CN113913557A - 一种快速检测汉坦病毒seov-s4亚型的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种快速检测汉坦病毒seov-s4亚型的试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种快速检测汉坦病毒SEOV‑S4亚型的试剂盒及其检测方法，该方法包括：针对汉坦病毒SEOV‑S4亚型较为保守的S片段核酸序列设计的特异性等温扩增引物和相应可被RNaseH酶切的含RNA碱基的rProbe探针；其中rProbe两端分别设计荧光基团和淬灭基团，通过RNaseH切割RNA碱基使之游离后，利用DNA聚合酶的活性和高效的等温扩增的引物、探针，可以对汉坦病毒SEOV‑S4亚型进行快速检测，本发明具有灵敏度稳定性高，特异性强的优点，具有很强的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的试剂盒及其检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
汉坦病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，临床上可引起2种严重的急性传染性疾病，即肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合症。中国是受汉坦病毒危害最严重的国家，病例分布广泛，发病人数和死亡人数均居世界首位。其基因组为分节段的单股负链RNA，由S、M、L 3个RNA片段组成，每个基因片段都只有一个开放读码框。
汉坦病毒是在上个世纪50年代首次在朝鲜发现的，当时有3000多名联合国士兵患上了“朝鲜出血热”，即肾综合征出血热。该病1993年第二次爆发于美国四角地区，最初被称为四角病，现在被称为汉坦病毒肺综合征。汉坦病毒是一种人畜共患病病原体，以啮齿动物、蝙蝠、鼹鼠和地鼠等小型哺乳动物作为自然宿主和主要传染源，仅在阿根廷的安第斯病毒中证实了人与人之间的传播，它会通过宿主的排泄物或飞沫向人类传播，其感染传播的风险覆盖全球大多数国家和地区。据统计，在全世界每年登记的病例超过20万例，肾综合征出血热的病死率在0.1％-15％之间，肾综合征出血热的病死率在20％-40％之间，肾综合征出血热是由汉滩型、汉城型、普玛拉型和多不拉伐型等几种正汉坦病毒引起的，而无名病毒和纽约病毒与肺综合症出血热有关，其中肺综合症出血热多发于欧亚大陆，肾综合征出血热多发于美洲地区。在亚洲，主要流行的是汉滩型病毒和汉城型病毒，其中汉滩型型可分为9个亚型，汉城型则有4～6个亚型。
聚合酶链式反应是目前使用最为广泛的核酸扩增技术，但PCR技术在生产实践中，需要使用PCR仪、电泳仪等仪器才得以进行，并且在实验过程中需要对温度进行升降调节，这也使得该技术对PCR仪的依赖性较强，同时一个实验完成所需的时间较长，不够便捷快速且成本高，对现场的大规模快速检测和一些条件不充足的地区来说是比较不理想的一种方法，这是目前普通PCR技术所无法逾越的局限性，由于我国的汉坦病毒的危害肆虐严重，一些汉坦病毒的基因型或亚型缺乏快速诊断检测方法，这种局限性也导致了不能更加快速的确定人群感染亚型并进行病原体溯源，迫切需要建立相关亚型的特异性检测手段。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种酶切探针等温扩增技术快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的方法及其试剂盒，所述试剂盒包括：检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的等温扩增引物和相应可被RNaseH酶切的含RNA碱基探针；其中该碱基探针的RNA碱基左、右两端分别标记报告荧光基团和淬灭基团。本发明利用该技术针对汉坦病毒SEOV-S4亚型的核酸保守区域设计了特异性的等温扩增引物和rProbe探针，结合耐高温的RNaseH，通过RNaseH可酶切DNA与RNA杂交链中的RNA的磷酸二酯键的特性，当待测样本中含有靶标核酸时，通过等温扩增出大量靶标DNA/cDNA，rProbe会与目标DNA/cDNA结合形成探针-目标核酸杂交双链，再通过RNaseH切割探针-目标核酸杂交双链中的RNA碱基，使得RNA碱基及其右侧含有淬灭基团的探针片段游离出去，而在RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链且可作为引物继续延伸，同时荧光基团发出荧光，从而判定目标核酸的存在。其具体技术方案如下：
本发明快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的试剂盒，包括核酸反应液、检测酶液、阳性质控品和阴性对照品，
