CN113136447A - 一种快速区分稻瘟病菌交配型的pcr-hrm检测方法 - Google Patents

一种快速区分稻瘟病菌交配型的pcr-hrm检测方法 Download PDF

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CN113136447A CN202110356410.XA CN202110356410A CN113136447A CN 113136447 A CN113136447 A CN 113136447A CN 202110356410 A CN202110356410 A CN 202110356410A CN 113136447 A CN113136447 A CN 113136447A
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房文文
王海风
郭涛
姜艳芳
张士永
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Abstract

本发明提供了一种快速区分稻瘟病菌交配型的PCR‑HRM检测方法，属于分子生物学检测技术领域，所述引物组包括MAT1‑1扩增引物组和MAT1‑2扩增引物组。本发明的引物组扩增得到的交配型熔解曲线能够分型，检测效果好。基于本发明的引物组进行荧光PCR扩增得到的扩增产物进行熔解曲线分析，获得熔解温度，依据熔解温度能够快速、准确区分稻瘟病菌交配型。本发明首次提供了一种可快速检测稻瘟病菌交配型的荧光PCR‑HRM检测引物组，能够简化检测流程，实现高通量检测，显著缩短检测所需时间，适用于大批量的稻瘟病菌交配型的快速检测。

Description

一种快速区分稻瘟病菌交配型的PCR-HRM检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种快速区分稻瘟病菌交配型的PCR-HRM检测方法。
背景技术
有性生殖是真菌的一种生殖方式，分为同宗配合(Homothalllism)和异宗配合(Heterothallism)。同宗配合的子囊真菌通常具有一个交配型基因座，而异宗配合的子囊真菌有一对交配型基因座。异宗配合真菌必须由不同交配型的菌丝细胞结合后才能产生子代。异宗配合的子囊真菌具有MAT1-1和MAT1-2两个高度异源的交配型基因位点，因此，可通过检测MAT1-1和MAT1-2基因来判读异宗配合的子囊真菌的交配型。
由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是世界各水稻生产区内广泛发生、且危害极大的一种真菌性病害。稻瘟病菌属子囊菌广大角间座壳属的异宗配合真菌，具有MAT1-1和MAT1-2两种交配型。目前检测交配型的方法主要是利用常规PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳过程中，需要实验人员逐一进行点样，根据条带大小进行区分，这一方法检测效率较低，难以实现批量化检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速区分稻瘟病菌交配型的PCR-HRM检测方法，通过荧光PCR扩增和高分辨率熔解曲线能够区分稻瘟病菌交配型。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种快速区分稻瘟病菌交配型的荧光PCR-HRM检测引物组，包括MAT1-1扩增引物组和MAT1-2扩增引物组；
所述MAT1-1扩增引物组包括MAT1-1-F和MAT1-1-R；
所述MAT1-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述MAT1-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述MAT1-2扩增引物组包括MAT1-2-F和MAT1-2-R；
所述MAT1-2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述MAT1-2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了一种包括上述方案所述引物组的荧光PCR-HRM检测试剂盒，所述试剂盒还包括用于荧光PCR扩增的试剂。
本发明提供了一种基于上述方案所述引物组或者上述方案所述试剂盒的荧光PCR-HRM检测区分稻瘟病菌交配型的方法，包括以下步骤：
1)提取待区分稻瘟病菌的基因组DNA；
2)以所述待区分稻瘟病菌的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行荧光PCR扩增反应，得到待区分稻瘟病菌荧光PCR扩增产物；
3)对所述待区分稻瘟病菌荧光PCR扩增产物进行熔解曲线分析，得到待区分稻瘟病菌熔解温度；
当所述待区分稻瘟病菌熔解温度为78～80℃时，则所述待区分稻瘟病菌为MAT1-1交配型；当所述待区分稻瘟病菌熔解温度为82～84℃时，则所述待区分稻瘟病菌为MAT1-2交配型。
