CN112662816B - 用于阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法。本发明提供用于阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒检测分别或同时实时荧光定量RT‑PCR检测的引物探针组合，其含有三对特异性引物和三条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7‑9所示。本发明提供的引物探针组合和检测方法具有高灵敏性和特异性、可重复性好、操作简便、检测时间短、所需样本量少、低污染，节约成本等优点，可直接对未知样本里提取的RNA进行检测，可与传统检测方案互补，在病毒的快速检测中具有较高的应用价值。

Description

用于阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒检测的引物探 针组合、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法。

背景技术

沙粒病毒由外膜和核衣壳组成，呈圆形，含有脂质(外)胞膜，直径约为50-300nm(平均110-130nm)。外膜表面覆盖有一种蛋白组成的、长度约10nm的纤突，内部可见不同数量的来自宿主细胞的核糖体，在电镜下形如沙粒样，沙粒病毒因此而得名。病毒基因组由双向分节段的单股负义链RNA组成，较大的为L片段，长度约7400个核苷酸，编码RNA依赖的RNA聚合酶L蛋白和具有转录复制调节功能的Z蛋白；较小的为S片段，长度约3400个核苷酸，编码核蛋白NP和糖蛋白GP。L和S片段在病毒粒子中并非等量，而是以2：1的摩尔比存在。每个片段上的基因分别被含有发卡结构的非编码区隔开，5’端无帽状结构，3’端序列保守。由于S片段较L片段更为保守，因此常用S片段进行病毒进化研究和分类鉴定。

根据国际病毒学分类委员会(ICTV)2018年最新颁布病毒分类(https://talk.ictvonline.org/taxonomy/)，沙粒病毒科分为4个属：Antennavirus、Hartmanivirus、Mammarenavirus和Reptarenavirus，包含43个种。哺乳动物沙粒病毒属(Mammarenavirus)中35个种可分为旧世界沙粒病毒和新世界沙粒病毒，旧世界沙粒病毒中，代表病毒是淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒简称LCMV病毒。新世界沙粒病毒主要包括有4个clade，clade A有Pirital，Pichinde，Flexal，Parana和Alloahuayo virus五种病毒；cladeB有Junin,Machupo,Guanarito,Amapari,Tacaribe,Sabia,Cupixi和Chapare viruses八种病毒；clade C有Oliveros和Latino两种病毒；clade A/Rec包括有Whitewater Arroyo,Tamiami和Bear Canyo三种病毒；Lujo virus属于新世界沙粒病毒，但不在四个clade中。已发现可导致人严重疾病的沙粒病毒主要有拉沙病毒(Lassa virus)引起拉沙热，胡宁病毒(Junin virus)引起阿根廷出血热，马秋波病毒(Machupo virus)和查帕雷病毒(Chaparevirus)引起玻利维亚出血热，卢约病毒(Lujo virus)引起卢约出血热，瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)引起委内瑞拉出血热，萨比亚病毒(Sabid virus)引起巴西出血热，淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)引起淋巴细胞脉络丛脑膜炎。

阿马帕里病毒(Amapari virus)于1965年在巴西圭亚那毛鼠(Neacomys guianae)中首次被发现，该鼠也是阿马帕里病毒的储存宿主，阿马帕里病毒主要局限于巴西阿马帕地区的啮齿类动物中传播。库皮科斯病毒(Cupixi virus)于1965年在巴西食米鼠(Oryzomys gaeldi)中首次被发现，该病毒主要局限于巴西阿马帕地区的啮齿类动物中传播。伊派病毒(Ippy virus)于1984年在中非共和国尼罗河鼠(Arvicanthis sp)首次被发现，该病毒主要局限于中非的啮齿类动物中传播。