所述核酸反应液包括特异性酶切等温扩增引物、核糖核酸酶RNaseH、rProbe探针，所述核糖核酸酶RNaseH为耐热核糖核酸酶RNaseH，所述rProbe探针上包括一个RNA碱基，且rProbe探针两端的DNA碱基上分别标记有荧光基团和淬灭基团,
所述检测酶液包括Bst核酸聚合酶与AMV逆转录酶，
所述阳性质控品为汉坦病毒SEOV-S4亚型的假病毒，阴性对照品为无RNA/DNA水。
进一步的，所述特异性酶切等温扩增引物的序列如SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.14，所述rProbe探针是可被RNaseH酶切的探针，其序列如SEQ ID NO.28。
进一步的，还包括内参对照品，该内参对照品为外源内参基因片段假病毒。
进一步的，所述内参对照品为一段人工合成且与汉城病毒SEOV-S4亚型及人源核酸均非同源的内参基因等温扩增引物。
进一步的，所述等温扩增引物序列具体如如SEQ ID NO.24-SEQ ID NO.26，所用的探针序列如SEQ ID NO.27。
进一步的，序列如SEQ ID NO.28的rProbe探针和序列如SEQ ID NO.27的探针分别由不同的荧光色标记。
进一步的，荧光基团为FAM，淬灭基团为CY5。
基于上述试剂盒进行快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的方法，包括以下步骤：
步骤1：试剂盒制备
假病毒的制备：将编码MS2噬菌体相应蛋白的cDNA序列连接到原核表达载体(PET-42a)启动子下游，构建表达载体pNCCL(pET42-CP)，然后把汉坦病毒SEOV-S480-39的cDNA序列构建于表达载体中的MS2噬菌体包膜蛋白基因序列下游，取50μl菌液加入到5ml的LB液体培养基中，于37℃，220rpm震荡培养3h到对数生长期，再向其中加入IPTG，使其终浓度为1mM，继续将其于37℃，200rpm孵育3h；然后收集细胞，加入0.5ml超声缓冲液，冰上超声：350W，停5s，超声5s，30个循环；随即于6000rpm转速离心10min，收集上清，得到假病毒溶液，使用RNA提取试剂盒提取具有耐RNase特性的内含外源RNA序列的病毒样颗粒待用；
阳性质控品的制备：将步骤1.1获得的假病毒溶液梯度稀释后，提取RNA，选择Tt值在15-20的假病毒稀释度作为阳性质控品中假病毒溶液的浓度，将假病毒溶液与内参质粒混合，保持该混合溶液中假病毒溶液的终浓度与上述假病毒的稀释度一致，此混合溶液中内参质粒的终浓度为1000copies/μL，此混合溶液即为阳性质控品；
最后制备核酸反应液、检测酶液、阴性对照品和内参对照品，其中核酸反应液包括引物、探针、核糖核酸酶RNaseH、甜菜碱、dNTP、MgSO4以及buffer；检测酶液包括Bst聚合酶和AMV逆转录酶；阳性质控品为上述制备的浓度2000Copies/mL的汉坦病毒SEOV-S4亚型的假病毒，内参对照品为所述外源内参假病毒，浓度为1000Copies/mL；阴性对照品为无RNA/DNA水；
步骤2：引物探针筛选
选择汉坦病毒SEOV-S4亚型的保守区域S片段作为扩增的靶标基因，位置为基因组序列的850-1769bp，设计特异性的引物和含RNA碱基的探针rProbe，其中rProbe的RNA碱基左、右两端分别标记FAM荧光基团和CY5淬灭基团；体系中设有一组外源内参，作为对试剂以及操作本身的质控，以避免假阴性；
步骤3：二重实时等温扩增体系
汉坦病毒和内参使用的引物和探针进行组合二重实时等温扩增反应体系，检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的二重实时等温扩增反应体系为30μL，二重实时等温扩增反应程序为：63℃扩增1min，40个循环，收集荧光基团FAM和淬灭基团CY5；
步骤4：结果判定
靶标阳性：FAM通道Ct≤38，CY5通道无需参看，
靶标阴性：FAM通道Ct>38，且CY5通道Ct<40，
检测无效：FAM通道Ct>38或者无扩增信息，且CY5通道无扩增信号，此情况需要重新提取样本，进行复测。
有益效果：在酶切等温扩增技术的基础上，分别对应不同的区域进行引物和探针的设计，检测汉坦病毒RNA核酸，灵敏度高，特异性强，具有很强的实际应用价值，在有目标核酸存在的情况下，因为rProbe本身是一种线性探针且标记基团简单，它更容易与目标核酸结合，从而灵敏度得到提高；与单重等温扩增方式相比：其可以加入内参的检测，使得检测结果更加有效可靠，且结果判断方式也更加客观。整个过程闭管操作，避免扩增污染；时间快速，检测病原体RNA在1个小时内完成，最快可30min内出检测报告，实时扩增，含有可酶切的探针可实时观察扩增情况。
附图说明
图1是本发明检测方法的原理示意图，
图2是本发明实施例中靶序列假病毒的测序图，
图3是本发明实施例中试剂盒在10Copies/mL重复20次检测的灵敏度验证结果图，
图4是本发明实施例中试剂盒检测其他人基因组核酸的交叉扩增阴性对照结果图，
图5是本发明实施例中试剂盒检测的空白对照结果图，
图6是本发明实施例中试剂盒检测中阳性质控品的阳性对照结果图，
