터(Reporter) 및 소광자(Quencher)가 결합되어 있으며, 상기 상기 리포터는 SYBR 그린(SYBR green), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, Cy3, NED, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질이고, 상기 소광자는 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, DDQ 1, DDQ, 2, MGB, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, 및 IRDye QC-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 소광 물질인 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제조방법에 있어, 상기 특정 유전자 정량은 RT-PCR, Real time PCR, Digital PCR(dPCR), Quantitative PCR(qPCR) 또는 Isothermal PCR 에서 선택되는 어느 하나를 사용하여 정량 할 수 있으나, Digital PCR(dPCR)이 바람직하다.
상기 제조방법에 있어, 상기 Digital PCR(dPCR)은 PCR mixture를 오일방울(droplet)이나 미소유체(microfluidic) chip을 이용하여 구획을 아주 작은 단위로 분리시켜 PCR을 진행하는 방식이다. 한 구획 안에 미세량(0~2의 복제 수(copies))의 DNA가 들어가 증폭하게 되면 기준 곡선없이 매우 세밀한 정량이 가능하며 COVID-19 바이러스 유전자 또는 특정 유전자를 검출을 높은 특이도와 민감도로 정확하게 검출이 가능하다.
상기 제조방법에 있어, 상기 특정유전자는 COVID-19 바이러스의 복제 및 전사에 관련한 유전자와 COVID-19 바이러스의 구조 유전자를 일부 또는 전체를 의미할 수 있다.
상기 제조방법에 있어, 상기 형질감염된 숙주세포에서 SARS-CoV-2의 RNA를 농축하여, SARS-CoV-2 포장 RNA를 제조하는 단계에 있어 상기 숙주세포에서 SARS-CoV-2의 RNA를 농축 한 후 열처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 열처리 단계는 50 내지 70℃에서 1 내지 5분간 수행될 수 있으며 더욱 바람직하게는 60 내지 65℃에서 2 내지 4분간 수행될 수 있다. 상기 열처리 단계를 더 포함할 경우 안전하고 SARS-CoV-2의 구조 단백질을 모두 포함하며 실제 시료와 유사한 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질을 제조할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 상기 방법으로 제조된 COVID-19 바이러스 진단을 위한 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질을 제공하는 것이다.
상기 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질은 SARS-CoV-2의 RdRp 유전자, S 유전자, E 유전자, M 유전자 및 N 유전자를 포함하는 SARS-CoV-2의 포장 RNA 및 인간 혈액세포주 유래 RNA를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어, '표준물질(Reference Material, RM)'은 측정이나 명목 특성의 시험 · 검사에 사용할 목적으로 하나 이상의 명시된 특성에 관하여 충분히 균질하고 안정된 물질을 말하며, 표준물질(Standard material) 및 검증된 표준원액을 포함하는 것으로, 상기 표준물질은 장기간 보존 가능성과 그 자체의 안정성 (stability) 및 균질성(Homogeneity)이 보장되어야 한다.
본 발명에서 제공하는 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질은 상기 제조방법에 의해, 안정성 및 균질성이 신뢰도 95% 이상으로 보장될 수 있다.
상기 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질은 Wuhan-Hu-1 바이러스주의 공개된 염기서열(Genbank: MN908947)을 참조서열을 하여, 상기 참조서열에서 RdRp 유전자 전체 (13025번부터 16405번 서열) 서열, E 유전자 시작부터, M 유전자를 포함하며, N 유전자 끝을 포함하는 염기서열(26245번부터 29530번 서열)을 포함하나, 참조서열과 28144번 서열이 T가 C인 점에서 차이점이 있다. 또한 상기 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질은 S 유전자 일부(21563번부터 - 23473번 서열)를 포함한다.
상기 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질은 COVID-19 바이러스의 복제 및 전사에 관련한 유전자와 COVID-19 바이러스의 구조 유전자를 일부 또는 전체를 포함한다.
