CN111793718A - 一种鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的pcr-hrm引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR‑HRM引物和方法。本发明首次建立了一种可快速区分鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR‑HRM检测方法，操作简单，高通量，显著缩短了鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型鉴别与检测所需时间；同时本发明的检测方法准确度高、特异性好、灵敏度高，有利于在临床实践中推广应用。

Description

一种鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR- HRM引物及方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR-HRM引物和方法。

背景技术

近年来，随着我国水禽业的迅速发展，鸭群中腺病毒的感染日益增多，禽腺病毒感染主要以包涵体肝炎和心包积液为特征。鸭腺病毒分为3个基因型，包括鸭腺病毒1型(duckadenovirus 1)、鸭腺病毒2型(duck adenovirus 2)和鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3)。据文献报道，鸭腺病毒1型是引起蛋鸭产蛋率大幅下降的禽腺病毒。2014年，奥地利科学家Ana Marek通过高通量测序技术测定了1株鸭源腺病毒GR株，全基因组序列，并对该序列进行分析，随后ICTV将其命名为鸭腺病毒2型(Marek A,Kaján GL,Kosiol C,et al.Completegenome sequences of pigeon adenovirus 1and duck adenovirus 2extend the numberof species within the genus Aviadenovirus[J].Virology,2014,462-463:107-114)。同年，我国在番鸭群中分离到一株新的鸭腺病毒CH-GD-2014株，序列分析可知CH-GD-12-2014株和GR株并不属于同一类型的鸭腺病毒。CH-GD-12-2014株有两个fiber基因，而GR株只有一个fiber基因，命名为鸭腺病毒3型(DAdV-3)(周镇海.鸭腺病毒3型基因组序列分析及致病性研究[D].华南农业大学硕士论文，2016)。

高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting，HRM)是基于核酸分子的片段长短、GC含量和分布等物理性质的不同，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的。HRM技术的基本原理是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。

目前检测鸭腺病毒病原的方法有病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、普通PCR以及荧光定量PCR等。201910940262.9的专利，公开了一种鉴别禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型的HRM方法，但仅仅针对鸭腺病毒3型并没有涉及鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的鉴别，关键原因在于目前还未有可靠有效的扩增引物能够用于鉴别鸭腺病毒的3个基因型。因此，提供一种有效的可用于鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的扩增引物，并建立一套鉴别检测方法及体系在临床上具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR-HRM方法。

本发明的又一目的在于提供上述鉴别方法的引物。

本发明所采取的技术方案是：

本发明一方面，提供了一种鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR-HRM引物，所述引物的核苷酸序列如下：

P1：5’-TCDGAYATYGGWGTKAAATTTGA-3’；

P2：5’-TCTARYARWGSWGGAATRTTGCC-3’。

本发明又一方面，提供了一种鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR-HRM试剂盒，包括前面所述的引物。

根据本发明的实施例，还包括阳性标准品。

本发明又一方面，提供了一种鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR-HRM方法，包括以下步骤：

(1)提取样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，使用前面所述引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)结果判定：对扩增产物进行HRM分析，判定样品中是否有鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和/或鸭腺病毒3型。

根据本发明的实施例，步骤(2)中所述PCR扩增体系：

根据本发明的实施例，步骤(2)所述扩增体系反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性20s，53℃退火20s，72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸8min。

根据本发明的实施例，步骤(3)所述HRM分析条件为：95℃变性10s，40℃退火120s，采集荧光信号进行分析。

根据本发明的实施例，荧光信号采集温度为74℃～84℃，采集频率为0.3℃/步。

根据本发明的实施例，步骤(3)所述结果判定方法：

(1)若样品PCR扩增产物熔解温度与鸭腺病毒1型的阳性质粒p-DAdV1的熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品为鸭腺病毒1型；

(2)若样品PCR扩增产物熔解温度与鸭腺病毒2型的阳性质粒p-DAdV2的熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品为鸭腺病毒2型；

(3)若样品PCR扩增产物熔解温度与鸭腺病毒3型的阳性质粒p-DAdV3的熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品为鸭腺病毒3型；

(4)若样品PCR扩增产物没有出现熔解峰，则判定样品为阴性。

本发明的有益效果是：

(1)本发明首次建立了可快速鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR-HRM的引物和方法，该检测方法操作简单，只需一个反应即可实现鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的鉴别检测；检测速度快且高通量，全部操作过程在2小时以内，显著缩短了鸭腺病毒不同基因型的检测与鉴别所需时间，并且准确度高、特异性好，灵敏度高，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

(2)本发明的PCR-HRM引物对P1和P2，可特异性扩增鸭腺病毒DNA，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间；同时引物对P1和P2，均不与其他常见鸭的病原核酸结合，有利于提高本发明对结果分析的正确性。

(3)本发明的用于区分鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR-HRM检测方法的最低检测限可达到每个反应单拷贝或者数十个拷贝，灵敏度较高。