附图标记：1-等温扩增引物，2-含RNA碱基的探针，3-RNaseH，4-酶切后带有荧光基团的探针片段，5-酶切后游离的淬灭基团。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。以下实施例中，所用的试剂和材料，如无特殊说明，均为本领域常规生化试剂公司购买得到的。如图1所示，1为等温扩增引物，2为含RNA碱基的探针，3为RNaseH，4为酶切后带有荧光基团的探针片段，5为酶切后游离的淬灭基团，R为探针内的RNA碱基，本发明针对汉坦病毒SEOV-S4亚型的核酸保守区域设计了特异性的等温扩增引物和探针，其中rProbe两端分别设计荧光基团和淬灭基团。利用DNA聚合酶的活性扩增待测目标核酸序列，同时rProbe结合到相应的待测目标序列上，形成探针-目标核酸杂交双链，再通过RNaseH切割探针-目标核酸杂交双链中的RNA碱基，使得RNA碱基及其右侧含有淬灭基团的探针片段游离出去，而在RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链且可作为引物继续延伸，同时荧光基团发出荧光。通过判断是否有扩增信号，来指示靶标核酸的有无。
实施例
汉坦病毒SEOV-S4亚型检测试剂盒(酶切探针恒温扩增法)制备
步骤1：试剂盒制备
假病毒的制备：将编码MS2噬菌体相应蛋白的cDNA序列连接到原核表达载体(PET-42a)启动子下游，构建表达载体pNCCL(pET42-CP)，然后把汉坦病毒SEOV-S480-39的cDNA序列构建于表达载体中的MS2噬菌体包膜蛋白基因序列下游，取50μl菌液加入到5ml的LB液体培养基中，于37℃，220rpm震荡培养3h到对数生长期，再向其中加入IPTG，使其终浓度为1mM，继续将其于37℃，200rpm孵育3h；然后收集细胞，加入0.5ml超声缓冲液，冰上超声：350W，停5s，超声5s，30个循环；随即于6000rpm转速离心10min，收集上清，得到假病毒溶液，使用RNA提取试剂盒提取具有耐RNase特性的内含外源RNA序列的病毒样颗粒，用于后续靶标检测的验证，靶基因合成的测序结果如图2所示；
阳性质控品的制备：将步骤1.1获得的假病毒溶液梯度稀释后，提取RNA，选择Tt值在15-20的假病毒稀释度作为阳性质控品中假病毒溶液的浓度，将假病毒溶液与内参质粒混合，保持该混合溶液中假病毒溶液的终浓度与上述假病毒的稀释度一致，此混合溶液中内参质粒的终浓度为1000copies/μL，此混合溶液即为阳性质控品；
最后制备核酸反应液、检测酶液、阴性对照品和内参对照品，其中核酸反应液包括引物、探针、核糖核酸酶RNaseH、甜菜碱、dNTP、MgSO4以及buffer；检测酶液包括Bst聚合酶和AMV逆转录酶；阳性质控品为上述制备的浓度2000Copies/mL的汉坦病毒SEOV-S4亚型的假病毒，内参对照品为所述外源内参假病毒，浓度为1000Copies/mL；阴性对照品为无RNA/DNA水；
步骤2：引物探针筛选
选择汉坦病毒SEOV-S4亚型的保守区域S片段作为扩增的靶标基因，位置为基因组序列的850-1769bp，设计特异性的引物和含RNA碱基的探针rProbe，其中rProbe的RNA碱基左、右两端分别标记FAM荧光基团和CY5淬灭基团；体系中设有一组外源内参，作为对试剂以及操作本身的质控，以避免假阴性；选取的引物探针组合序列见表1和表2；
表1汉坦病毒SEOV-S4亚型靶标引物探针序列筛选
表2外源内参引物探针序列的选用
经进一步灵敏度与特异性验证：第二套引物符合性能要求。
步骤3：二重实时等温扩增体系
经过灵敏度与特异性筛选评价，汉坦病毒和内参使用的引物和探针进行组合二重实时等温扩增反应体系，引物和探针信息如表3，检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的二重实时等温扩增反应体系为30μL，其核酸反应液的组分与终浓度如表4所示，二重实时等温扩增反应程序为：63℃扩增1min，40个循环，收集荧光基团FAM和淬灭基团CY5；
表3二重实时等温扩增的引物与探针组合
表4二重实时等温扩增反应体系
步骤4：结果判定
靶标阳性：FAM通道Ct≤38，CY5通道无需参看，
靶标阴性：FAM通道Ct>38，且CY5通道Ct<40，
检测无效：FAM通道Ct>38或者无扩增信息，且CY5通道无扩增信号，此情况需要重新提取样本，进行复测。
汉坦病毒SEOV-S4亚型检测试剂盒(酶切探针等温扩增法)验证结果
汉坦病毒SEOV-S4亚型第二套引物探针组合检测假病毒灵敏度最高，最低检测限可达到10copies/uL，且与人源DNA及汉坦病毒汉滩亚型无交叉，总验证结果如表5所示。
表5汉坦病毒和内参引物二重组合检测结果
| 样品 | 汉坦病毒 | 内参 |
| 假病毒 | + | + |
| 阳性质控品 | + | + |
| 人源DNA | + | + |
| 空白对照 | - | - |
汉坦病毒SEOV-S4亚型检测试剂盒检测灵敏度：