优选的，步骤2)中所述荧光PCR扩增反应的反应体系以10μL计，包括以下组分：待区分稻瘟病菌的基因组DNA 3μL、10×buffer 1μL、dNTP 0.2μL、20×Evagreen 0.125μL、0.5U Taq DNAPolymerase 0.1μL、所述引物组中的MAT1-1-F、MAT1-1-R、MAT1-2-F和MAT1-2-R各0.2μL以及余量的ddH2O。
优选的，所述待区分稻瘟病菌的基因组DNA的浓度为10～50ng/μL；所述10×buffer含有Mg2+，所述Mg2+的浓度为20mM；所述dNTP的浓度为2.5mM；所述引物组中的MAT1-1-F、MAT1-1-R、MAT1-2-F和MAT1-2-R的浓度分别为0.1mM。
优选的，步骤2)中所述荧光PCR扩增反应的反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。
优选的，步骤3)中所述熔解曲线分析的程序为：95℃，变性15s；60℃退火15s；以0.07℃/s的速率升温，10次/℃采集荧光信号，至90℃保持1s，进行熔解曲线分析。
优选的，步骤3)中所述熔解曲线分析采用的软件包括LightCycler 96。
本发明提供了一种快速区分稻瘟病菌交配型的荧光PCR-HRM检测引物组，包括MAT1-1扩增引物组和MAT1-2扩增引物组。本发明的引物组扩增得到的交配型熔解曲线能够分型，检测效果好。基于本发明的引物组进行荧光PCR扩增，对扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，根据分析得到的熔解温度能够快速、准确的区分稻瘟病菌交配型，并且本发明的方法能够利用96孔板操作，可实现批量化、高通量检测，扩增、检测96个样品仅需要1h，大大节省时间，且扩增完检测不需任何处理，提高工作效率，适用于大批量的稻瘟病菌交配型的快速检测。同时本发明的引物组准确度高、特异性好、灵敏度高，有利于在丝状真菌交配型检测领域推广应用，对研究真菌遗传变异具有重大意义。
附图说明
图1本发明对稻瘟病菌对照菌株P9交配型MAT1-1的熔解曲线图；
图2本发明对稻瘟病菌对照菌株P131交配型MAT1-2的熔解曲线图；
图3本发明对稻瘟病菌田间菌株样品MAT1-2的熔解曲线图；
图4为稻瘟病菌交配型MAT1-1引物对FR2标准菌株的熔解曲线；
图5为稻瘟病菌交配型MAT1-1引物对FR3标准菌株的熔解曲线；
图6为稻瘟病菌交配型MAT1-2引物对FR2标准菌株的熔解曲线；
图7为稻瘟病菌交配型MAT1-2引物对F2R标准菌株的熔解曲线；
图8为稻瘟病菌交配型MAT1-2引物对F2R2标准菌株的熔解曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种快速区分稻瘟病菌交配型的荧光PCR-HRM检测引物组，包括MAT1-1扩增引物组和MAT1-2扩增引物组；
所述MAT1-1扩增引物组包括MAT1-1-F和MAT1-1-R；
所述MAT1-2扩增引物组包括MAT1-2-F和MAT1-2-R；
MAT1-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-GTCAATGGATTTATGGCATTTCGA-3’；
MAT1-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5’-CGTAGTAGGCTATACTGCTGTC-3’；
MAT1-2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：5’-CGCCCAAATCAACAATTCCAACAA-3’；
MAT1-2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：5’-CTCCTGAAAGGCGCCTCAAGTTG-3’。
本发明还提供了一种包括上述方案所述引物组的荧光PCR-HRM检测试剂盒，所述试剂盒还包括用于荧光PCR扩增的试剂。
本发明还提供了一种基于上述方案所述引物组或者所述试剂盒的荧光PCR-HRM检测区分稻瘟病菌交配型的方法，包括以下步骤：
1)提取待区分稻瘟病菌的基因组DNA；
2)以所述待区分稻瘟病菌的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行荧光PCR扩增反应，得到待区分稻瘟病菌荧光PCR扩增产物；
3)对所述待区分稻瘟病菌荧光PCR扩增产物进行熔解曲线分析，得到待区分稻瘟病菌熔解温度；
当所述待区分稻瘟病菌熔解温度为78～80℃时，则所述待区分稻瘟病菌为MAT1-1交配型；当所述待区分稻瘟病菌熔解温度为82～84℃时，则所述待区分稻瘟病菌为MAT1-2交配型。
本发明首先提取待区分稻瘟病菌的基因组DNA。本发明对提取待区分稻瘟病菌的基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。本发明具体实施过程中，采用CTAB法提取待区分稻瘟病菌的基因组DNA。