病毒病实验室检测主要依靠于病毒分离、血清学检测和病毒核酸检测。病毒核酸检测主要是基于PCR技术，实时荧光定量RT-PCR有着快速、高灵敏度和特异度的优点，是目前运用较多的实验室检测方法。该方法基于荧光共振能量迁移的原理，通过对荧光强度变化监测产物量的变化，随着反应时间的进行，将监测到的荧光信号的变化绘制一条曲线。该方法全程闭管操作，降低了污染的风险；对PCR产物除了可以进行定性分析，也可通过绘制标准曲线进行定量分析。目前尚未有阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏、特异，可分别或同时检测阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的实时荧光定量RT-PCR检测引物探针组合、试剂盒和检测方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)等数据库中检索下载阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的基因组序列，选择具有较明确分离日期和地区的较完整病毒基因组序列、标明标准株的基因组序列的病毒基因组序列。评估病毒基因组序列的方向是否需要矫正，去除个别质量差的N碱基序列，查阅相关条目信息资料，确定序列纳入标准为有清楚的病毒分离年代、地区等资料。将序列进行整体和局部比对分析，确定各基因序列的分类。根据序列比对分析结果，同时结合病毒基因组序列中DNA聚合酶优先结合位点和最优变性温度的分析，筛选确定在各病毒基因型中高度保守的靶序列，根据靶序列分别设计特异性引物和探针，经大量筛选和人工优化获得序列分别如SEQ ID NO.1-6、SEQ ID NO.7-9所示的分别针对阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的三对特异性引物和三条特异性探针，获得检测阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒检测的实时荧光定量RT-PCR的引物探针组合。

具体本发明的技术方案如下：

本发明提供用于阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒检测的靶序列组合，其含有三条靶序列，所述靶序列具有如SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸序列。

上述靶标序列组合中，阿马帕里病毒的靶序列如SEQ ID NO.10所示，库皮科斯病毒的靶序列如SEQ ID NO.11所示，伊派病毒的靶序列如SEQ ID NO.12所示。上述序列在各病毒的不同基因型中具有高度的保守性且易于进行PCR扩增，可适用于各病毒不同基因型的高效检测。

本发明提供用于阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒检测的引物探针组合，其含有三对特异性引物和三条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7-9所示。

上述特异性引物和特异性探针中，针对阿马帕里病毒的特异性引物的序列如SEQID NO.1-2所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.7所示；针对库皮科斯病毒的特异性引物的序列如SEQ ID NO.3-4所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.8所示；针对伊派病毒的特异性引物的序列如SEQ ID NO.5-6所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明通过对多种阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的基因组序列进行比对和分析，发现了阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒基因组中的保守序列，针对该保守序列设计的引物和探针在阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的各个基因型中具有很好的普适性，同时还具有较高的特异性和灵敏度。

作为优选，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光淬灭基团，所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LC RED640、LC RED705中的任一种；所述荧光淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

进一步优选地，序列如SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记Texas Rad荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.8所示的特异性探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.9所示的特异性探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团。

本发明还提供所述靶序列组合或所述引物探针组合在制备用于检测阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的试剂盒中的应用。

本发明提供用于阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒检测的试剂盒，其包含所述引物探针组合。

作为优选，所述试剂盒还包含阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的阳性对照标准品。

所述阿马帕里病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.10所示的DNA序列对应的RNA或者阿马帕里病毒RNA。所述库皮科斯病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.11所示的DNA序列对应的RNA或者库皮科斯病毒RNA；所述伊派病毒的阳性对照标准品优选为如SEQ IDNO.12所示的DNA序列对应的RNA或者伊派病毒RNA。

进一步优选地，所述试剂盒还包含其它为实现实时荧光定量RT-PCR检测的试剂，包括但不限于反应缓冲液、酶和水等。

本发明所述引物探针组合或所述试剂盒在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的反应程序可根据所使用的逆转录酶和聚合酶的特性确定。

作为优选，所述引物探针组合或所述试剂盒在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的反应程序为：首先在50℃反应25-35min进行病毒基因组的逆转录；然后在95℃预变性8-12min，再在95℃变性10-20s、60℃退火60-90s运行40个循环进行扩增检测。采用上述反应程序，能够更好地保证阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的高效扩增检测。

本发明所述试剂盒在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2:2:1。

优选地，所述引物探针组合或所述试剂盒在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，水补足至25μL。

