CN113025610B - 可视化二重lamp鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的方法 - Google Patents

可视化二重lamp鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了可视化二重LAMP鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的方法。本发明提供了可视化二重LAMP鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的单链DNA组，由SEQ ID No.1‑10所示单链DNA分子组成。本发明成功建立了鉴别检测ALV和CIAV可视化二重LAMP方法。该二重LAMP能够在在同一反应管里鉴别诊断ALV和CIAV，具有特异性好、敏感性高、污染小、方便快捷等优点，并且检测结果可直接用肉眼观察，根据反应产物颜色判断结果，适用于ALV和CIAV的临床快速筛查。

Description

可视化二重LAMP鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的 方法
技术领域
本发明涉及禽类病毒检测领域，特别涉及一种可视化二重LAMP鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的方法。
背景技术
目前我国鸡群中免疫抑制性病毒二重及多重感染的现象具有普遍性。禽白血病(Avian leukosis，AL)和鸡传染性贫血(Chicken Infectious Anemia,CIA)是两种鸡的免疫抑制病，CIAV、ALV单独感染或共感染时，能显著降低疫苗的免疫效果，这有可能造成鸡群不能有效抵抗病毒的感染而继发其他疾病，继而影响养殖业的健康和经济效益。王仙等研究表明国内鸡群普遍存在CIAV的感染，并且CIAV常常与ALV、马立克氏病病毒(MDV)、网状内皮增生症病毒(REV)等以共感染的方式流行，其中CIAV与ALV共感染的阳性率高达10.8％。此外，一些研究表明禽弱毒疫苗中存在CIAV和ALV的污染，这对养殖业安全健康的生产带来巨大的威胁。因而建立一种快速鉴别检测CIAV和ALV的方法，为CIAV和ALV的净化和控制提供技术支撑。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是反应混合物在等温(60-65℃)条件下进行扩增，具有快速、简便和敏感的特性，该方法已在多种疾病的检测上得到应用。目前应用比较成熟的均为单重LAMP对单个病原体的诊断方法，近年来多重LAMP技术的开发成为研究者的热点。常规LAMP扩增产物结果判定主要依据反应产物直接凝胶电泳观察梯形条带、实时浊度仪形成的副产物磷酸镁曲线图、肉眼判断白色沉淀和扩增产物加入荧光显色剂显色，这些方法均不适用于对于多重病原体的鉴别诊断。目前国内研究报道关于能够实现真正意义上的鉴别诊断的二重LAMP运用的有三种方法，一种是基于扩增产物酶切处理的特异序列识别法，通过在LAMP内引物中引入限制性内切酶位点，在进行恒温扩增完毕后对扩增产物进行酶切处理，然后根据酶切产物在琼脂糖凝胶上显示的不同位置来实现不同产物的区分，但该方法耗时较长，并且是需要开盖处理产物，增加了扩增子污染的风险。第二种是依赖于荧光PCR仪，根据扩增产物的熔解曲线出现特征峰的不同Tm值来判断为何种病原体，该方法可能由于同一病原体不同来源的模板其扩增产物的Tm值可能不同，导致结果出现的Tm值有偏差，因此该方法具有一定局限性。第三种是在内引物FIP上的5’端引入不同发射波长的荧光基团，扩增产物电泳后，不同病原体的扩增产物在不同发射波长的通道下发出不同的光，以此来区分不同病原体，但该方法也是需要开盖电泳，易造成实验室污染。
发明内容
本发明的目的是提供一种可视化二重LAMP鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的方法。
第一方面，本发明要求保护一种引物组合。
本发明所要求保护的引物组合具体由引物组I和引物组II组成。
所述引物组I由引物ALV-F3、引物ALV-B3、引物ALV-FIP和引物ALV-BIP组成。
所述引物ALV-F3可为如下(a1)或(a2)：
(a1)SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；
(a2)将SEQ ID No.1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.1具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物ALV-B3可为如下(a3)或(a4)：
(a3)SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；