得到待区分稻瘟病菌的基因组DNA后，本发明以所述待区分稻瘟病菌的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行荧光PCR扩增反应，得到待区分稻瘟病菌荧光PCR扩增产物。
在本发明中，中所述荧光PCR扩增反应的反应体系以10μL计，优选的包括以下组分：待区分稻瘟病菌的基因组DNA 3μL、10×buffer 1μL、dNTP0.2μL、20×Evagreen 0.125μL、0.5U Taq DNAPolymerase 0.1μL、所述引物组中的MAT1-1-F、MAT1-1-R、MAT1-2-F和MAT1-2-R各0.2μL以及余量的ddH2O；所述待区分稻瘟病菌的基因组DNA的浓度优选为10～50ng/μL，更优选为20～30ng/μL；所述10×buffer优选的含有Mg2+，所述Mg2+的浓度优选为20mM；所述dNTP的浓度优选为2.5mM。
在本发明中，所述荧光PCR扩增反应的反应程序优选为：94℃预变性2min；94℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。
得到待区分稻瘟病菌荧光PCR扩增产物后，本发明对所述待区分稻瘟病菌荧光PCR扩增产物进行熔解曲线分析，得到待区分稻瘟病菌熔解温度；
当所述待区分稻瘟病菌熔解温度为78～80℃时，则所述待区分稻瘟病菌为MAT1-1交配型；当所述待区分稻瘟病菌熔解温度为82～84℃时，则所述待区分稻瘟病菌为MAT1-2交配型。
在本发明中，所述熔解曲线分析的程序优选为：95℃，变性15s；60℃退火15s；以0.07℃/s的速率升温，10次/℃采集荧光信号，至90℃保持1s，进行熔解曲线分析。在本发明中，所述熔解曲线分析采用的软件优选的包括LightCycler 96。
本发明具体实施过程中，还包括采用MAT1-1标准菌株和MAT1-2标准菌株作为对照。具体是，以MAT1-1标准菌株的基因组DNA为模板，采用所述MAT1-1扩增引物组进行荧光PCR扩增反应，得到MAT1-1标准菌株荧光PCR扩增产物；对所述MAT1-1标准菌株荧光PCR扩增产物进行熔解曲线分析，得到MAT1-1标准菌株溶解曲线和熔解温度。以所述MAT1-2标准菌株的基因组DNA为模板，采用所述MAT1-2扩增引物组进行荧光PCR扩增反应，得到MAT1-2标准菌株荧光PCR扩增产物；对所述MAT1-2标准菌株荧光PCR扩增产物进行熔解曲线分析，得到MAT1-2标准菌株溶解曲线和熔解温度。MAT1-1标准菌株优选为P9菌株；MAT1-2标准菌株优选为P131菌株。P9菌株和P131菌株来源于中国农业大学植物保护学院彭友良老师课题组。
在本发明中，MAT1-1交配型的熔解温度优选为79.3～79.7℃；MAT1-2交配型的熔解温度优选为82.8～83.2℃。通过熔解曲线峰型以及Tm值差异可以完全区分开MAT1-1和MAT1-2菌株。
含有MAT1-1交配型菌丝的稻瘟病菌可用MAT1-1引物扩增出曲线；含有MAT1-2交配型菌丝的菌核可用MAT1-2引物扩增出曲线。
稻瘟病菌MAT1-1和MAT1-2交配型单孢菌株可配合进行有性生殖；同时含有MAT1-1和MAT1-2交配型菌丝的稻瘟病菌可育菌核可萌发形成子囊座并产生子囊孢子；仅含有MAT1-1或MAT1-2交配型菌丝的不可育菌核不能产生子囊座。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的番茄燕麦培养基制作方法：称取40g燕麦片，800mL水煮沸过滤；加入150mL番茄汁、15g琼脂粉，加水定容至1L，混匀，121℃高压灭菌20min。
实施例1
1、本实施例采用的扩增引物组如下所示：
MAT1-1-F:5’-GTCAATGGATTTATGGCATTTCGA-3’(SEQ ID NO.1)；
MAT1-1-R:5’-CGTAGTAGGCTATACTGCTGTC-3’(SEQ ID NO.2)；
MAT1-2-F:5’-CGCCCAAATCAACAATTCCAACAA-3’(SEQ ID NO.3)；
MAT1-2-R:5’-CTCCTGAAAGGCGCCTCAAGTTG-3’(SEQ ID NO.4)。
P9菌株和P131菌株分别为MAT1-1标准菌株和MAT1-2标准菌株，来源于中国农业大学植物保护学院彭友良老师课题组，并在现有技术中有公开记载(参见范薇.稻瘟菌近等基因系的构建及其利用：[硕士学位论文]北京：中国农业大学，2011)。
2、供试菌株菌丝体收集及DNA提取
1)供试菌株菌丝体收集
供试的单孢分离的稻瘟病菌菌株。取保存的待菌株接种于番茄燕麦(OTA)培养基平板上，26℃恒温光照培养箱中培养5d，用牙签挑取新鲜菌丝，取适量菌丝于2mL离心管中。
2)供试菌株DNA提取
采用CTAB法提取供试菌株的DNA，具体步骤如下：
(1)将保存各供试菌株的菌丝加600μL 65℃预热的2×CTAB，然后65℃温浴30min；