本发明提供的引物探针组合可在不同的反应体系中分别进行阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的检测，也可在同一反应体系中同时进行上述三种病毒的检测。

当在不同的反应体系中分别进行阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的检测时，以上所述的上游引物为SEQ ID NO.1、3、5所示引物中的任一条，下游引物为SEQ IDNO.2、4、6所示引物中的任一条，探针为SEQ ID NO.7-9所示的探针中的任一条。

当在同一反应体系中同时进行阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的检测时(三重实时荧光定量RT-PCR)，以上所述的25μL反应体系中，SEQ ID NO.1、3、5所示的上游引物各0.5μL，SEQ ID NO.2、4、6所示的下游引物各0.5μL，SEQ ID NO.7-9所示的探针各0.25μL。

本发明还提供一种利用实时荧光定量RT-PCR检测阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒方法，其为以待测样品的RNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-6所示的特异性引物和如SEQ ID NO.7-9所示的特异性探针进行实时荧光定量RT-PCR检测，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒。

以上所述的方法中，待测样品的RNA可采用本领域常规方法提取获得，如离心柱提取法等。

作为优选，所述实时荧光定量RT-PCR的反应程序为：首先在50℃反应25-35min进行病毒基因组的逆转录；然后在95℃预变性8-12min，再在95℃变性10-20s、60℃退火60-90s运行40个循环进行扩增检测。

作为优选，所述实时荧光定量RT-PCR的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2:2:1。

进一步优选地，所述实时荧光定量RT-PCR的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，无RNA水解酶的去离子水补足至25μL。

作为优选，上述根据扩增曲线判断待测样品中是否含有阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的方法如下：

有效结果判定：阳性对照(或检测管内标)Ct≤35且有扩增曲线，阴性对照管无扩增曲线或CT值>38；

若检测样品管中所测病原体对应荧光通道有扩增曲线且Ct<35，则可判断对应的该病原体检测阳性；若检测样品在检测通道无扩增曲线或Ct>38，可判样品为该病毒检测阴性；若检测样品在检测通道35<Ct<38，为可疑，建议复检，若复检结果Ct<38则可判样品为阳性，若复检结果无扩增曲线或Ct≥38，可判样品为阴性；

无效结果的判定：若检测样品为阴性，则反应体系的阳性对照(或检测管内标)必须为阳性，否则该检验管结果无效，需进行复检。

上述结果判定中，阿马帕里病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.10所示的DNA序列对应的RNA或者阿马帕里病毒RNA。所述库皮科斯病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.11所示的DNA序列对应的RNA或者库皮科斯病毒RNA；所述伊派病毒的阳性对照标准品优选为如SEQ ID NO.12所示的DNA序列对应的RNA或者伊派病毒RNA。

本发明所述的阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的实时荧光定量RT-PCR检测反应体系适用于所有的实时荧光定量PCR仪。

本发明的有益效果在于：

本发明结合相关病原体出现的几率、流行的风险和实验室检测过程的可操作性，形成以阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒为检测靶标的新的组合检测方案。

本发明通过大量序列比对分析确定了阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒高度保守的靶序列，针对确定的靶序列通过大量筛选和优化，分别获得了适用于实时荧光定量RT-PCR检测的特异性引物和探针，该引物和探针在阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的各个基因型中具有很好的普适性，同时具有较高的特异性和灵敏度。

本发明建立了检测阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的单独和多重实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法可在一个实时荧光定量RT-PCR反应体系内，引入分别针对阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的三对特异性引物和不同标记的探针，通过实时荧光信号的动态变化，对未知样本进行定性分析；也可通过标准参考品的检测，绘制标准曲线，实现对未知模板的定量分析。与其它检测方法相比，本发明提供的检测方法具有高灵敏性和特异性、可重复性好、操作简便、检测时间短、所需样本量少、低污染、节约成本等优点，可直接对未知样本里提取的RNA进行检测，可与传统检测方案互补，在病毒的快速检测中具有较高的应用价值，在阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒疾病的早发现、早诊断方面具有重要意义，可用于疑似病例、啮齿类动物、媒介生物筛查检测阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒。