본 발명의 일 양태는 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질을 포함하는 진단용 조성물을 제공하는 것일 수 있다.
상기 조성물에 있어, 상기 조성물은 염기서열 1의 정방향 프라이머 및 염기서열 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 3의 염기서열의 프로브, dNTP 및 역전사효소(Reverse transcriptase)를 포함하는 PCR 반응액을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 상기 진단용 조성물을 준비하는 단계; 상기 진단용 조성물로부터 수십 만개 미세액적(droplet)을 생성하는 단계; 상기 생성된 미세액적에서 특정 유전자 서열을 역전사하여 cDNA를 합성 한 후 증폭하는 단계; 및 상기 특정 유전자를 정량하는 단계;를 포함하는, COVID-19 바이러스 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.
상기 프라이머 세트와 프로브는 S 유전자 일부 또는 전체 부위를 정량하는 것 일 수 있다.
상기 COVID-19 바이러스 진단을 위한 정보 제공은 COVID-19 진단에 있어, RT-dPCR와 RT-qPCR 방법으로 제공 될 수 있다.
상기 COVID-19 바이러스 진단을 위한 정보 제공은 RT-dPCR(단단계 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응)을 측정하여 기준값으로 하고, RT-qPCR (단단계 역전사 실시간 정량 중합효소연쇄반응)을 측정하여 정보값으로 할 수 있다.
상기 기준값은 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질에 포함된 특정 유전자 염기서열의 복제 개수 농도이며, 상기 정보값은 상기 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질로부터 추출한 RNA 용액 총 중량%에 대하여 5 내지 10 중량%를 이용하여 단단계 역전사 실시간 정량 중합효소연쇄반응(one-step reverse transcription quantitative PCR)으로 측정하였을 때 나온 cq (Threshold cycle)값 일 수 있으며 상기 cq 값은 특정 유전자에 대한 30~36 cycle 이다.
이와 같이 본 발명은 기준값과 정보값을 제공하여, SARS-CoV-2의 진단의 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법으로 유용하다.
상기 프라이머 세트와 프로브는 앞에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 일 실시예에 따른, 상기 특정 유전자는 COVID-19 바이러스의 RdRp 유전자, S 유전자, E 유전자, M 유전자 및 N 유전자로 이루어진 군에서 어느 하나 이상을 포함하는 것 일 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. COVID-19 바이러스(SARS-CoV-2)의 특정 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합벡터 제조
실시예 1-1. COVID-19 바이러스 (SARS-CoV-2)의 E, M, N 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합벡터 제조
HIV 기반 렌티바이러스 벡터이며, 좌측 5’ LTR -패키징 시그날-Rev-응답요소-CPP/CTS 서열- EF1-lα 프로모터-다중클로닝 부위(MCS, Multiple cloning site)-WRRE-3’ LTR으로 구성된 벡터의 다중클로닝 부위 MCS에 ACC65I 제한효소(restriction enzyme)과 BamHI 제한효소(restriction enzyme)를 이용하여 COVID-19 바이러스의 E, M, N 유전자를 클로닝(cloning) 하여 제작하였다.
실시예 1-2. COVID-19 바이러스 (SARS-CoV-2)의 RdRp 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합벡터 제조
HIV 기반 렌티바이러스 벡터이며, 좌측 5’ LTR -패키징 시그날-Rev-응답요소-CPP/CTS 서열- EF1-lα 프로모터-다중클로닝 부위 MCS(Multiple cloning site)-WRRE-3’ LTR으로 구성된 벡터의 다중클로닝 부위인 MCS에 ACC65I 제한효소(restriction enzyme)과 BamHI 제한효소(restriction enzyme)를 이용하여 COVID-19 바이러스의 RdRp 유전자를 클로닝(cloning) 하여 제작하였다.
