CN103074447A

CN103074447A - 一种快速鉴别诊断不同血清型禽白血病病毒pcr-hrm分析方法的建立

Info

Publication number: CN103074447A
Application number: CN2013100120456A
Authority: CN
Inventors: 郭鹏举; 张建峰; 张春红; 嘎利兵嘎
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-01-11
Filing date: 2013-01-11
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2033-01-11
Also published as: CN103074447B

Abstract

本发明公开了一种快速鉴别诊断不同血清型禽白血病病毒PCR-HRM分析方法的建立。本发明的通用引物，简并性好，对禽白血病病毒A、B、C、D和E亚型均有很好地的扩增性，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间；本发明的特异性引物，特异性好，可以特异性扩增出J亚型。对使用本发明引物得到的扩增产物进行HRM分析，与已知亚型的标准HRM曲线进行比对，就可以准确、快速、高通量地进行禽白血病病毒分型，特别是可以快速、准确地区分内源型和外源型禽白血病病毒。

Description

一种快速鉴别诊断不同血清型禽白血病病毒PCR-HRM分析方法的建立

技术领域

本发明涉及一种病毒研究方法，特别涉及一种禽白血病病毒的研究方法。

背景技术

禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病／肉瘤病毒群病毒(Avian Leukosis／sarcoma virus，AL／SV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。根据临床症状可分为淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成髓细胞白血病、髓细胞样白血病、结缔组织性肿瘤和骨硬化病等，其中以淋巴白血病最为常见。禽白血病病毒可分为A、B、C、D、E 和J 共6个亚型。其中，A、B、C、D 和J 亚型为外源性病毒，而C、D 亚型在自然状态下很少存在，E 亚型病毒为极普遍存在的内源性病毒。在我国，外源性禽白血病病毒主要为J亚型， A、B亚型报道较少。

至今，人类对禽白血病的防治几乎仍无计可施，世界各国控制禽白血病的主要方法是通过早期反复多次的病原检测，淘汰阳性鸡（A、B、J亚型），从而净化种群达到局部消灭本病的目的。因此，及时准确的对禽白血病病毒进行诊断及分型，特别是区分其内源型和外源型，有助于确定该病毒的流行趋势，进而采取相应的措施加以控制。

目前，禽白血病病毒鉴定及血清分型的方法有许多种，包括病毒的分离与鉴定、ELISA方法和PCR技术等等，但这些方法均难以快速有效地对病毒进行分型。究其原因，主要是检测技术的敏感性、准确性及检测操作复杂化（内源性病毒的干扰需经细胞培养才能消除，从而导致工作量巨大）影响了疫病的检测及净化。现有的检测方法介绍如下：

病毒的分离与鉴定

病毒分离鉴定是诊断禽白血病最为有效、可靠的技术。用于病毒分离的理想材料为血浆、粪便、蛋清、胚胎、精液、和羽髓。将被检材料经适当处理后，接种于DF-1细胞。由于只有外源性ALV在DF-1细胞上生长，既可用P27 ELISA试剂盒来检测有无病毒生长。而内源性ALV不能在DF-1细胞上生长，从而可区分内源和外源病毒的感染。

病毒分离检测技术最大的缺点是费时、昂贵，不易对大量样品进行检测。即使在最适宜条件下，从取样到出结果至少需要10天。此外，即使病毒分离技术可以方便的应用于诊断鸡只的感染，也很难确保鸡体内不存在有潜伏感染的病毒，更不能排除鸡只发生再感染的可能。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA 检测技术的优点是廉价、快速，适用于包括蛋清、血清、胎粪、泄殖腔棉拭子等多种样品的检测。1979 年，Smith 用兔抗禽白血病衣壳蛋白p27建立了检测ALV抗原的双抗夹心ELISA 法。目前，ALV 抗原诊断试剂盒已实现商品化。这种检测技术最大的缺点是检测结果不时出现假阳性，因为双抗夹心ELISA只检测该病毒的一种蛋白质：p27，利用该技术检测出的阳性结果仅能说明待检样品中含有p27，而p27是禽白血病的群特异性抗原，在内源性病毒和外源性病毒中均属保守的一种蛋白质，利用双抗夹心ELISA所检测出的阳性结果并不能证实这种蛋白来源于外源性病毒。因此，在检测外源性病毒时常出现一定数量的假阳性结果。