附图说明

图1为本发明实施例4中实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的阿马帕里病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。

图2为本发明实施例4中实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的库皮科斯病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。

图3本发明实施例4中实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的伊派病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的特异性引物和探针的设计

1、引物和探针的设计和筛选

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)等国际公开数据库中检索下载阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的基因组序列。选择具有较明确分离日期和地区的较完整病毒基因组序列、标明标准株的基因组序列的病毒基因组序列。评估病毒基因组序列的方向是否需要矫正，去除个别质量差的N碱基序列，查阅相关条目信息资料，确定序列纳入标准为有清楚的病毒分离年代、地区等资料。分别进行整体和局部比对分析，确定各基因序列的分类，根据序列比对分析结果筛选确定在阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的各个基因型中高度保守的靶序列。

针对上述靶序列设计特异性引物和探针，同时结合病毒基因组序列中DNA聚合酶优先结合位点和最优变性温度的分析进行特异性引物和探针的设计和筛选。本发明经过大量设计、筛选和对比实验发现，并非仅满足普通引物设计原则或采用引物设计软件所设计出的引物就能够实现高效特异灵敏的实时荧光定量RT-PCR检测阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒。本发明针对引物、探针与靶序列的亲和力和错配率、引物之间的二级结构以及引物与靶序列之间的二级结构以及引物的GC含量、Tm值、长度和扩增片段长度等进行了大量人工优化设计和筛选，最终得到如下分别针对阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的特异性引物对和特异性探针(序列方向为5’-3’)：

阿马帕里病毒：

特异性引物：

Amapari-F：5’-AAACACAGCCAACTCTCTCC(SEQ ID NO.1)-3’；

Amapari-R：5’-TTCCCTGATGAGTCAGAAAGTG(SEQ ID NO.2)-3’；

特异性探针：

Amapari-P：5’-CAAAGAGAAGGCCCTTGGCCTTTTTTAGTTGG(SEQ ID NO.7)-3’；

库皮科斯病毒：

特异性引物：

Cupixi-F：5’-AGCAGTTTGGCACTCTCAG(SEQ ID NO.3)-3’；

Cupixi-R：5’-ACCCAGTCAAGAACCCAG(SEQ ID NO.4)-3’；

特异性探针：

Cupixi-P：5’-TTGAGTACGGCGACACTGGCACAGTTATG(SEQ ID NO.8)-3’；

伊派病毒：

特异性引物：

Ippy-F：5’-TGAGACCAGAAGGCATCC(SEQ ID NO.5)-3’；

Ippy-R：5’-TGTAGTTGATCTCGGACCAC(SEQ ID NO.6)-3’；

特异性探针：

Ippy-P：5’-TGTCCGGCCCCTTTGGGTTTAGCTGGAC(SEQ ID NO.9)-3’。

2、引物和探针的合成

上述引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成。

实施例2实时荧光定量RT-PCR检测阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的检测方法的建立

1、病毒核酸的提取收集待测病毒的细胞培养上清，采用QIAamp Viral RNA MiniKit提取病毒核酸。

2、阳性标准品的制备

对于三种病毒，通过合成三种病毒基因的保守区(阿马帕里病毒的保守区序列如SEQ ID NO.10所示，库皮科斯病毒的保守区序列如SEQ ID NO.11所示，伊派病毒的保守区序列如SEQ ID NO.12所示)作为阳性标准品，将合成的目的基因克隆至pET-28a(+)载体中(酶切位点为NdeⅠ和XhoⅠ)，基因合成与质粒克隆由北京天一辉远生物公司完成。用thermo公司2×PCR Mix试剂对克隆质粒中含有的目的基因进行普通PCR扩增，扩增引物用通用引物T7(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)和T7t(5’-ACATCCACTTTGCCTTTCTC-3’)。体外转录为RNA，纯化回收定量而获得。采用Qian公司Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化PCR产物，Nanodrop紫外可见分光光度计对回收的DNA模板定量。采用Promega公司Ribomaxtm largescale RNA production system-sf6and T7试剂盒进行目的基因的RNA体外转录，Qian公司RNeasy mini kit对RNA体外转录产物回收。上述操作均按照试剂盒说明进行。