(a4)将SEQ ID No.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.2具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物ALV-FIP为如下(a5)或(a6)：
(a5)SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；
(a6)将SEQ ID No.3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.3具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物ALV-BIP可为如下(a7)或(a8)：
(a7)SEQ ID No.4所示的单链DNA分子；
(a8)将SEQ ID No.4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.4具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物组II由引物CIAV-F3、引物CIAV-B3、引物CIAV-FIP和引物CIAV-BIP组成。
所述引物CIAV-F3可为如下(b1)或(b2)：
(b1)SEQ ID No.5所示的单链DNA分子；
(b2)将SEQ ID No.5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.5具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物CIAV-B3可为如下(b3)或(b4)：
(b3)SEQ ID No.6所示的单链DNA分子；
(b4)将SEQ ID No.6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.6具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物CIAV-FIP可为如下(b5)或(b6)：
(b5)SEQ ID No.7所示的单链DNA分子；
(b6)将SEQ ID No.7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.7具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物CIAV-BIP可为如下(b7)或(b8)：
(b7)SEQ ID No.8所示的单链DNA分子；
(b8)将SEQ ID No.8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.8具有相同功能的单链DNA分子。
第二方面，本发明要求保护一种单链DNA组。
本发明所要求保护的单链DNA组由单链DNA组I和单链DNA组II组成。
所述单链DNA组I由前文所述引物组I和探针ALV-Probe组成。
所述探针ALV-Probe可为如下(c1)或(c2)：
(c1)SEQ ID No.9所示的单链DNA分子；
(c2)将SEQ ID No.9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.9具有相同功能的单链DNA分子。
所述单链DNA组II由前文所述引物组II和探针CIAV-Probe组成。
所述探针CIAV-Probe可为如下(d1)或(d2)：
(d1)SEQ ID No.10所示的单链DNA分子；
(d2)将SEQ ID No.10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID No.10具有相同功能的单链DNA分子。
进一步地，所述探针ALV-Probe的5’端连接有荧光基团A，3’端连接有淬灭基团A。所述探针CIAV-Probe的5’端连接有荧光基团B，3’端连接有淬灭基团B。
在本发明的具体实施方式中，所述荧光基团A为FAM，所述淬灭基团A为BHQ3。所述荧光基团B为CY5，所述淬灭基团B为BHQ3。
第三方面，本发明要求保护含有前文所述引物对组或所述单链DNA组的试剂盒。
进一步地，所述试剂盒中还含有阳性质粒1和/或阳性质粒2。所述阳性质粒1为含有SEQ ID No.11所示DNA片段的质粒；所述阳性质粒2为含有SEQ ID No.12所示DNA片段的质粒。
第四方面，本发明要求保护前文所述引物对组或前文所述单链DNA组或前文所述试剂盒在如下任一中的应用：
(e1)鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒；
(e2)制备用于鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的产品；
