CN103627818A - 检测主要亚型禽白血病病毒的lamp试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒,采用环介导等温扩增(LAMP)技术,并根据根据禽白血病病毒POL基因序列设计了两对特异性引物(内引物FIP和BIP、外引物F3和B3)。应用本发明及其建立的检测方法,利用LAMP实时浊度仪对ALVLAMP反应引物、反应体系及反应进程进行实时、定量、全程密闭监控分析,实现了高效、特异性扩增ALV的LAMP引物。本发明具有特异性强、灵敏度高、迅速得出结果、不造成污染、可实时检测产物等优点,只需按建立的体系加样即可实时检测出禽白血病病毒,快速准确的获得检测结果,为简便、快速地检测禽白血病病毒带来便利。
Description
技术领域
本发明属于禽白血病病毒检测技术领域,尤其涉及一种检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒。
背景技术
禽白血病病毒(ALV)根据其宿主范围、不同亚型的干扰情况及其囊膜中和抗原特性,可将其分为A到J10个亚型,鸡群中常见为A、B、J和E亚型。禽白血病自在中国出现并流行以来,一直受到临床兽医、养殖业者以及科研人员的高度关注,在现实生产中急需该病的普查及净化的技术手段。虽然目前有检测ALV的多种方法报道,如酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化等,检测核酸的有定量竞争PCR、原位PCR、RT-PCR等,然而传统PCR检测需要经过变性—退火—延伸,加上DNA提取整个过程大概需要2-4小时才能得出结果。这些方法在成本、灵敏度、操作方便性上存有缺陷,一定程度上限制了它们在生产中的实际应用。LAMP作为一种新的核酸扩增技术,较其它分子生物学检测方法而言具有试验条件低、灵敏度高和特异性强等优势,在医学微生物的检测中受到亲睐并推广应用。尽管如此,以往技术中所用的LAMP方法检测仍需要1小时后加入染料才能判断结果,反应中加入的荧光染料syber-green,需采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像,存在开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染,缺乏对反应的实时监控很难排除这些干扰因素,不能对检测结果做出准确的判定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、简便快速的检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒,以便于基层实时、快速、准确地检测禽白血病病毒。
为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒,该试剂盒含有以下试剂:2×反应缓冲液、引物、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、禽白血病病毒阳性模板和超纯水;引物包括内引物FIP和BIP、外引物F3和B3,
内引物FIP的序列为CTACATTAGTGGGCGCTGTCGGAACAACTGGAAGCACGCG,
内引物BIP的序列为TCAAGATGGGACAGGAGGGAGTTTTGGCTTAACGCATCCTCT;
外引物F3的序列为TGATTTGGGGGCAAGTGTAC;
外引物B3的序列为ATGACTCCGCACGTGGAG。
该试剂盒每剂含有2×反应缓冲液12.5μl、引物FIP和BIP各40pmol、引物F3和B3各5pmol、Bst DNA聚合酶1μl、荧光目视检测试剂0.2μl和禽白血病病毒阳性模板2μl。
2×反应缓冲液来自loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒;荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光染料,来自loopamp荧光目视检测试剂盒。
本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术,并根据禽白血病病毒POL基因序列设计了两对特异性引物(内引物FIP和BIP、外引物F3和B3),由此发明了检测主要亚型禽白血病病毒(禽白血病病毒ALV的主要亚型A、B、E、J)的LAMP试剂盒。本发明提供的LAMP试剂盒及其检测方法,利用LAMP实时浊度仪对ALVLAMP反应引物、反应体系及反应进程进行实时、定量、全程密闭监控分析,实现了高效、特异性扩增ALV的LAMP引物,建立了可视化的检测禽白血病的LAMP方法,它只能从禽白血病阳性样本中进行核酸的特异性扩增,不与其它常见家禽病原发生非特异性反应。应用本发明只需按建立的体系加样即可实时检测出禽白血病病毒,快速准确的获得检测结果,为简便、快速地检测禽白血病病毒带来便利。
与传统检测手段相比,本发明具有以下优点:
<1>特异性强——所检测的阴性对照株均无阳性结果出来,与PCR检测结果一致。
<2>灵敏度高——普通PCR检测方法的灵敏度为103copies/μL数量级,而本发明检测限约为20copies/μL,是普通PCR的100倍左右。
<3>迅速得出结果——普通PCR整个过程在2-4小时左右才能得出结果,一般LAMP方法也要1小时,本发明提供的检测方法反应在25-35min间即出现扩增。
<4>不造成污染——用于观察的荧光染料为反应前加入,加入的商用染料钙黄绿素(来自loopamp荧光目视检测试剂盒,非syber-green),且检测过程无需开盖。
<5>可实时检测产物——利用Tubidimeter real-time LA-320浊度仪可实时分析LAMP反应的结果,达到实时监测判断产物的目的。
附图说明
图1是本发明LAMP检测方法的特异性检测结果,图中:1ALV-A,2ALV-B,3ALV-E,4ALV-J,5MDV,6REV,7AILT。
图2是本发明LAMP检测方法的敏感性检测结果,图中:12×100copies/μL,22×101copies/μL,32×102copies/μL,42×103copies/μL,52×104copies/μL,62×105copies/μL,72×106copies/μL,82×107copies/μL。
图3是本发明LAMP检测方法的荧光可视化检测结果,图中:左管为以禽白血病病毒为模板的反应情况,右管为阴性对照。
具体实施方式
1、材料的准备