3、实时荧光定量RT-PCR检测

采用AgPath-ID One Step RT-PCR Kit(Ambion)试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR反应，利用实施例1最终获得的特异性引物(序列如SEQ ID NO.1-6所示)和探针(序列如SEQID NO.7-9所示)进行实时荧光定量RT-PCR检测。

本发明通过优化实施例1获得的用于三种病毒检测的特异性引物和探针的反应条件，使其能够实现高效的组合检测，具体反应条件如下：

25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，无RNA水解酶的去离子水补足至25μL；

本发明的引物探针组合可在不同的反应体系中分别进行阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的检测，也可在同一反应体系中同时进行上述三种病毒的检测。

当在不同的反应体系中分别进行阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的检测时，以上所述的上游引物为SEQ ID NO.1、3、5所示引物中的任一条，下游引物为SEQ IDNO.2、4、6所示引物中的任一条。

当在同一反应体系中同时进行阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的检测时(三重实时荧光定量RT-PCR)，以上所述的25μL反应体系中，SEQ ID NO.1、3、5所示的上游引物各0.5μL，SEQ ID NO.2、4、6所示的下游引物各0.5μL，SEQ ID NO.7-9所示的探针各0.25μL。

反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min；95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环。

4、结果分析和判断

检测结果需根据反应体系中所设置的阳性对照(或检测管内标)和用无RNA水解酶的去离子水作为阴性对照的扩增结果和扩增曲线进行判断。

有效结果判定：阳性对照(或检测管内标)Ct≤35且有扩增曲线，阴性对照管无扩增曲线或CT值>38。

若检测样品管中所测病原体对应荧光通道有扩增曲线且Ct<35，则可判断对应的该病原体检测阳性；若检测样品在检测通道无扩增曲线或Ct>38，可判样品为该病毒检测阴性；若检测样品在检测通道35<Ct<38，为可疑，建议复检，若复检结果Ct<38则可判样品为阳性，若复检结果无扩增曲线或Ct≥38，可判样品为阴性。

无效结果的判定：若检测样品为阴性，则反应体系的阳性对照(或检测管内标)必须为阳性，否则该检验管结果无效，需进行复检。

实施例3实时荧光定量RT-PCR检测方法的特异性分析

以阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒体外转录合成的RNA标准品作为阳性对照，将汉城病毒、汉滩病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、登革病毒1～4型，鸠宁病毒、Sabia病毒、拉沙热病毒、马秋波病毒、瓜纳瑞托病毒、查帕雷病毒、卢约病毒和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒共8种沙粒病毒RNA，以及100份健康人血清RNA提取物作为对照病毒，对实施例2提供的检测方法进行特异性分析。

采用实施例2的检测方法进行实时荧光定量RT-PCR检测，具体处理组设计如下：以阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒体外转录合成的RNA标准品(浓度为1×10⁸copies/uL)为阳性对照；以汉城病毒、汉滩病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、登革病毒1～4型病毒，鸠宁病毒、Sabia病毒、拉沙热病毒、马秋波病毒、瓜纳瑞托病毒、查帕雷病毒、卢约病毒和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒共8种沙粒病毒RNA以及100份健康人血清RNA提取物进行特异性验证，结果如表1所示。

表1三种沙粒病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性分析

实施例4实时荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度(检测限)分析

对实施例2制备的阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒体外转录的RNA(阳性标准品)进行定量，根据如下公式计算RNA拷贝数：Y(copies/μl)＝X(g/μl)×6.02×10²³/Transcript length in nucleotides×340，其中Y为RNA拷贝数，X为RNA的浓度。对上述已知浓度的RNA进行10倍系列稀释，对体外转录的阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒标准品RNA稀释成1×10⁸copies/μL至1×10¹copies/μL共8个浓度梯度。