使用制备的汉坦病毒假病毒阳性样本，用ddPCR进行浓度标定，在最低检测限处对样品重复检测20次，确定试剂盒的检测灵敏度，假病毒重复检测20次结果见图3。结果显示试剂盒在最低检测限处重复检20次均能稳定检出，因此确定试剂盒的检测限为10Copies/uL。
汉坦病毒SEOV-S4亚型检测试剂盒检测特异性：
为了排除本试剂盒与其他病原体的交叉反应，选取人源基因验证汉坦病毒SEOV-S4亚型检测试剂盒的检测特异性，按照上述操作步骤进行检测。结果如图4显示靶标通道(FAM)均无扩出，表明本体系无人源非特异扩出，说明试剂盒的特异性。另外该体系检测空白对照的多孔验证，见图5所示，显示靶标通道无非特异扩增。
临床样本验证：
按照上述操作步骤检测9例汉滩亚型样本的结果见下表6，因为汉滩与汉城分属两个不同的种，所以这9例临床样本与建立体系检测的型别的序列不一致，经验证结果9例临床样本均未扩出，符合实际情况。
表6临床上9例汉滩病毒样本检测结果
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心
<120> 一种快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的试剂盒及其检测方法
<160> 28
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<400> 27
tgtagtccaa aatcattctc catgc 25
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
ccagtgctca aaggagtcaa attacattac 30
Claims (8)
1.一种快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的试剂盒，其特征在于，包括核酸反应液、检测酶液、阳性质控品和阴性对照品，
所述核酸反应液包括特异性酶切等温扩增引物、核糖核酸酶RNaseH、rProbe探针，所述核糖核酸酶RNaseH为耐热核糖核酸酶RNaseH，所述rProbe探针上包括一个RNA碱基，且rProbe探针两端的DNA碱基上分别标记有荧光基团和淬灭基团,
所述检测酶液包括Bst核酸聚合酶与AMV逆转录酶，
所述阳性质控品为汉坦病毒SEOV-S4亚型的假病毒，阴性对照品为无RNA/DNA水。
2.根据权利要求1所述的快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的试剂盒，其特征在于，所述特异性酶切等温扩增引物的序列如SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.14，所述rProbe探针是可被RNaseH酶切的探针，其序列如SEQ ID NO.28。
3.根据权利要求1所述的快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的试剂盒，其特征在于，还包括内参对照品，该内参对照品为外源内参基因片段假病毒。
4.根据权利要求3所述的快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的试剂盒，其特征在于，所述内参对照品为一段人工合成且与汉城病毒SEOV-S4亚型及人源核酸均非同源的内参基因等温扩增引物。
5.根据权利要求4所述的快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的试剂盒，其特征在于，所述等温扩增引物序列具体如如SEQ ID NO.24-SEQ ID NO.26，所用的探针序列如SEQ IDNO.27。
6.根据权利要求2或5所述的快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的试剂盒，其特征在于，序列如SEQ ID NO.28的rProbe探针和序列如SEQ ID NO.27的探针分别由不同的荧光色标记。
7.根据权利要求1所述的快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的试剂盒，其特征在于，荧光基团为FAM，淬灭基团为CY5。
8.基于上述任一权利要求所述的试剂盒进行快速检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：试剂盒制备
假病毒的制备：将编码MS2噬菌体相应蛋白的cDNA序列连接到原核表达载体(PET-42a)启动子下游，构建表达载体pNCCL(pET42-CP)，然后把汉坦病毒SEOV-S480-39的cDNA序列构建于表达载体中的MS2噬菌体包膜蛋白基因序列下游，取50μl菌液加入到5ml的LB液体培养基中，于37℃，220rpm震荡培养3h到对数生长期，再向其中加入IPTG，使其终浓度为1mM，继续将其于37℃，200rpm孵育3h；然后收集细胞，加入0.5ml超声缓冲液，冰上超声：350W，停5s，超声5s，30个循环；随即于6000rpm转速离心10min，收集上清，得到假病毒溶液，使用RNA提取试剂盒提取具有耐RNase特性的内含外源RNA序列的病毒样颗粒待用；