(e3)检测待测病原微生物是否为禽白血病病毒或鸡传染性贫血病毒；
(e4)制备用于检测待测病原微生物是否为禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的产品；
(e5)检测待测样本中是否含有禽白血病病毒和/或鸡传染性贫血病毒；
(e6)制备用于检测待测样本中是否含有禽白血病病毒和/或鸡传染性贫血病毒的产品。
其中，(e1)、(e3)和(e5)所示应用可为非疾病诊断性应用。
第五方面，本发明要求保护前文所述试剂盒的制备方法。
本发明所要求保护前文所述试剂盒的制备方法，可包括将各条单链DNA分子(引物或探针)分别单独包装的步骤。
第六方面，本发明要求保护一种鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的方法。
本发明所要求保护的鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的方法，具体可包括如下步骤：提取待测病毒的核酸；以所述核酸为模板，采用前文所述单链DNA组进行二重LAMP扩增，然后进行如下判断：如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团A对应的荧光，则所述待测病毒为禽白血病病毒；如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团B对应的荧光，则所述待测病毒为鸡传染性贫血病毒。
所述方法中，当所述荧光基团A为FAM、所述荧光基团B为CY5时，如果所述反应产物能够在520nm紫外光下检测到绿色荧光，则所述待测病毒为禽白血病病毒；如果所述反应产物能够在670nm紫外光下检测到红色荧光，则所述待测病毒为鸡传染性贫血病毒。
所述方法中，所述待测病毒为禽白血病病毒或鸡传染性贫血病毒。
该方法可为非疾病诊断性方法。
第七方面，本发明要求保护一种检测病原微生物是否为禽白血病病毒或鸡传染性贫血病毒的方法。
本发明所要求保护的检测病原微生物是否为禽白血病病毒或鸡传染性贫血病毒的方法，具体可包括如下步骤：提取待测病原微生物的核酸；以所述核酸为模板，采用前文所述单链DNA组进行二重LAMP扩增，然后进行如下判断：如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团A对应的荧光，则所述待测病原微生物为禽白血病病毒；如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团B对应的荧光，则所述待测病原微生物为鸡传染性贫血病毒；如果反应产物既不能够检测到具有所述荧光基团A对应的荧光，也不能够检测到具有所述荧光基团B对应的荧光，则所述待测病原微生物既不为禽白血病病毒，也不为鸡传染性贫血病毒。
所述方法中，当所述荧光基团A为FAM、所述荧光基团B为CY5时，如果所述反应产物能够在520nm紫外光下检测到绿色荧光，则所述待测病原微生物为禽白血病病毒；如果所述反应产物能够在670nm紫外光下检测到红色荧光，则所述待测病原微生物为鸡传染性贫血病毒；如果所述反应产物既不能在520nm紫外光下检测到绿色荧光，也不能够在670nm紫外光检测到红色荧光，则所述待测病原微生物既不为禽白血病病毒，也不为鸡传染性贫血病毒。
所述方法中，所述待测病原微生物可为如下任一：禽白血病病毒、鸡传染性贫血病毒、禽流感病毒、鸡传染性法氏囊病毒、禽脊髓脑炎病毒、新城疫病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽传染性支气管病毒、鸡马立克病病毒、禽4型腺病毒。
该方法可为非疾病诊断性方法。
第八方面，本发明要求保护一种检测待测样本中是否含有禽白血病病毒和/或鸡传染性贫血病毒的方法。
本发明所要求保护的检测待测样本中是否含有禽白血病病毒和/或鸡传染性贫血病毒的方法，具体可包括如下步骤：提取待测样本的核酸；以所述核酸为模板，采用前文所述单链DNA组进行二重LAMP扩增，然后进行如下判断：如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团A对应的荧光，则所述待测样本中含有禽白血病病毒；如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团B对应的荧光，则所述待测样本中含有鸡传染性贫血病毒；如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团A对应的荧光，且能够检测到具有所述荧光基团B对应的荧光，则所述待测样本中既含有禽白血病病毒，也含有鸡传染性贫血病毒；如果反应产物既不能检测到具有所述荧光基团A对应的荧光，也不能检测到具有所述荧光基团B对应的荧光，则所述待测样本中既不含有禽白血病病毒，也不含有鸡传染性贫血病毒。
