CN114807437B - 一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括热启动Taq DNA聚合酶、无酶水、PCR反应液、探针法荧光定量PCR配套Buffer，以及用于检测G1基因型猪流行性腹泻病毒、G2基因型猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒的四对特异性引物和相应的TaqMan探针及对照品。本发明的试剂盒实现了在一个PCR反应管中同时检测四种能够引起猪腹泻的病毒，并具有极佳的特异性和重复性，可直接应用于猪临床腹泻样品的常规实验室诊断，为猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的流行病学研究提供快速、准确的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
猪病毒性腹泻疾病是我国养猪业在生产、繁殖上面临的一大困境，目前临床上以猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)感染引起的病毒性腹泻最为常见，尤其是G2基因型PEDV在2010年后广泛流行，并且常伴有多种腹泻病原的混合感染，常见的如猪A群轮状病毒(Rotavirus A，RVA)或猪C群轮状病毒(Rotavirus C，RVC)。这些病毒性腹泻病原的传染性和致病性较高，危害较大，但仅通过临床症状难以有效区分，其病因的复杂性给相关检测、诊断和防治工作带来了巨大的挑战。因此，针对养猪业常见的病毒性腹泻病原建立一种简便，快速，高效和经济的检测方法是目前兽医临床实践中急需解决的问题。
多重qPCR检测技术可以在一个反应中同时检测出多种病原，能够对临床上复杂多变的共感染腹泻样品进行快速的鉴别区分，并且该技术相比于普通PCR具有更好的灵敏度，无需电泳和测序分析便可直接分析结果等优点，极大地缩短了检测过程中的物料成本和检测人员的时间成本，尤其适用于大规模的样本检测或混合感染样本的鉴别诊断。由于多重qPCR在一个反应体系中同时存在多对引物及探针，为了保证其有效进行，各引物对和探针之间就要保持高度的特异性以避免出现非特异性的扩增产物。另外，临床样品中复杂的核酸环境，以及不同引物对退火温度的差异也是制约多重qPCR检测方法建立的主要因素。虽然建立一种多重TaqMan探针法qPCR检测方法面临的困难颇多，但对于临床快速检测并明确猪病毒性腹泻的感染病原具有极高的临床生产价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用，能够同时检测G1和G2基因型猪流行性腹泻病毒，以及猪A群和C群轮状病毒。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒，包括热启动Taq DNA聚合酶、无酶水、PCR反应液、探针法荧光定量PCR配套Buffer，以及用于检测G1基因型猪流行性腹泻病毒、G2基因型猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒的四对特异性引物和相应的TaqMan探针及对照品；其中，所述PCR反应液含有Mg2+离子、PCR缓冲液、dNTPs混合物；
用于检测G1基因型猪流行性腹泻病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
PEDV-G1(F)如SEQ ID NO.1所示；
PEDV-G1(R)如SEQ ID NO.2所示；
PEDV-G1-Probe如SEQ ID NO.3所示；
用于检测G2基因型猪流行性腹泻病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
PEDV-G2(F)如SEQ ID NO.4所示；
PEDV-G2(R)如SEQ ID NO.5所示；
PEDV-G2-Probe如SEQ ID NO.6所示；
用于检测猪A群轮状病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
RVA(F)如SEQ ID NO.7所示；
RVA(R)如SEQ ID NO.8所示；
RVA-Probe如SEQ ID NO.9所示；
用于检测猪C群轮状病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
RVC(F)如SEQ ID NO.10所示；
RVC(R)如SEQ ID NO.11所示；
RVC-Probe如SEQ ID NO.12所示。
优选地，所述对照品包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为带有G1基因型猪流行性腹泻病毒和G2基因型猪流行性腹泻病毒的S基因片段、猪A群轮状病毒和猪C群轮状病毒的VP6基因片段的标准品模板，所述阴性对照品为无核酶水。
优选地，所述标准品模板为分别将G1基因型猪流行性腹泻病毒和G2基因型猪流行性腹泻病毒的S基因片段、猪A群轮状病毒和猪C群轮状病毒的VP6基因片段四种目的基因扩增，连入pMD18-T载体，构建的重组质粒。
优选地，所述试剂盒保存于-20℃，并避免反复冻融。
上述试剂盒在检测G1基因型猪流行性腹泻病毒、G2基因型猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒和猪C群轮状病毒基因中应用。
优选地，检测方法包括以下步骤：
步骤1)获取待检样品的cDNA：提取肛拭子样品、腹泻粪便样品或消化道组织的总RNA，反转录为cDNA模板；
步骤2)使用试剂盒中的四对qPCR引物和相应的TaqMan探针进行检测：将所述四对qPCR引物和相应的TaqMan探针置于qPCR反应体系中，以步骤1)中获得的cDNA作为模板，进行PCR扩增，收集荧光信号；