以上述梯度稀释的不同浓度的RNA为模板，采用实施例2中的检测方法进行实时荧光定量RT-PCR检测，确定实施例2的检测方法的检测限。

各病毒各浓度的扩增曲线如图1、图2和图3所示。以不同浓度样本的拷贝数为横坐标，循环阈值(CT)为纵坐标，制作标准曲线，通过所得标准曲线获得三种病毒各自的单重实时荧光RT-PCR的检出限(表2)，结果表明，本发明的引物探针组合和检测方法具有良好的灵敏度。

表2阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的单重实时荧光定量RT-PCR结果

实施例5实时荧光定量RT-PCR检测方法的可重复性分析

分别选取稀释度为1×10⁶copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10²copies/μL的三个不同浓度梯度的阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒体外转录RNA标准品为模板，分别进行5次平行重复实验验证实施例2提供的检测方法的稳定重复性。

循环阈值(CT)的平均值、变异系数(CV)和标准差(SD)的结果如表3所示，阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒各次检测实验的标准差均控制在0.5以内，变异系数在2％以下说明本发明的检测方法具有较好的稳定性和可重复性。

表3阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的稳定性评价

上文中用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120> 用于阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法

<130> KHP211110050.1

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaacacagcc aactctctcc 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttccctgatg agtcagaaag tg 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcagtttgg cactctcag 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acccagtcaa gaacccag 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgagaccaga aggcatcc 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtagttgat ctcggaccac 20

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaagagaag gcccttggcc ttttttagtt gg 32

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttgagtacgg cgacactggc acagttatg 29

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtccggccc ctttgggttt agctggac 28

<210> 10

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcattacaac acactagcat ttctattaaa aaacacagcc aactctctcc caaagagaag 60

gcccttggcc ttttttagtt ggtcactttc tgactcatca gggaatgaca tgccaggtgg 120

gtactgtctt gaggaatgga tgctcattgc 150

<210> 11

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acctataact tggttaggct ctctcataat agcagtttgg cactctcagt tgagtacggc 60

gacactggca cagttatgtg tgaacatggg catgtggtta gtggaaacta caccgaatgc 120

actggagctt ccgaggaata caactgggtt cttgactggg tcctgagagg tctacaacat 180

<210> 12

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggatccacg gcggccatca gatctttaag agctagtatc tgagacattg tgagaccaga 60

aggcatcccg tgtccggccc ctttgggttt agctggactc atctgtttgt tttgggacag 120

atcaatgggt ggtccgagat caactacagt attgtcccaa gcccttcctg tcagacttgt 180

tctgcatgct atataaggcc 200

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taatacgact cactataggg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acatccactt tgcctttctc 20

Claims (11)

1.用于阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒检测的引物探针组合，其特征在于，含有三对特异性引物和三条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7-9所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光淬灭基团；

所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LCRED640、LC RED705中的任一种；所述荧光淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，序列如SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记Texas Rad荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团；序列如SEQ IDNO.8所示的特异性探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.9所示的特异性探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团。

4.权利要求1～3任一项所述的引物探针组合在制备用于检测阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的试剂盒中的应用。

5.用于阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的引物探针组合。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR检测时的反应程序为：首先在50℃反应25-35min进行病毒基因组的逆转录；然后在95℃反应8-12min，再在95℃变性10-20s、60℃退火60-90s运行40个循环进行扩增检测。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2:2:1。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，水补足至25μL。

9.一种利用实时荧光定量RT-PCR检测阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，以待测样品的RNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-6所示的特异性引物和如SEQ ID NO.7-9所示的特异性探针进行实时荧光定量RT-PCR，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR的反应程序为：首先在50℃反应25-35min进行病毒基因组的逆转录；然后在95℃反应8-12min，再在95℃变性10-20s、60℃退火60-90s运行40个循环进行扩增检测；

和/或，所述实时荧光定量RT-PCR的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2:2:1。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，水补足至25μL。

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