所述方法中，当所述荧光基团A为FAM、所述荧光基团B为CY5时，如果所述反应产物能够在520nm紫外光下检测到绿色荧光，则所述待测样本中含有禽白血病病毒；如果所述反应产物能够在670nm紫外光下检测到红色荧光，则所述待测样本中含有鸡传染性贫血病毒；如果所述反应产物既能在520nm紫外光下检测到绿色荧光，也能在670nm紫外光检测到红色荧光(肉眼观察为橘黄色，红色和绿色的叠加)，则所述待测样本中既含有禽白血病病毒，也含有鸡传染性贫血病毒；如果所述反应产物既不能在520nm紫外光下检测到绿色荧光，也不能够在670nm紫外光检测到红色荧光，则所述待测样本中既不含有禽白血病病毒，也不含有鸡传染性贫血病毒。
所述方法中，所述待测样本可含有或不含有如下任一种病毒：禽白血病病毒、鸡传染性贫血病毒、禽流感病毒、鸡传染性法氏囊病毒、禽脊髓脑炎病毒、新城疫病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽传染性支气管病毒、鸡马立克病病毒、禽4型腺病毒。
在本发明的具体实施方式中，所述待测样本具体为咽喉拭子或泄殖腔拭子。
该方法可为非疾病诊断性方法。
以上任一所述核酸均可为DNA、RNA、或DNA和RNA的混合物。
以上任一所述提取待测样本的核酸或待测病毒的核酸或待测病原微生物的核酸为使用RNA/DNA共提试剂盒提取得到的核酸。
当所述核酸中含有RNA时，先将RNA反转录为cDNA，然后再进行所述二重LAMP扩增。
在进行所述二重LAMP扩增时，所述引物ALV-FIP、所述引物ALV-BIP、所述引物CIAV-FIP和所述引物CIAV-BIP的工作浓度均为40μmol/L；所述引物ALV-F3、所述引物ALV-B3、所述引物CIAV-F3和所述引物CIAV-B3的工作浓度均为5μmol/L；所述探针ALV-Probe和所述探针CIAV-Probe的工作浓度均为0.5μmol/L。
在进行所述二重LAMP扩增时，反应程序为：62℃反应60min，80℃灭活5min。
本发明尝试在不同病原体靶基因上的F1c和B1c引物之间设计带有不同荧光基团的探针，靶基因不断扩增导致探针不断裂解，阳性扩增产物在相应的发射波长通道内发光，根据不同颜色的荧光，能够准确的判定病原体，该方法具有以下特点：①特异性探针只与特异性模板发生特异性杂交，增加了反应的特异性，避免了假阳性②反应只需要60分钟，并可以在水浴锅完成反应，反应敏感高效；③不需开盖就能准确判定结果，污染小：本发明采用了两种荧光基团(FAM和CY5)，这两种荧光基团的发射波长不同，分别是520nm和670nm，本发明在完成反应后，只需要将反应管置于多色荧光系统内观察，在520nm通道下只能观察到ALV阳性反应管发出绿色荧光，而在670nm通道下也只观察到CIAV阳性反应管在呈红色荧光，两者互不干扰，并且其它病毒和阴性对照均不发光，因此能够准确判断结果。
本发明成功建立了鉴别检测ALV和CIAV可视化二重LAMP方法。该二重LAMP能够在在同一反应管里鉴别诊断ALV和CIAV，具有特异性好、敏感性高、污染小、方便快捷等优点，并且检测结果可直接用肉眼观察，根据反应产物颜色判断结果，适用于ALV和CIAV的临床快速筛查。
附图说明
图1为实时浊度仪650nm监测副产物磷酸镁曲线图。1.ALV cDNA；2.CIAV DNA；3.ALV和CIAV；4.阴性对照。
图2为二重荧光LAMP特异性试验结果。1.ALV cDNA；2.CIAV DNA；3.ALV和CIAV；4.FAdV-4；5.ARV；6.NDV；7.AIV-H5；8.AIV-H7；9.AIV-H9；10.AEV；11.REV；12.IBV；13.IBDV；14.MDV；15、16和17.阴性对照。
图3为二重荧光LAMP ALV单模板敏感性结果。1-7.106-100拷贝/μL，8.阴性对照；A.实时浊度仪650nm监测副产物磷酸镁曲线图；B多色荧光成像系统内在520nm和670nm通道下的结果图。
图4为二重荧光LAMP CIAV单模板敏感性结果。2-8.106-100拷贝/μL，1.阴性对照；A.实时浊度仪650nm监测副产物磷酸镁曲线图；B多色荧光成像系统内在530nm和694nm通道下的结果图。
图5为二重荧光LAMP CIAV和ALV混合模板敏感性结果。2-8.106-100拷贝/μL，1.阴性对照；A.反应产物在520nm和670nm通道下的结果图B.反应产物在520nm通道下的结果图C.反应产物在670nm通道下的结果图。
图6为临床检测样品在520nm和670nm双通道下的结果图。2、5.ALV阳性样品；4、5、6、9、10和12.CIAV阳性样品；1、3、7、8、11和13.阴性样品；14.阴性对照；15.ALV阳性对照；16.CIAV阳性对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