虽然市场上已经有用于检测ALV-AB亚群抗体和ALV-J亚群抗体的ELISA 试剂盒出售，但是由于ALV-J亚群病毒的抗原变异率很高，因此对于某株J亚群病毒具有结合作用的抗体并不能与所有ALV-J的其它分离株结合。因此，在使用ELISA方法进行感染诊断时，也容易出现假阴性结果，影响其准确性。此外，禽白血病的病毒血症与抗体产生不同步，ELISA只能检测ALV的抗体水平，即使检测是阳性样品，只能说明曾经感染过 ALV，不能判断鸡群中现在是否还存在 ALV 的感染。

聚合酶链式反应（PCR）

直接从病变组织、肿瘤或细胞提取物中提取病毒 RNA 或者前病毒DNA，利用 PCR 的方法来检测 ALV 已经成为实验室诊断的常规手段，可以区分鉴别不同亚群的 ALV 。绝大部分设计引物的区域位于 env 和LTR 序列。现已有一些特异性的引物可以检测绝大部分的 ALV 分离株，也有用于检测细胞培养中感染的内源性E亚群病毒。

PCR检测技术虽然特异性高，但是该方法是根据 PCR 扩增产物的电泳条带大小来分析不同亚群，所以该方法目前还做不到高通量的检测任务，而亚群特异性探针价格昂贵也限制了荧光定量PCR检测方法的实际应用。

因此，目前急需一种操作相对简易、检测结果可靠且检测成本低廉的禽白血病快速分型方法用于规模化种鸡厂禽白血病病毒的分型研究。

发明内容

本发明的目的在于提供2对用于禽白血病病毒分型的引物。

本发明的另一个目的在于提供一种禽白血病病毒分型鉴别方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种鉴别不同亚型禽白血病病毒的引物，包括两对引物，分别为通用引用P1和P2，以及J亚型特异引物P3和P4，其中：

P1：CCTTGCTGCCAACGACACTTA（SEQ ID NO：1）

P2：GAACCTARCAGYTGTAGTC（SEQ ID NO：2）

P3：CAGGAAACGTGTGGGTCACC（SEQ ID NO：3）

P4：TTATTGGACTTACCATCG（SEQ ID NO：4）。

一种快速鉴别不同亚型禽白血病病毒的方法，包括如下步骤：

1) 从样品中提取病毒RNA，并反转录为cDNA；

2) 以cDNA为模板，分别加入上述扩增引物对和荧光饱和染料进行扩增；

3) 对扩增产物直接进行HRM分析，确定病毒的亚型；

其中，所使用的引物为上述的引物P1～P4。

进一步的，通用引物扩增的反应体系为：

ddH₂O 2.4μl

Premix Taq 5μl

上游引物（P1） 0.4μl

下游引物（P2） 0.4μl

模板 0.8μl

LC green染料 1μl

Total 10μl。

进一步的，J亚型特异引物扩增的反应体系为：

ddH₂O 2.4μl

Premix Taq 5μl

上游引物（P3） 0.4μl

下游引物（P4） 0.4μl

模板 0.8μl

LC green染料 1μl

Total 10μl。

进一步的，上述两个扩增的反应程序为：

94℃预变性5min；

94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；

72℃终延伸8min。

本发明的有益效果是：

本发明的通用引物，简并性好，对禽白血病病毒A、B、C、D和E亚型均有很好地的扩增性，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间；本发明的特异性引物，特异性好，可以特异性扩增出J亚型。对使用本发明引物得到的扩增产物进行HRM分析，与已知亚型的标准HRM曲线进行比对（利用构建的标准质粒作图），就可以准确、快速、高通量地进行禽白血病病毒分型，特别是可以快速、准确地区分内源型和外源型禽白血病病毒。

本发明方法，具有如下优点：

操作简单：只需 PCR 反应之前加荧光饱和染料即可；

Figure 2013100120456100002DEST_PATH_IMAGE004

检测速度快且高通量：5～10分钟即可完成96/384孔板的 PCR 产物检测，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了检测时间；