실시예 1-3. COVID-19 바이러스 (SARS-CoV-2)의 S 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합벡터 제조
HIV 기반 렌티바이러스 벡터이며, 좌측 5’ LTR -패키징 시그날-Rev-응답요소-CPP/CTS 서열- EF1-lα 프로모터-다중클로닝 부위 MCS(Multiple cloning site)-WRRE-3’ LTR으로 구성된 벡터의 다중클로닝 부위인 MCS에 ACC65I 제한효소(restriction enzyme)과 BamHI 제한효소(restriction enzyme)를 이용하여 COVID-19 바이러스의 S 유전자를 클로닝(cloning) 하여 제작하였다.
실험예 1. qPCR을 이용한 렌티바이러스 재조합 벡터 유전자 삽입 유무 확인
상기 실시예 1-1, 1-2 및 1-3에서 제조한 렌티바이러스 재조합벡터를 증폭한 후 one step-qPCR(quantitative PCR)하여 하기 표 1과 같이 유전자 삽입 유무를 확인하였다. 먼저 1차는 N 유전자를 확인하기 위한 상기 실시예 1-1의 렌티바이러스 재조합벡터와 공벡터(EV: empty vector control) 및 대조군 (NTC:DW control) 세트, 2차는 RdRp 유전자를 확인하기 위한 상기 실시예 1-2의 렌티바이러스 재조합벡터와 공벡터(EV: empty vector control) 및 대조군 (NTC:DW control) 세트 및 3차는 S 유전자를 확인하기 위한 상기 실시예 1-3의 렌티바이러스 재조합벡터와 공벡터(EV: empty vector control) 및 대조군 (NTC:DW control) 세트를 각각 qPCR로 3반복 한 다음 평균 유전자 복제 수(copy number)로 확인하였으며, 상기 ct(Threshold cycle) 값은 30~36 cycle 이였다.
COVID-19 바이러스 qPCR 및 dPCR용 정량 프라이머 및 프로브
Assay
(qPCR)		 시험군 복제 수
Copy number
(1ul)		 시험군 복제 수
Copy number
(1ul)		 시험군 복제수
Copy number
(1ul)
N 유전자 실시예 1-1 80.40 110.67 117.20 EV 0.40 NTC 00
RdRP 유전자 실시예 1-2 47.47 46.80 46.00 EV 0.26 NTC 0.60
S 유전자 실시예 1-3 8.28 11.73 11.20 EV 00 NTC 0.52
상기 표 1과 같이 1차 세트는 공벡터 및 대조군은 유전자 복제 수가 1 미만으로 확인된 반면, 상기 실시예 1-1의 렌티바이러스 재조합 벡터는 N 유전자가 80.40~ 117.20 복제 수(copy), 상기 실시예 1-2의 렌티바이러스 재조합 벡터는 RdRp 유전자가 46 ~ 47.47 복제 수(copy)로 확인되었으며, 상기 실시예 1-3의 렌티바이러스 재조합 벡터는 S 유전자가 8.28 ~ 11.20 복제 수(copy)로 확인되어, COVID-19 바이러스의 유전자가 삽입되었음을 확인하였다.
실시예 2. 포장 SARS-CoV-2 RNA 제조
첫째 날, HEK 293T 세포주를 100 mm dish(배양접시), 10 mL 세포배양액을 이용하여 1 × 106 세포수로 배양한다. 둘째 날 Eppendorf tube에 각각의 상기 실시예 1에서 제조한 SARS-CoV-2 유전자가 삽입된 렌티바이러스 벡터, VSV-G 또는 Gag-Pol 유전자가 포함된 포장 벡터 그리고 500 μL의 Opti-MEM (Gibco)를 혼합한다. 형질주입 시약(transfection Reagent, TransIT-293, Mirus)를 DNA 양의 3배가 되게 넣은 후 피펫을 이용하여 균일하게 혼합한다. 실온에서 20분 반응시키고, HEK 293T 세포주에 형질주입 하였다. 형질주입 후 48시간 동안 방치한 배양액을 모아 0.45 μm 주사기 필터(syringe filter)를 이용하여 부유 HEK 293T 세포를 제거하였다. 여과한 배양액을 50 mL conical tube에 모은 후 농축 과정을 진행하였다.