毒株和临床样品来源及处理：禽流感病毒(AIV)H5亚型毒株Duck/HK/313/78、H7亚型毒株Duck/HK/47/76和H9亚型毒株Duck/HK/147/77cDNA由香港大学惠赠；鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)毒株AV6获自中国兽药品检查所；禽脊髓脑炎病毒(AEV)毒株AE1163由美国康乃狄格州州立大学惠赠；新城疫病毒(NDV)毒株GX6/02、禽呼肠孤病毒(ARV)毒株S1133、禽网状内皮增生症病毒(REV)毒株GX131118、禽传染性支气管病毒(IBV)毒株GXIB/02、鸡马立克病病毒(MDV)毒株GX140301、禽4型腺病毒(FAdV-4)毒株GX0625、ALV A亚群毒株GX110521、ALV B亚群毒株GX111230和ALV J亚群毒株GX120081、鸡传染性贫血病毒毒株GXC060821由广西兽医研究所分离和保存；13份临床样品来源于广西某规模化鸡场采集的咽喉拭子和泄殖腔拭子，样品已经过本实验室普通PCR鉴定和测序鉴定；按照购自北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Viral DNA/RNA Kit(产品目录号：ER201-01)中的说明书提取不同病毒和临床样品的RNA和DNA，RNA病毒反转录成cDNA，将cDNA/DNA模板于-20℃保存备用。
上述各病毒毒株记载在如下几篇文献中，在符合生物安全操作的情况下，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用：
1、Zhixun Xie et al.Simultaneous typing of nine avian respiratorypathogens using anovel GeXP analyzer-based multiplex PCR assay.J VirolMethods,207,188-95Oct 2014.
2、Tingting Zeng et al.Simultaneous detection of eightimmunosuppressive chicken viruses using a GeXP analyser-based multiplex PCRassay.Virol J,12,226 2015Dec 30.
3、张民秀等.广西某健康鸡群Ⅰ群禽腺病毒的hexon蛋白loop 1基因遗传进化分析.《中国兽药杂志》2019年第8期.
4、谢志勤等.环介导等温扩增(LAMP)检测禽脑脊髓炎病毒方法的建立.《中国兽医学报》2013年第4期.
主要试剂和仪器：LAMP DNA扩增试剂盒(目录号：310005)和Loopamp LA-320C实时浊度仪购自荣研生物科技(中国)有限公司，EasyPure Viral DNA/RNAKit(目录号：ER201-01)为DNA/RNA共提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，反转录试剂盒(目录号：6210A)和pMD-18T(目录号：6011)购自宝日医生物技术(北京)有限公司；NanoDrop2000核酸测定仪购自Thermo Fisher Scientific公司；多色荧光成像系统购自美国BIO-RAD公司。
实施例1、二重LAMP引物的设计以及阳性质粒的制备
一、引物和探针的设计
根据GenBank中ALV(A、B和J亚型)的pol基因和CIAV VP2基因的保守序列，利用MEGA 4.0和Primer Explorer V4在线引物设计软件设计LAMP引物，其中外引物包括ALV-F3、ALV-B3、CAV-F3和CAV-B3，内引物包括ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP，内引物FIP＝F1c+F2，BIP＝B1c+B2；利用PrimerPrimer5.0分别在ALV和CIAV的F1c和B1c之间设计2条探针，分别是ALV-probe，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ3淬灭基团；CIAV-Probe，5’端标记CY 5荧光基团，3’端标记BHQ3淬灭基团。引物和探针序列如表1所示，内引物和外引物序列由引物由华大基因生物科技(深圳)有限公司合成，探针由宝日医生物技术(北京)有限公司合成。
本实验室检测ALV和CIAV的单重PCR引物如下：
ALV-F：5’-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3’；
ALV-R：5’-CGAACCAAAGGTAACACACG-3’。
CIAV-F：5’-CTAAGATCTGCAACTGCGGA-3’；
CIAV-R：5’-CCTTGGAAGCGGATAGTCAT-3’。
引物由华大基因生物科技(深圳)有限公司合成。
表1二重荧光LAMP引物和探针序列
二、阳性质粒标准品的制备