(2)冷却后加600μL氯仿异戊醇混匀，12000rpm/min离心10min，吸200μL上清液，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀-20℃条件下沉淀30min；
(3)12000rpm、4℃条件下离心15min，弃上清液，加入600μL 70％的乙醇洗涤沉淀1～2次，放入通风橱内吹干；
(4)加入100μL TE(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH 8.0)溶解DNA，使用核酸定量仪测量DNA浓度，并将浓度调整为约10～50ng/μL，-20℃保存备用。
3、PCR扩增及HRM检测
PCR反应体系为：10×Taqbuffer(含20mM的Mg2+)1μL，250μmol/L dNTP 0.2μL，0.5UTaq DNAPolymerase 0.1μL，20×Evagreen 0.125μL，10～50ng/μL的DNA模板3μL，引物各0.2μL；补足ddH2O至10μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。熔解曲线(HRM)分析程序：95℃，变性15s；60℃退火15s；以0.07℃/s的速率升温，10reading/℃采集荧光信号，至90℃保持1s，采用软件Light Cycler 96software进行熔解曲线分析。
稻瘟病菌交配型MAT1-1和MAT1-2标准菌株熔解曲线分析结果分别如图1，图2所示。图1中蓝色的曲线峰型和TM值对应的是MAT1-1；图2中蓝色的曲线峰型和TM值对应的是MAT1-2。红蓝曲线能够明显区分交配型类型MAT1-1或MAT1-2。
结合图1可得到以下结果：P9菌株的熔解温度为79.5±0.2℃；
结合图2可得到以下结果：P131菌株的熔解温度为83.0±0.2℃。因此，通过熔解曲线峰型以及Tm值差异可以完全区分开MAT1-1和MAT1-2菌株。
4、利用实施例3的PCR-HRM方法检测稻瘟病菌交配型MAT1-2
从田间收集分离的稻瘟病菌单孢菌株提取DNA，方法同实施例2中提取方法。以提取的DNA为模板，使用本发明设计的引物进行扩增，以P9(MAT1-1)和P131(MAT1-2)为阳性对照。本发明检测了稻瘟病菌田间菌株，部分熔解曲线分析结果如图3所示，其中以P9(MAT1-1)和P131(MAT1-2)为阳性对照。83个菌株与对照菌株P131(MAT1-2)的曲线一致，ΔTm值的绝对值均小于1.0℃，其交配型均为MAT1-2。
对比例1
本对比例采用的扩增引物组如下所示：
MAT1-1-F:5’-GTCAATGGATTTATGGCATTTCGA-3’(SEQ ID NO.1)；
MAT1-1-R2:5’-CTGCTGTCAGCACAAGCTTCGAT-3’(SEQ ID NO.5)。
其余和实施例1相同。
扩增结果参见图4。图4为稻瘟病菌交配型MAT1-1引物对FR2标准菌株的熔解曲线；由图4可以看出，P9菌株能扩增，但P131曲线杂乱。
对比例2
本对比例采用的扩增引物组如下所示：
MAT1-1-F:5’-GTCAATGGATTTATGGCATTTCGA-3’(SEQ ID NO.1)；
MAT1-1-R3:5’-TCTATTATCAGTCTGTACTCAC-3’(SEQ ID NO.6)。
其余和实施例1相同。
扩增结果参见图5。图5为稻瘟病菌交配型MAT1-1引物对FR3标准菌株的熔解曲线；由图5可以看出，P9菌株虚线代表未扩增，扩增效果不好。
对比例3
本对比例采用的扩增引物组如下所示：
MAT1-2-F:5’-CGCCCAAATCAACAATTCCAACAA-3’(SEQ ID NO.3)；
MAT1-2-R2:5’-GTTGAGGAGAACGGCGCCGATAT-3’(SEQ ID NO.8)。
其余和实施例1相同。
扩增结果参见图6。图6为稻瘟病菌交配型MAT1-2引物对FR2标准菌株的熔解曲线；由图6可以看出，P131菌株能扩增，但P9曲线杂乱，虚线代表未扩增。
对比例4
本对比例采用的扩增引物组如下所示：
MAT1-2-R:5’-CTCCTGAAAGGCGCCTCAAGTTG-3’(SEQ ID NO.4)；
MAT1-2-F2:5’-CAACAATTCCAACAACATAGCTC-3’(SEQ ID NO.7)。
其余和实施例1相同。
扩增结果参见图7。图7为稻瘟病菌交配型MAT1-2引物对F2R标准菌株的熔解曲线；由图7可以看出，P131菌株能扩增，但P9曲线出现双峰，呈杂合峰型。
对比例5
本对比例采用的扩增引物组如下所示：
MAT1-1-R2:5’-CTGCTGTCAGCACAAGCTTCGAT-3’(SEQ ID NO.5)；
MAT1-2-F2:5’-CAACAATTCCAACAACATAGCTC-3’(SEQ ID NO.7)。
其余和实施例1相同。
扩增结果参见图8。图8为稻瘟病菌交配型MAT1-2引物对F2R2标准菌株的熔解曲线；由图8可以看出，P131菌株能扩增，但P9曲线不平滑。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东省水稻研究所