Figure 2013100120456100002DEST_PATH_IMAGE006

对病源物进行HRM分析，可直接反应当前感染状态，有利于后续的流行病学研究。

Figure 2013100120456100002DEST_PATH_IMAGE008

通过分析HRM熔解曲线形状即可区分外源性和内源性ALV病毒，避免了由于群特异性ALV-P27抗原检测而造成的假阳性。可对ALV分子进化进行动态监测。

Figure 2013100120456100002DEST_PATH_IMAGE012

费用低，不需要特异性探针，每个样品的饱和染料成本为1.6 RMB ；

Figure 2013100120456100002DEST_PATH_IMAGE014

准确性高95%、特异性好99 %（片段长度400～1kb），重复性达到100%。

附图说明

图1是不同亚型禽白血病病毒质粒PCR的电泳图；

图2是ALV的模拟峰型化熔解曲线图；

图3是ALV 质粒样品标准化熔解曲线图；

图4是ALV质粒样品峰型化熔解曲线图；

图5是ALV 质粒样品差异化熔解曲线图；

图6是ALV 临床样品cDNA标准化熔解曲线图；

图7是ALV 临床样品cDNA峰型化熔解曲线图；

图8是ALV 临床样品cDNA差异化熔解曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明。

禽白血病病毒RNA的提取：

用试剂盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0提取病料样品中的禽白血病病毒RNA。病料样品可以是全血、血浆、蛋清、泄殖腔拭子等易于获得且对动物体无严重伤害的样品，病料样品还可以是组织样本，如脾脏、胸腺等。

禽白血病病毒RNA的反转录：

用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒对禽白血病病毒RNA进行反转录（为了进一步保证后续HRM分析，简化结果的对比分析，可用核酸蛋白分析仪测定反转录得到的cDNA浓度，使PCR起始模板浓度相对一致）。

反转录的具体操作为：

取2支PCR管分别加入2μL RNA然后用高压灭菌水补齐到11μL，一支管加入2μL引物P2，另一支管加入2μL引物P4各构成13μL 体系，70℃ 10min。取出冰上急冻2min；；

配制反转录体系，每管中加入

Figure 2013100120456100002DEST_PATH_IMAGE016

共计7μL，与之前的13μL 构成20μL 体系。将各组分混匀，42℃ 孵育60min,95℃ 变性 5min。产物-20℃保存。

为了进一步验证本发明方法可行性与可靠性，同时构建标准质粒，保存各亚型质粒序列（经序列测定正确），之后扩增保存的质粒序列进行HRM分析作为标准对照。

标准质粒样品的制备：

取经过测序确定分别为A、B、E、J亚型的禽白血病病毒，分别进行反转录为cDNA；

将反转录得到的禽白血病病毒cDNA进行PCR扩增，纯化；

用TaKaRa公司的试剂盒将纯化后的cDNA连接至pMD-18T载体中，

载体连接反应体系（10μl）：

Figure 2013100120456100002DEST_PATH_IMAGE018

反应条件：16℃，4h以上。

取-70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物5μl，轻轻混匀，冰浴30min。42℃水浴热激90sec，再迅速放回冰上2min。加入400μl LB液体培养基，37℃ 200r/min-220r/min振荡培养45min后，以恢复质粒的抗性。4℃ 4000r/min离心5min，弃去上清400μl，将剩余的100μl菌液混匀后涂氨苄平板，37℃培养30min（平皿正放），待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12h－16h，至单菌落出现。用灭菌牙签挑取单菌落于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中12h－16h。

质粒的抽提：用TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒提取质粒。

质粒PCR扩增

通用引物PCR反应体系：10μl

Figure 2013100120456100002DEST_PATH_IMAGE020

J亚型特异性引物PCR反应体系：10μl

Figure 2013100120456100002DEST_PATH_IMAGE022

PCR反应程序：

94℃预变性5min；

94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；

72℃终延伸8min。

将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，其电泳图如图1所示。图中，Marker：DL1000 DNA marker，J1、A1、B1、E1为待检样品，分别代表J、A、B、和E四个亚型，H₂O(1)为J引物阴性对照，H₂O(2)为通用引物阴性对照；从图中可以看出，通用引物扩增出大小为480bp左右的目的条带，但A1、B1和E1电泳条带大小相似无法分辨。J亚型特异引物扩增出大小为540bp左右的目的条带并与其它三个亚群有明显的区别。

扩增产物的模拟HRM分析

将两对引物所要扩增的四种不同亚型env序列通过HRM模拟软件模拟，其模拟HRM曲线如图2所示。从模拟图可以看出，不同亚型的病毒可以通过HRM区分，表明所选取的env序列可以区分禽白血病病毒不同亚型。