分别使用外引物ALV-F3、ALV-B3和CIAV-F3、CIAV-B3对阳性ALV cDNA和CIAV DNA模板扩增截短的目的基因，目的片段大小分别是217bp(SEQ ID No.11)和201bp(SEQ IDNo.12)，扩增后的PCR阳性产物连接到pMD-18T载体，构建重组质粒，提取阳性质粒。利用NanoDrop ND-2000紫外分光光度计测量ALV和CIAV的阳性重组质粒浓度，再根据分子量及浓度计算拷贝数。
含有SEQ ID No.11所示DNA片段的重组质粒命名为pMD-ALV，为ALV阳性质粒。含有SEQ ID No.12所示DNA片段的重组质粒命名为pMD-CIAV，为CIAV阳性质粒。
实施例2、二重LAMP方法的建立
一、反应体系
2μL DNA/cDNA模板，2×Reaction Mix 10μL，Bst DNApolymerase 0.8μL，内引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP(工作浓度均为40μmol/L)各0.8μL，外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3(工作浓度均为5μmol/L)各0.4μL，ALV-Probe(工作浓度为0.5μmol/L)0.4μL，CIAV-Probe(工作浓度为0.5μmol/L)0.8μL加ddH2O补足20μL后，将反应管置恒温仪或Loopamp LA-320C实时浊度仪62℃反应60min，80℃灭活5min，试验结束后将反应管直接置多色荧光成像系统内判定。
二、可视化二重LAMP结果判定
可视化二重LAMP通过实时浊度仪监测浊度的方法判断扩增结果后，将反应管置于多色荧光成像系统内，选择多通道凝胶成像，由于ALV-Probe 5’端标记的荧光基团为FAM，通道1选择520nm为发射波长，ALV阳性产物反应管在该通道显示的是绿色荧光，阴性对照管无绿色荧光；CIAV-Probe 5’端标记的荧光基团为CY5，通道2则选择670nm的发射波长，CIAV阳性产物反应管在该通道下显示的是红色荧光，阴性对照管无红色荧光；当反应管中既有ALV阳性扩增产物又有CIAV阳性扩增产物时，反应管在两个通道下均能发出荧光，该反应管显示的是橘黄色。
实施例3、特异性试验
待测样本：阳性ALV(A亚群、B亚群和J亚群的混合模板)、CIAV、ALV和CIAV混合模板、FAdV-4、ARV、NDV、AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9、AEV、REV、IBV、IBDV和MDV的cDNA或DNA模板。
以待测样本作为模板，按照实施例2建立的方法进行二重LAMP扩增。
设置无RNase水为阴性对照。
将阳性ALV的cDNA和CIAV的DNA作为模板，设置无RNase水为阴性对照，将反应管置于Loopamp LA-320C实时浊度仪反应，结果显示ALV的cDNA和CIAV的DNA均出现扩增(图1)。将阳性ALV(A亚群、B亚群和J亚群的混合模板)、CIAV、ALV和CIAV混合模板、FAdV-4、ARV、NDV、AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9、AEV、REV、IBV、IBDV和MDV的cDNA或DNA作为模板，并且设置无RNase水为阴性对照，进行特异性试验，结果表明ALV阳性反应管在520nm通道下呈绿色荧光，CIAV阳性反应光在670nm通道下呈红色荧光，ALV和CIAV的混合模板在两个通道下均呈现相应的荧光，混合色呈橘黄色，其它病毒和阴性对照均未扩增和发光，见图2。
实施例4、灵敏度分析
一、单一病原体模板的灵敏度分析
将实施例1制备好的ALV和CIAV重组质粒pMD-ALV和pMD-CIAV按照计算出的拷贝数分别梯度稀释为106、105、104、103、102、101和100拷贝/μL。
按照实施例2建立的方法，取不同浓度的重组质粒2μL依次加入到反应管中，混匀后放置到Loopamp LA-320C实时浊度仪中进行反应。
设置无RNase水为阴性对照。
结果显示：用本发明建立的二重荧光LAMP分别检测单模板ALV和CIAV的敏感性，实时浊度仪监测浊度结果显示单独检测ALV或CIAV模板的下限均为102拷贝/μL(图3中A和图4中A)，同时将在实时浊度仪反应结束后的反应管置于多色荧光成像系统内，荧光结果也显示在单模板存在的情况下，两种病原体的最低检测下限也为102拷贝/μL(图3中B和图4中B)。
二、2种病原体模板同时检测的灵敏度
将ALV和CIAV阳性质粒pMD-ALV和pMD-CIAV等量混合，将混合质粒梯度稀释为106、105、104、103、102、101和100拷贝/μL。
按照实施例2建立的方法，取不同浓度的重组质粒2μL依次加入到反应管中，混匀后放置到Loopamp LA-320C实时浊度仪中进行反应。
设置无RNase水为阴性对照。