실시예 3. 포장 SARS-CoV-2 RNA 농축
렌티바이러스 농축 시약을 배양액의 3분의 1 부피만큼 첨가하여(예, 9 mL 배양액일 경우 3 mL 농축액 첨가) 교반기(vortex)를 사용하여 잘 혼합한 후 4 ℃에 30 분에서 8 시간 동안 반응시켜주었다. 이후 4 ℃, 1,500 x g 조건에서 45 분 동안 원심분리를 진행하고, 가라앉은 하얀색 펠렛(pellet)을 제외한 상층액을 완벽히 제거하였다. 렌티바이러스 파티클을 안전하게 보관하기 위해 초기 바이러스 배양액 부피의 10분의 1만큼 검체 수송배지를 첨가한 후 pellet을 피펫을 이용하여 풀어주었다. 농축 포장 RNA 중 일부는 분주에 필요한 양을 측정하기 위하여 사용하고 나머지는 -70 ℃ 냉장고에 소분하여 보관하였다.
실시예 4. RNA 추출 및 복제 개수 농도 확인
표준물질 제조에 필요한 대략적인 복제 개수 농도를 확인하기 위하여 먼저, Qiagen viral RNA extraction Kit로 RNA를 추출하였다. 농축한 포장 RNA 중 14 μL를 취하여 Eppendorf tube 에 넣고 최종 140 μL가 되도록 검체 수송배지를 추가하였다. 여기에 AVL buffer (lysis buffer)-Carrier RNA 용액 560 μL를 넣은 후 교반기를 이용하여 잘 섞고 10 분 동안 정치하였다. 추가적으로 560 μL의 96 ~ 100%(v/v) 에탄올을 넣고 잘 섞어 준 후 곧바로 컬럼(column)에 통과시켰다. AW1 buffer 와 AW2 buffer를 이용하여 RNA를 얻었다. 추출된 RNA에 대하여 각 RNA 조각을 측정할 수 있도록 하기 표 2의 프라이머 프로브를 이용하여 one-step RT dPCR을 수행하여 병간 균질성을 확인하였다.
COVID-19 바이러스 qPCR 및 dPCR용 정량 프라이머 및 프로브
유전자 이름 염기서열(5'-> 3')
RdRp COVID-19-RdRp-정방향 프라이머 GGTAACTGGTATGATTTCG
COVID-19-RdRp-역방향 프라이머 CTGGTCAAGGTTAATATAGG
COVID-19-RdRp-프로브 TCATACAAACCACGCCAGG
E COVID-19-E - 정방향 프라이머 ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT
COVID-19-E - 역방향 프라이머 TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
COVID-19-E -프로브 ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC
N COVID-19-N- 정방향 프라이머 GACCCCAAAATCAGCGAAAT
COVID-19-N-역방향 프라이머 TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
COVID-19-N -프로브 ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC
S COVID-19-S-정방향 프라이머
(서열번호 1)		 TCTGCTTTACTAATGTCTATGC
COVID-19-S-역방향 프라이머
(서열번호 2)		 GCTATAACGCAGCCTGTAAA
COVID-19-S-프로브 (서열번호 3) TCAGACAAATCGCTCCAGGGCA
one-step RT dPCR를 수행하기 전 상기 S 유전자를 정량하기 위하여 상기 표 2의 COVID-19- S-정방향 프라이머 (서열번호 1), COVID-19- S-역방향 프라이머 (서열번호 2) 및 COVID-19-S-프로브(서열번호 3)을 이용하여 one step-qPCR을 상기 실시예 3의 SARS-CoV-2의 RNA, 공벡터(EV: empty vector control) 및 대조군 (NTC:DW control)으로 하여 확인하였다. 3반복하였고 ct(threshold cycle) 값으로 확인하였다. 결과는 하기 표 3으로 단위는 ct(Threshold cycle) 값으로 나타내었다.