附图说明

图1为鸭腺病毒阳性标准样品的熔解曲线图；其中p-DAdV1是鸭腺病毒1型的阳性质粒、p-DAdV2是鸭腺病毒2型的阳性质粒、p-DAdV3是鸭腺病毒3型的阳性质粒。

图2为鸭腺病毒PCR-HRM检测方法特异性试验熔解曲线图；其中鸭瘟病毒(DPV)、鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭疫里默氏杆菌(RA)、大肠杆菌(EC)以及巴氏杆菌(PM)是其他鸭的常见病原；鸭腺病毒1型的阳性质粒p-DAdV1、鸭腺病毒2型的阳性质粒p-DAdV2和鸭腺病毒3型的阳性质粒p-DAdV3作为阳性对照，水作为阴性对照；

图3为鸭腺病毒核酸的灵敏度试验熔解曲线图；

图4为鸭腺病毒临床样品的熔解曲线图；

图5为鸭腺病毒临床样品Hexon基因进化树分析图，其中●为临床检测阳性样品(即S1、S2、S4、S5、S8、S9和S10为阳性样品)。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体的实验对本发明所展示的内容进行进一步详细的阐述。本实验实施过程和附图仅用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。实施过程中所使用的实验方法如果没有特别说明，均为常规实验方法。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

实施例1引物设计

(1)引物设计

根据鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型基因序列进行引物设计。经过大量筛选后，筛选了灵敏度高和特异性强的引物P1和P2，使用PCR-HRM方法用以区分鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型，其碱基序列如下：

P1：5’-TCDGAYATYGGWGTKAAATTTGA-3’(SEQ ID NO:1)；

P2：5’-TCTARYARWGSWGGAATRTTGCC-3’(SEQ ID NO:2)。

实施例2标准样品的制备、PCR扩增及熔解曲线分析

(1)标准阳性样品的制备

本实施例中制备鸭腺病毒1型阳性标准样品p-DAdV1、鸭腺病毒2型阳性标准样品p-DAdV2以及鸭腺病毒3型阳性标准样品p-DAdV3。

鸭腺病毒1型阳性标准样品p-DAdV1与鸭腺病毒3型阳性标准样品p-DAdV3的制备步骤：

将测序确定为鸭腺病毒1型和鸭腺病毒3型的病毒液，分别提取鸭腺病毒1型和鸭腺病毒3型的核酸，并以引物P1和引物P2为扩增引物进行PCR扩增。分别回收纯化扩增的产物，克隆至PMD18T-Vector，再进一步测序确认片段已正确插入载体，即两个质粒作为鸭腺病毒1型阳性标准样品p-DAdV1和鸭腺病毒3型阳性标准样品p-DAdV3。

鸭腺病毒2型阳性标准样品p-DAdV2制备步骤：

另外，由于本发明没有分离到鸭腺病毒2型，根据鸭腺病毒的基因序列进行基因序列的合成，合成产物克隆至载体，构建的质粒即为鸭腺病毒2型阳性标准样品p-DAdV2(由北京奥科生物技术有限公司制备)。

(2)阳性标准样品的PCR-HRM

分别以步骤(1)的3种阳性标准样品(p-DAdV1、p-DAdV2和p-DAdV3)为DNA模板，进行PCR-HRM扩增反应和熔解曲线分析；以水作为阴性对照。

按表1的反应体系配制PCR反应液进行试验。

表1 PCR反应体系

PCR扩增的反应程序为：

94℃预变性5min；94℃变性20s，53℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸8min。

熔解曲线分析程序为：

95℃变性10s，40℃退火120s，升温至70℃时以0.3℃/步的速率开始采集荧光信号，直至84℃结束，进行熔解曲线分析。

(5)阳性标准样品熔解曲线分析的结果分析

PCR扩增产物用Rotor-Gene Q分析仪进行分析。鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的阳性标准样品熔解曲线分析结果如图1所示。

结果：图1可得到以下结果：(1)鸭腺病毒1型的熔解温度为78.91±0.10；(2)鸭腺病毒2型的熔解温度为77.44±0.12；(3)鸭腺病毒3型的熔解温度为80.86±0.08。因此，通过熔解曲线峰型以及Tm值差异可以完全区分开鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型，准确率高。

下面对本发明的检测方法进一步的效果检测。

特异性试验

为了检测本发明用于区分鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的引物以及方法的特异性，进行了以下试验：

分别提取鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭疫里默氏杆菌(RA)、大肠杆菌(EC)以及巴氏杆菌(PM)的核酸，将上述病毒的核酸作为PCR模板，水作阴性对照，以实施例2的PCR扩增反应和熔解曲线分析方法进行分析，并与鸭腺病毒1型阳性标准样品p-DAdV1、鸭腺病毒2型阳性标准样品p-DAdV2以及鸭腺病毒3型阳性标准样品p-DAdV3进行对比分析，熔解曲线峰型化图如图2所示。