结果显示：同时检测ALV和CIAV两种模板时，ALV模板的检测下限时为100拷贝/μL，而CIAV模板的检测下限时为1000拷贝/μL(图5)。
实施例5、临床样品的检测
使用本发明实施例2建立的二重LAMP对13份临床样品进行检测，将检测结果与本实验室检测这两种病毒的常用单重PCR方法进行比较，验证本方法的可靠性。
无RNase水为模板设置阴性对照。
设置以ALV阳性质粒pMD-ALV和CIAV阳性质粒pMD-CIAV分别替代模板为阳性对照。
结果显示：运用本发明建立的可视化二重LAMP对已经经过普通单重PCR鉴定的13份已知样品进行鉴定，检测结果和本实验室所用的ALV和CIAV检测引物的检测结果相符，符合率为100％(图6)。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 可视化二重LAMP鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的方法
<130> GNCLN192573
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tagaatggcc ccccgttc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
tgctatcccc catctcgc 18
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
tgtgacacga ccatgctgag ttctggctcg ctgttactgt g 41
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
cgttttggga agaccaaagg ccctcgcgtg gatttagacg t 41
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ccctcgaaga agcgatcct 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
cgtcgaagtc gcttgagg 18
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
ggtcggctgg gagtagtggt aaccctccga gtacagggta a 41
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
gatggcaaga cgagctcgca gccaccgtcc tcttctga 38
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
acatcattgg gccacggcta tcg 23
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
ccgaaccgca agaaggtgta taagactgt 29
<210> 11
<211> 217
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
tagaatggcc ccccgttcct ggctcgctgt tactgtggat accgcctcat cggcgatagt 60
cgtaactcag catggccgtg tcacatcggt tgctgcacaa catcattggg ccacggctat 120
cgccgttttg ggaagaccaa aggccataaa aacagataac gggtcctgct tcacgtctaa 180
atccacgcga gagtggctcg cgagatgggg gatagca 217
<210> 12
<211> 201
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
ccctcgaaga agcgatcctg cgacccctcc gagtacaggg taagcgagct aaaagaaagc 60
ttgattacca ctactcccag ccgaccccga accgcaagaa ggtgtataag actgtaagat 120
ggcaagacga gctcgcagac cgagaggccg attttacgcc ttcagaagag gacggtggca 180
ccacctcaag cgacttcgac g 201

Claims (7)

1.用于鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的二重LAMP单链DNA组，由单链DNA组I和单链DNA组II组成；
所述单链DNA组I由引物组I和探针ALV-Probe组成；
所述引物组I由引物ALV-F3、引物ALV-B3、引物ALV-FIP和引物ALV-BIP组成；