质粒PCR扩增产物的HRM分析

PCR扩增产物用Light Scanner96 HRM分析仪进行分析。禽白血病病毒四种不同亚型毒株env序列（ALV-A1、ALV-B1、ALV-J1和ALV-E1）HRM 分析图见图3-5。图3、图4和图5分别为标准化熔解曲线图、峰型化熔解曲线图和差异化熔解曲线图。从3种不同形式的熔解曲线图上可看出禽白血病四个亚型HRM图相互分开，已达到ALV病毒基因分型鉴别目的。标准化熔解曲线图是由原始熔解曲线图经过标准化处理后得到，最大限度地消除了由于起始模板浓度不同而造成荧光信号值的差异。峰型化熔解曲线图是对标准化熔解曲线图进行导数化处理后得到，峰型化熔解曲线图更加明显地反应出了四个亚型env序列的差异。

为了更好地区分禽白血病内源性E亚型（禽类本身携带）和其它3个外源性亚型（尤其A亚型），对熔解曲线图进行差异化处理，即使E亚型的信号变化设为零并与其它3个亚型比较。从图4上可看出外源性和内源性ALV明显地分开。以上3种不同形式的熔解曲线图是由Light Scanner96软件完成。

A和E亚型HRM模拟图和质粒样品熔解曲线图有一定的差异，这是由于通用引物使用了简并引物而造成，但对HRM判别无影响。因为实际样品的分析是根据质粒HRM图为参考标准。在每次HRM分析中，若HRM数据库中无对应的参考标准图，则优先建立质粒样本的HRM数据，并测序。通过HRM数据库的不断完善和扩充对ALV进行基因分型并实时监测ALV的分子进化趋势。

实际样品（反转录cDNA）的HRM检测：

cDNA的PCR扩增与上述的质粒PCR扩增操作相同，每个cDNA样品重复3次。HRM结果分别如图6～8所示。从图6～8可以看出，同一样品具有基本相同的HRM曲线，说明本发明方法具有很好地稳定性性和可重复性。不同亚型的病毒HRM曲线具有很好地符合性，病毒的模拟熔解曲线、质粒PCR熔解曲线和cDNA熔解曲线的峰形基本相同，具有很好的符合性。

从不同样品的HRM结果来看，不同亚型的禽白血病病毒具有特异性的HRM曲线，且该HRM曲线具有很好的稳定性，通过简单对比，可以区分ALV不同病毒亚型，而且能快速有效地鉴别ALV内源性和外源性病毒亚型。

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种快速鉴别诊断不同血清型禽白血病病毒PCR-HRM分析方法的建立

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

ccttgctgcc aacgacactt a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

gaacctarca gytgtagtc 19

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

caggaaacgt gtgggtcacc 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

ttattggact taccatcg 18

Claims

1.鉴别不同亚型禽白血病病毒的引物，包括两对引物，分别为通用引用引物P1和P2（扩增A、B、C、D和E亚型），以及J亚型特异引物P3和P4，其中：

P1：CCTTGCTGCCAACGACACTTA（SEQ ID NO：1）

P2：GAACCTARCAGYTGTAGTC（SEQ ID NO：2）

P3：CAGGAAACGTGTGGGTCACC（SEQ ID NO：3）

P4：TTATTGGACTTACCATCG（SEQ ID NO：4）。

2.一种快速鉴别不同亚型禽白血病病毒的方法，包括如下步骤：

1) 从样品中提取病毒RNA，并反转录为cDNA；

2) 以cDNA为模板，加入上述扩增引物对和荧光饱和染料进行扩增；

3) 对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的亚型；

其中，所使用的引物如权利要求1所述。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：通用引物扩增的反应体系为：

ddH₂O 2.4μl

Premix Taq 5μl

上游引物（P1） 0.4μl

下游引物（P2） 0.4μl

模板 0.8μl

LC green染料 1μl

Total 10μl。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：J亚型特异引物扩增的反应体系为：

ddH₂O 2.4μl

Premix Taq 5μl

上游引物（P3） 0.4μl

下游引物（P4） 0.4μl

模板 0.8μl

LC green染料 1μl

Total 10μl。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：扩增的反应程序为：

94℃预变性5min；

94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；

72℃终延伸8min。