Assay SARS-CoV-2 RNA (Ct) EV NTC
S 유전자 33.35 Undermined Undermined
32.86 Undermined Undermined
33.07 Undermined Undermined
one step-qPCR 조건은 하기 표 4와 같다.
단계 (Cycling step) 온도(Temperature, ℃) 시간(Time) 사이클
Number of cycles
UNG incubation 25 2 min 1
RT incubation 55 10 min 1
Enzyme activation 94 3 min 1
Denaturation 94 15 s 45
Annealing/Amplification 60 30 s
상기 표 3에서와 같이 상기 COVID-19-S-정방향 프라이머(서열번호 1), COVID-19- S-역방향 프라이머(서열번호 2) 및 COVID-19-S-프로브(서열번호 3)를 이용하여 one step-qPCR을 수행하였을 때 상기 실시예 3의 SARS-CoV-2의 RNA는 ct 값이 33.07~33.35으로 확인된 반면, 공벡터(EV: empty vector control) 및 대조군 (NTC:DW control)은 undermined로 확인되었다. 상기 표 2의 COVID-19 바이러스 qPCR 및 dPCR용 정량 프라이머 및 프로브를 사용하여 상기 실시예 3 의 SARS-CoV-2의 RNA를 one-step RT dPCR를 수행하여 병간 균질성을 확인하였다. 병간 균질성을 확인하기 전에 대조군을 공벡터로 하여 COVID-19 바이러스 E 유전자에 대해 one-step RT dPCR를 수행하여 검정하였다. 도 2와 같이 공벡터에서는 복제 수(copy)가 확인되지 않았다. 반면 상기 실시예 3의 SARS-CoV-2의 RNA는 19.8 내지 26.9 복제 수(copy)가 확인되었다.
실시예 5. 포장 RNA 표준물질 분주
포장 RNA를 Ep tube에 필요한 양만큼 취하고 Hot plate의 65 ℃에서 3분간 열을 가하였다. 열을 가한 포장 RNA는 검체 수송배지에 각 유전자의 농도가 (4,000 - 40,000) copy number/mL이 되도록 희석하였다. 이때, 매질로써 사용하기 위하여 준비한 Jurkat 인간 세포주 RNA (human Jurkat cell _ total RNA　2.5 μg/mL)를 함께 넣고, 교반기와 회전기를 이용해 충분히 섞어준 다음 균질하게 섞인 포장 RNA 표준물질을 300 μL 씩 vial에 분주한다. 분주할 때 포장 RNA의 안정성을 위하여 온도 변화를 최소화하며 신속히 진행하였다.
실험예 2. 포장 RNA 표준물질의 병간 균질도, 측정량 및 정보값 확인
상기 표 2의 프라이머 프로브를 이용하여 one-step RT dPCR을 수행하여 병간 균질성을 확인한 결과 하기 표 5와 같이 병간 균질도는 RdRP 유전자 12%, E 유전자 6.7%, N 유전자 6.2% 및 S 유전자 14%가 확인되었다. 또한 도 3과 같이 RdRP 유전자는 2.0x103 복제 수(copy/mL)~4.0x103 복제 수(copy/mL)가 확인되었고, E 유전자는 2.5x104 ~ 4.5x104 복제 수(copy/mL)가 확인되었다. 또한 N 유전자는 4.0x104 ~6.0x104 복제 수(copy/mL)가 확인되었으며, S 유전자는 1.0x104 ~4.0x104 복제 수(copy/mL)가 확인되었다.
병간 균질도
병간균질도 (%) k (95% 신뢰 수준)
RdRP 12 2.2
E 6.7 2.2
N 6.2 2.2
S 14 2.2
상기 실시예 5의 포장 RNA 표준물질의 측정량 SARS-CoV-2 특정 유전자 네 부위(RdRP, E, N, S)의 복제 수 농도(copy number concentration)이며 상기 복제 수는 본 발명의 포장 RNA 표준물질의 기준값으로 정하였다. RNA 추출 후 단단계 역전사 디지털 중합효소연쇄반응(one-step reverse transcription digital PCR) 방법으로 측정되었다. 결과는 하기 표 6과 같다.