禽白血病病毒A亚型、B亚型、E亚型、J亚型均为为广西大学禽病室保存。LAMP法DNA扩增试剂盒(loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒)购自北京蓝谱生物科技有限公司。
2、LAMP引物的设计与合成
根据GenBank中禽白血病病毒POL基因序列,利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorer V4软件设计得一套LAMP引物,其中F3/B3为外引物,FIP/BIP为内引物,具体如下:
内引物FIP的序列为CTACATTAGTGGGCGCTGTCGGAACAACTGGAAGCACGCG(见序列表SEQ.ID.No.1),
内引物BIP的序列为TCAAGATGGGACAGGAGGGAGTTTTGGCTTAACGCATCCTCT(见序列表SEQ.ID.No.2);
外引物F3的序列为TGATTTGGGGGCAAGTGTAC(见序列表SEQ.ID.No.3);
外引物B3的序列为ATGACTCCGCACGTGGAG(见序列表SEQ.ID.No.4)。
3、病毒的DNA提取
取待检病毒液或研磨好的病料,12000rpm离心2min,吸取上清100μL后,按基因组DNA提取试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司,Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒)说明书提取模板DNA。
4、LAMP反应体系建立及具体操作步骤
参考DNA扩增试剂盒说明书,按25μl体系配置:
其中,2×反应缓冲液来自loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒;所述荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光染料,来自loopamp荧光目视检测试剂盒。
LAMP反应在实时浊度仪(LA-320C,日本荣研公司)进行密闭全程监控,浊度仪时间监测扩增情况,反应温度以DNA扩增试剂盒推荐的63℃做为反应温度。
5、LAMP检测方法
1)特异性检测
分别提取A亚型、B亚型、E亚型、J亚型禽白血病病毒、马立克病毒(MDV)、禽网状内皮增生病毒(REV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)进行LAMP扩增,检验LAMP方法的特异性,实时监测试验进程进行结果判定。
结果如图1所示,A亚型、B亚型、E亚型、J亚型禽白血病病毒在25分钟左右出现浊度的上升曲线,为阳性结果,3株阴性对照反应管曲线均无扩增情况出现,LAMP呈阴性结果。
2)敏感性检测
测定敏感度时,将经过测序验证后作为ALV-J LAMP的质粒标准品,命名为ALV-JPOL。测序验证后的质粒用紫外分光光度计测其OD260,按公式换算成摩尔浓度后,-20℃保存,用前10倍稀释,梯度浓度分别为2×107copies/μL(原始毒株浓度)、2×106copies/μL、2×105copies/μL、2×104copies/μL、2×103copies/μL、2×102copies/μL、2×101copies/μL、2×100copies/μL,用基因组DNA试剂盒分别提取DNA后,进行扩增。
结果如图2所示,LAMP法细菌纯培养物检测限约为2×101copies/μL
3)荧光可视化检测
根据浊度仪监控优化的条件,加入荧光染料,荧光染料在反应前加入,加入的染料为钙黄绿素商用染料,63℃下反应25-30分钟后,在紫外灯下观察。
图3为观察结果,左管为以禽白血病病毒为模板的反应情况,右管为阴性对照,表明上述建立的方法可以方便基层使用,只需使用商品化试剂配合本发明设计的LAMP引物,加入样品后,用低廉的水浴锅来操作,即可快速观察结果,且无需开盖,避免了污染。
6、LAMP试剂盒的组装
根据上述研究结果,组装检测试剂盒以方便使用。该试剂盒含有以下试剂:2×反应缓冲液、引物、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、禽白血病病毒阳性模板和超纯水;引物包括内引物FIP和BIP、外引物F3和B3。
LAMP反应体系按25μl配置,该试剂盒每剂含有2×反应缓冲液12.5μl、引物FIP和BIP各40pmol、引物F3和B3各5pmol、Bst DNA聚合酶1μl、荧光目视检测试剂0.2μl、待测样品模板(或禽白血病病毒阳性模板)2μl,余量用超纯水补足。
其中,2×反应缓冲液来自loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒;荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光染料,来自loopamp荧光目视检测试剂盒。
Claims (3)
1.一种检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒,其特征在于该试剂盒含有以下试剂:
2×反应缓冲液、引物、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、禽白血病病毒阳性模板和超纯水;所述引物包括内引物FIP和BIP、外引物F3和B3,
内引物FIP的序列为CTACATTAGTGGGCGCTGTCGGAACAACTGGAAGCACGCG,
内引物BIP的序列为TCAAGATGGGACAGGAGGGAGTTTTGGCTTAACGCATCCTCT;
外引物F3的序列为TGATTTGGGGGCAAGTGTAC;
外引物B3的序列为ATGACTCCGCACGTGGAG。
2.根据权利要求1所述的检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒,其特征在于该试剂盒每剂含有2×反应缓冲液12.5μl、引物FIP和BIP各40pmol、引物F3和B3各5pmol、Bst DNA聚合酶1μl、荧光目视检测试剂0.2μl和禽白血病病毒阳性模板2μl。
3.根据权利要求1所述的检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒,其特征在于:所述2×反应缓冲液来自loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒;所述荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光染料,来自loopamp荧光目视检测试剂盒。
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