从图2可以看出，本发明的检测方法只能特异性扩增并形成鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的熔解峰，而对MPV、GPV、DPV、DuCV、RA、EC及PM核酸都没有扩增并形成特异熔解峰，说明本发明设计的引物P1和P2具有很好的特异性，可以用于鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR-HRM检测。本发明检测方法有良好的特异性。

灵敏度试验

为了检测本发明的用于区分鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的引物以及方法的灵敏度，进行了以下试验：

将鸭腺病毒1型阳性标准样品p-DAdV1、鸭腺病毒2型阳性标准样品p-DAdV2以及鸭腺病毒3型阳性标准样品p-DAdV3做核酸检测，用ddH₂O将阳性标准样品分别进行倍比稀释，每个阳性标准样品形成10⁸～10⁰copies/μl共9个梯度。按上述PCR扩增反应和熔解曲线分析方法进行分析，熔解曲线峰型化图如图3所示。

从图3可以看出，本发明检测方法针对的鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型均随着质粒浓度的降低呈现明显的下降，鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的最低检出限分别为3.1×10¹copies/反应、5.9copies/反应和2.8×10¹copies/反应，说明本发明的方法可用于区分鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型，该方法的灵敏度较高。

实施例3临床样品检测

(1)取10份疑似感染鸭腺病毒的鸭肝脏提取核酸；

(2)以提取的样品DNA为模板，使用本发明设计的引物P1和P2进行扩增，同时以鸭腺病毒1型阳性标准样品p-DAdV1、鸭腺病毒2型阳性标准样品p-DAdV2以及鸭腺病毒3型阳性标准样品p-DAdV3作为阳性对照。反应体系以及反应程序如实施例2。

(3)临床样品熔解曲线分析

本发明检测的10份疑似鸭腺病毒的临床样品，熔解曲线分析结果如图4所示，其中阳性标准品作为阳性对照，水为阴性对照。

从图4所示的鸭腺病毒的临床样品峰型化熔解曲线图上可以看出，其中7份临床样品与鸭腺病毒3型阳性标准样品p-DAdV3作的ΔTm值的绝对值均小于0.5℃，均为鸭腺病毒3型。

将7份经PCR-HRM方法检测为阳性的鸭腺病毒的临床样品，使用扩增鸭腺病毒3型Hexon基因的引物进行普通PCR扩增。引物核苷酸序列如下：

DAdV-F：5’-GTAGCGGAGTAGCAGCATCG-3’(SEQ ID NO:3)；

DAdV-R：5’-ACCCTGGAAAGGAGTTGTCG-3’(SEQ ID NO:4)。

将PCR产物送至上海生物技术工程有限公司进行双向测序，测序所得到的Hexon基因序列，采用N-J法遗传进化树分析。

如图5，PCR阳性样品S1，S2，S4，S5，S8，S9和S10的Hexon基因遗传进化树显示7个阳性样品与NCBI上登录的鸭腺病毒3型在同一簇，均为鸭腺病毒3型，与本研究快速区分鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR-HRM检测方法结果一致。但两者相比，测序方法耗时更长，检测程序更复杂，无法做到高通量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR-HRM引物及方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcdgayatyg gwgtkaaatt tga 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctaryarwg swggaatrtt gcc 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtagcggagt agcagcatcg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

accctggaaa ggagttgtcg 20

Claims (9)

1.一种鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR-HRM引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：

P1：5’-TCDGAYATYGGWGTKAAATTTGA-3’；

P2：5’-TCTARYARWGSWGGAATRTTGCC-3’。

2.一种鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR-HRM试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性标准品。

4.一种鉴别鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和鸭腺病毒3型的PCR-HRM方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，使用权利要求1所述引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)结果判定：对扩增产物进行HRM分析，判定样品中是否有鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型和/或鸭腺病毒3型。

5.根据权利要求4所述的PCR-HRM方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增体系：

6.根据权利要求4所述的PCR-HRM方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增体系反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性20s，53℃退火20s，72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸8min。

7.根据权利要求4所述的PCR-HRM方法，其特征在于，步骤(3)所述HRM分析条件为：95℃变性10s，40℃退火120s，采集荧光信号进行分析。

8.根据权利要求7所述的PCR-HRM方法，其特征在于，荧光信号采集温度为74℃～84℃，采集频率为0.3℃/步。

9.根据权利要求4所述的PCR-HRM方法，其特征在于，步骤(3)所述结果判定方法：

(1)若样品PCR扩增产物熔解温度与鸭腺病毒1型的阳性质粒p-DAdV1的熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品为鸭腺病毒1型；

(2)若样品PCR扩增产物熔解温度与鸭腺病毒2型的阳性质粒p-DAdV2的熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品为鸭腺病毒2型；

(3)若样品PCR扩增产物熔解温度与鸭腺病毒3型的阳性质粒p-DAdV3的熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品为鸭腺病毒3型；

(4)若样品PCR扩增产物没有出现熔解峰，则判定样品为阴性。

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