포장 RNA 표준물질의 기준값 및 확장도
타겟 유전자 기준값(copies/mL) 확장불확도(copies/mL) k (95% 신뢰 수준)
RdRP 4.0 × 103 2.1 × 103 2.2
E 3.16 × 104 0.86 × 104 2.2
N 4.4 × 104 1.3 × 104 2.2
S 2.16 × 104 0.82 × 104 2.2
또한 본 표준물질의 정보값은 표준물질 140 μL로부터 추출한 RNA 용액 60 μL 중 5 μL를 이용하여 단단계 역전사 실시간 정량 중합효소연쇄반응(one-step reverse transcription quantitative PCR)으로 측정하였을 때 나온 Cq(Threshold cycle)값으로, 네 개의 유전자(RdRP, E, N, S)의 Cq값은 (30 - 36) cycle이였다. 상기 PCR 조건은 하기 표 7과 같고, PCR 반응액은 하기 표 8과 같으며, 시약을 섞은 반응 혼합물이 만들어 지면 vortexer (교반기)를 이용해 잘 섞어주고, 원심분리기로 혼합물을 가라앉힌 후, 실온(25℃)에서 DG8 cartridge holder에 DG8 droplet generator cartridge (오일, 미세액적 생성 카트리지)를 넣고 고정하였다. 반응 혼합물 20μL와 Droplet generation oil for probe(프로브용 미세액적) 70μL를 DG8 droplet generator cartridge(오일, 미세액적 생성 카트리지)에 순서대로 분주한 다음, 미세액적 생성을 위해 QX200 droplet generator에 옮겨 약 2분간 초록색 불빛이 켜질 때까지 반응시켰다. 상기 반응이 끝난 후, 만들어진 샘플을 96-well PCR plate에 옮겼다. Foil sealer(밀봉용 호일)로 PCR plate를 덮고, plate sealer(플레이트 밀봉기)를 이용해 180 ℃에서 plate를 sealing(밀봉)한 후 ABI thermo cycler에 넣고 PCR을 수행하였다.
단단계 역전사 디지털 중합효소연쇄반응(one-step reverse transcription digital PCR) 조건
단계
(Cycling step)		 온도
(Temperature, ℃)		 시간
(Time)		 램프 레이트
(Ramp Rate)		 사이클
(Number of cycles)
Reverse transcription 48 60 min 1
Enzyme activation 95 10 min 2 ℃/s 1
Denaturation 95 30 s 70
Annealing/extension 60 1 min
Droplet stabilization 98 10 min 1
Hold (optional) 4 ∞ 1
PCR 반응액
시약 volume (μL)
Supermix 5
Revese transcriptase 2
300 mM DTT 1
10 μM Primer 각 2
10 μM Probe 1
RNA 5
Nuclease-free DW 2
실험예 3. 안정성 확인
실험예 3-1. 단기 안정도 확인
-20 ℃, 4 ℃, 25 ℃에 보관한 0, 1, 3, 7 일 째의 상기 실시예 5의 표준물질에서 RNA를 추출하여 one-step RT-dPCR로 측정한 결과, 도 4와 같이 특정 온도에서 보관한 샘플이 안정성 평가 기준에 적합함을 확인하였다. 추가적으로, 온도 변화에 민감한 RNA 특성상 얼림-녹임(freezing-thawing) 횟수에 따른 안정성을 확인하였다. 안정성 평가 결과 제한된 조건 -20도 운반 하에 안정한 것으로 확인되었다.
실험예 3-2. 장기 안정도 확인
장기안정성을 확인하기 위하여 상기 실시예 5의 표준물을 -70 ℃ 에 보관한 지 1 개월 째의 샘플에서 RNA를 추출하여 RNA 복제 개수를 측정하였다. 도 5와 같이 1 개월까지 -70 ℃ 조건에서 안정함을 확인하였고 표준물질의 유효기간을 사용자 수령 후 2 개월로 한정하였다.