<120> 一种快速区分稻瘟病菌交配型的PCR-HRM检测方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcaatggat ttatggcatt tcga 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtagtaggc tatactgctg tc 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcccaaatc aacaattcca acaa 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcctgaaag gcgcctcaag ttg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgctgtcag cacaagcttc gat 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctattatca gtctgtactc ac 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caacaattcc aacaacatag ctc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttgaggaga acggcgccga tat 23

Claims (8)

1.一种快速区分稻瘟病菌交配型的荧光PCR-HRM检测引物组，包括MAT1-1扩增引物组和MAT1-2扩增引物组；
所述MAT1-1扩增引物组包括MAT1-1-F和MAT1-1-R；
所述MAT1-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述MAT1-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述MAT1-2扩增引物组包括MAT1-2-F和MAT1-2-R；
所述MAT1-2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述MAT1-2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种包括权利要求1所述引物组的荧光PCR-HRM检测试剂盒，所述试剂盒还包括用于荧光PCR扩增的试剂。
3.一种基于权利要求1所述引物组或者权利要求2所述试剂盒的荧光PCR-HRM检测区分稻瘟病菌交配型的方法，包括以下步骤：
1)提取待区分稻瘟病菌的基因组DNA；
2)以所述待区分稻瘟病菌的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行荧光PCR扩增反应，得到待区分稻瘟病菌荧光PCR扩增产物；
3)对所述待区分稻瘟病菌荧光PCR扩增产物进行熔解曲线分析，得到待区分稻瘟病菌熔解温度；
当所述待区分稻瘟病菌熔解温度为78～80℃时，则所述待区分稻瘟病菌为MAT1-1交配型；当所述待区分稻瘟病菌熔解温度为82～84℃时，则所述待区分稻瘟病菌为MAT1-2交配型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述荧光PCR扩增反应的反应体系以10μL计，包括以下组分：待区分稻瘟病菌的基因组DNA 3μL、10×buffer 1μL、dNTP 0.2μL、20×Evagreen 0.125μL、0.5U Taq DNA Polymerase 0.1μL、所述引物组中的MAT1-1-F、MAT1-1-R、MAT1-2-F和MAT1-2-R各0.2μL以及余量的ddH2O。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待区分稻瘟病菌的基因组DNA的浓度为10～50ng/μL；所述10×buffer含有Mg2+，所述Mg2+的浓度为20mM；所述dNTP的浓度为2.5mM；所述引物组中的MAT1-1-F、MAT1-1-R、MAT1-2-F和MAT1-2-R的浓度分别为0.1mM。
6.根据权利要求3或5所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述荧光PCR扩增反应的反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述熔解曲线分析的程序为：95℃，变性15s；60℃退火15s；以0.07℃/s的速率升温，10次/℃采集荧光信号，至90℃保持1s，进行熔解曲线分析。
8.根据权利要求3或7所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述熔解曲线分析采用的软件包括LightCycler96。
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