所述引物ALV-F3为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；
所述引物ALV-B3为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；
所述引物ALV-FIP为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；
所述引物ALV-BIP为SEQ ID No.4所示的单链DNA分子；
所述探针ALV-Probe为SEQ ID No.9所示的单链DNA分子；
所述单链DNA组II由引物组II和探针CIAV-Probe组成；
所述引物组II由引物CIAV-F3、引物CIAV-B3、引物CIAV-FIP和引物CIAV-BIP组成；
所述引物CIAV-F3为SEQ ID No.5所示的单链DNA分子；
所述引物CIAV-B3为SEQ ID No.6所示的单链DNA分子；
所述引物CIAV-FIP为SEQ ID No.7所示的单链DNA分子；
所述引物CIAV-BIP为SEQ ID No.8所示的单链DNA分子；
所述探针CIAV-Probe为SEQ ID No.10所示的单链DNA分子；
所述探针ALV-Probe的5’端连接有荧光基团A，3’端连接有淬灭基团A；
所述探针CIAV-Probe的5’端连接有荧光基团B，3’端连接有淬灭基团B；
所述荧光基团A为FAM，所述淬灭基团A为BHQ3；
所述荧光基团B为CY5，所述淬灭基团B为BHQ3。
2.含有权利要求1所述单链DNA组的试剂盒。
3.权利要求1所述单链DNA组或权利要求2所述试剂盒在如下任一中的应用：
（e2）制备用于鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的产品；
（e4）制备用于检测待测病原微生物是否为禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的产品；
（e6）制备用于检测待测样本中是否含有禽白血病病毒和/或鸡传染性贫血病毒的产品。
4.权利要求2所述试剂盒的制备方法，包括将各条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
5.一种鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的非疾病诊断方法，包括如下步骤：提取待测病毒的核酸；以所述核酸为模板，采用权利要求1所述单链DNA组进行二重LAMP扩增，然后进行如下判断：如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团A对应的荧光，则所述待测病毒为禽白血病病毒；如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团B对应的荧光，则所述待测病毒为鸡传染性贫血病毒。
6.一种检测病原微生物是否为禽白血病病毒或鸡传染性贫血病毒的非疾病诊断方法，包括如下步骤：提取待测病原微生物的核酸；以所述核酸为模板，采用权利要求1所述单链DNA组进行二重LAMP扩增，然后进行如下判断：如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团A对应的荧光，则所述待测病原微生物为禽白血病病毒；如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团B对应的荧光，则所述待测病原微生物为鸡传染性贫血病毒；如果反应产物既不能够检测到具有所述荧光基团A对应的荧光，也不能够检测到具有所述荧光基团B对应的荧光，则所述待测病原微生物既不为禽白血病病毒，也不为鸡传染性贫血病毒。
7.一种检测待测样本中是否含有禽白血病病毒和/或鸡传染性贫血病毒的非疾病诊断方法，包括如下步骤：提取待测样本的核酸；以所述核酸为模板，采用权利要求1所述单链DNA组进行二重LAMP扩增，然后进行如下判断：如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团A对应的荧光，则所述待测样本中含有禽白血病病毒；如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团B对应的荧光，则所述待测样本中含有鸡传染性贫血病毒；如果反应产物能够检测到具有所述荧光基团A对应的荧光，且能够检测到具有所述荧光基团B对应的荧光，则所述待测样本中既含有禽白血病病毒，也含有鸡传染性贫血病毒；如果反应产物既不能检测到具有所述荧光基团A对应的荧光，也不能检测到具有所述荧光基团B对应的荧光，则所述待测样本中既不含有禽白血病病毒，也不含有鸡传染性贫血病毒。
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