阳性质控品的制备：将步骤1.1获得的假病毒溶液梯度稀释后，提取RNA，选择Tt值在15-20的假病毒稀释度作为阳性质控品中假病毒溶液的浓度，将假病毒溶液与内参质粒混合，保持该混合溶液中假病毒溶液的终浓度与上述假病毒的稀释度一致，此混合溶液中内参质粒的终浓度为1000copies/μL，此混合溶液即为阳性质控品；
最后制备核酸反应液、检测酶液、阴性对照品和内参对照品，其中核酸反应液包括引物、探针、核糖核酸酶RNaseH、甜菜碱、dNTP、MgSO4以及buffer；检测酶液包括Bst聚合酶和AMV逆转录酶；阳性质控品为上述制备的浓度2000Copies/mL的汉坦病毒SEOV-S4亚型的假病毒，内参对照品为所述外源内参假病毒，浓度为1000Copies/mL；阴性对照品为无RNA/DNA水；
步骤2：引物探针筛选
选择汉坦病毒SEOV-S4亚型的保守区域S片段作为扩增的靶标基因，位置为基因组序列的850-1769bp，设计特异性的引物和含RNA碱基的探针rProbe，其中rProbe的RNA碱基左、右两端分别标记FAM荧光基团和CY5淬灭基团；体系中设有一组外源内参，作为对试剂以及操作本身的质控，以避免假阴性；
步骤3：二重实时等温扩增体系
汉坦病毒和内参使用的引物和探针进行组合二重实时等温扩增反应体系，检测汉坦病毒SEOV-S4亚型的二重实时等温扩增反应体系为30μL，二重实时等温扩增反应程序为：63℃扩增1min，40个循环，收集荧光基团FAM和淬灭基团CY5；
步骤4：结果判定
靶标阳性：FAM通道Ct≤38，CY5通道无需参看，
靶标阴性：FAM通道Ct>38，且CY5通道Ct<40，
检测无效：FAM通道Ct>38或者无扩增信息，且CY5通道无扩增信号，此情况需要重新提取样本，进行复测。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104946799A (zh) * | 2015-07-02 | 2015-09-30 | 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 汉坦病毒rt-lamp核酸检测引物及检测试剂盒 |
| CN107574261A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-01-12 | 吉林医药学院 | 用于检测汉坦病毒的检测引物、检测试剂盒及检测方法 |
| WO2021195023A2 (en) * | 2020-03-23 | 2021-09-30 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for enhancing detection of rna |
-
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Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN104946799A (zh) * | 2015-07-02 | 2015-09-30 | 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 汉坦病毒rt-lamp核酸检测引物及检测试剂盒 |
| CN107574261A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-01-12 | 吉林医药学院 | 用于检测汉坦病毒的检测引物、检测试剂盒及检测方法 |
| WO2021195023A2 (en) * | 2020-03-23 | 2021-09-30 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for enhancing detection of rna |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李家樵等: "基于酶切探针等温扩增技术快速检测汉坦病毒S4亚型方法的建立", 寄生虫与医学昆虫学报, vol. 28, no. 4, pages 243 - 249 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114507752A (zh) * | 2021-03-19 | 2022-05-17 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种检测汉城型汉坦病毒的试剂盒及其检测方法 |
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