이상과 같이, 본 발명에서는 특정한 사항들과 한정된 실시예에 의해 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명한 실험예 및 실시예에 국한되어 한정되어서는 아니되며, 후술하는 청구 범위 일 뿐 만 아니라, 이 청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명의 사상 범주에 속한다고 할 것이다.
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Claims (19)

  1. COVID-19 진단을 위한 SARS-CoV-2 포장 RNA(Packaged RNA) 표준물질로, 상기 표준물질은 SARS-CoV-2 유전체(Genbank:MN908947)의 특정 서열 유전자 부위인, 상기 SARS-CoV-2 유전체의 21563번 서열 내지 23473 서열 유전자 부위, 13025번 내지 16405번 서열 유전자 부위 및 26245번 내지 29530번 서열 유전자 부위를 포함하고, 캡시드(capsid)로 포장한 SARS-CoV-2 RNA 및 인간 혈액 세포주 유래 RNA를 포함하는 SARS-CoV-2 포장 RNA(Packaged RNA) 표준물질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 26245번 내지 29530번 서열은 28144 서열이 T에서 C로 치환된 서열인 것인 SARS-CoV-2 포장 RNA(Packaged RNA) 표준물질.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. ACC65I 제한효소(restriction enzyme)와 BamHI 제한효소(restriction enzyme)를 이용 및 클로닝 하여 제조된 5’ LTR( 5′ long terminal repeat)-패키징 시그날(Ψ, packaging signal)-Rev-응답요소(RRE, Rev-response element)-CPP/CTS 서열(central polypurine tract/central termination sequence)- EF1-lα 프로모터(EF-1α promoter, Human elongation factor 1 alpha promoter)-SARS-CoV-2 유전체(Genbank: MN908947)의 특정 서열 유전자 부위인, 상기 SARS-CoV-2 유전체의 21563번 서열 내지 23473번 서열 유전자 부위, 13025번 내지 16405번 서열 유전자 부위 및 26245번 내지 29530번 서열 유전자 부위가 포함된 다중클로닝 부위 (MCS, Multiple cloning site)-바이러스 전사 후 조절요소(WPRE)-3’LTR(3′ long terminal repeat)으로 구성된 렌티바이러스 재조합벡터와 포장벡터를 숙주세포에 형질 감염시켜, 형질감염된 숙주세포를 제조하는 단계;
    상기 형질감염된 숙주세포에서 SARS-CoV-2의 RNA를 농축하여, SARS-CoV-2 포장 RNA를 제조하는 단계;
    상기 포장 RNA를 50 내지 70℃에서 1 내지 5분간 열처리 한 다음, 표준물질 매트릭스(matrix)인, 인간 혈액세포주 유래 RNA와 상기 포장 RNA를 혼합하여 RNA 혼합물을 제조하는 단계; 및
    상기 RNA 혼합물에서 상기 특정 서열 유전자 부위인 SARS-CoV-2의 21563번 서열 내지 23473번 서열 유전자 부위를 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응으로, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 3의 염기서열의 프로브를 포함하는 분석용 조성물을 이용하여 정량하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 26245번 내지 29530번 서열은 28144 서열이 T에서 C로 치환된 서열인 것인, SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 렌티바이러스가 HIV인 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 숙주세포는 VSV-G 또는 Gag-Pol 유전자가 포함된 포장 벡터(packaging vector)를 포함하는 것인 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질의 제조방법.
  11. 삭제
  12. 제7항에 있어서,
    상기 프로브는 양 말단에 리포터(Reporter) 및 소광자(Quencher)가 결합되어 있으며,
    상기 리포터는 SYBR 그린(SYBR green), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, Cy3, NED, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질이고,
    상기 소광자는 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, DDQ 1, DDQ, 2, MGB, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, 및 IRDye QC-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 소광 물질인, SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질의 제조방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
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