步骤3)根据机器测算的荧光信号及Cq值判断样品中是否有PEDV-G1(FAM)、PEDV-G2(Texas Red)、RVA(CY5)、RVC(VIC)，Cq值＞35的结果判断为阴性。
优选地，步骤1)所述反转录的步骤如下：使用
Ⅱ1st Strand cDNASynthesis Kit进行，其反应总体系为20μL，包括：1μL Random hexamers，1μL Oligo(dT)23VN，5μL nuclease-free Water，5μL总RNA，混匀后65℃加热5min，冰浴3min，继续加入：4μL 4×gDNA wiper Mix，混匀后42℃加热2min，继续加入：2μL 10×RT Mix、2μL 
ⅡEnzyme Mix；反应程序为：25℃加热5min，50℃加热45min，85℃加热2min，反应后得到cDNA模板。
优选地，步骤2)所述qPCR反应体系如下：10μL Probe Master Mix，PEDV-G1(F)、PEDV-G1(R)、PEDV-G2(F)、PEDV-G2(R)、RVA(F)、RVA(R)、RVC(F)和RVC(R)各0.3μL，PEDV-G1-Probe、PEDV-G2-Probe、RVA-Probe和RVC-Probe各0.2μL，cDNA模板2μL，无核酶水加至体系总体积为20μL。
优选地，步骤2)所述PCR扩增的反应程序如下：荧光通道设置为：通道1：FAM，通道2：VIC，通道3：Texas Red，通道4：CY5；温控程序设置为：95℃预变性10min；95℃变性10s，59℃退火10s，72℃延伸20s，45个循环；同时以荧光定量PCR仪器收集荧光信号。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明的试剂盒能够在一个PCR反应管中同时鉴别检测出G1基因型和G2基因型猪流行性腹泻病毒，以及猪A群和C群轮状病毒，为这四种病原的检测提供了一种简便、高效和低成本的方法。
(2)本发明的试剂盒在对各靶标病毒阳性样品进行检测中，检测结果与单一的qPCR检测结果一致，进一步证明了本发明方法的可行性。同时经过验证得知，本发明的试剂盒可以检测G1基因型和G2基因型猪流行性腹泻病毒的阳性样品最低浓度为20copies/μL和100copies/μL，可以检测猪A群和C群轮状病毒的阳性样品最低浓度为50copies/μL，同时具有极佳的特异性和重复性。
(3)本发明的试剂盒为该类病的防控提供了可靠的技术支持，并且在很大程度上降低了单重检测方法的工作量，工作效率得到了大幅度地提升。
(4)本发明的试剂盒的重复性、灵敏性优秀，可以同时对四种猪腹泻病毒进行快速高效的临床检测，从而同时对这四种猪病毒性腹泻病原进行诊断和监控。
附图说明
图1为实施例2中四重TaqMan qPCR检测方法的标准品和标准曲线的制备：A、B、C、D分别为PEDV-G1、PEDV-G2、RVA和RVC的质粒标准品由1×107copies/μL-1×101copies/μL 7个浓度梯度的荧光扩增曲线；E、F、G、H分别为PEDV-G1、PEDV-G2、RVA和RVC的标准品稀释的标准曲线；
图2为实施例5中四种病原中的任意两种病原以检测下限浓度的共感染模拟试验结果图：A为RVA(5×101copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；B为PEDV-G1(2×101copies/μL)和RVA(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；C为PEDV-G1(2×101copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；D为PEDV-G1(2×101copies/μL)和PEDV-G2(2×102copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；E为PEDV-G2(2×102copies/μL)和RVA(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；F为PEDV-G2(2×102copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；
图3为实施例5中四种病原中的任意三种病原(A-D)和四种病原(E)以检测下限浓度共感染模拟试验结果图：A为PEDV-G1(2×101copies/μL)、RVA(5×101copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；B为PEDV-G1(2×101copies/μL)、PEDV-G2(1×102copies/μL)和RVA(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；C为PEDV-G1(2×101copies/μL)、PEDV-G2(1×102copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；D为PEDV-G2(1×102copies/μL)、RVA(5×101copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；E为PEDV-G1(2×101copies/μL)、PEDV-G2(1×102copies/μL)、RVA(5×101copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；
图4为实施例6中四重TaqMan qPCR检测方法对PRRSV、CSFV、TGEV、PDCoV、SIV以及PEDV-G1、PEDV-G2、RVA、RVC的阳性临床样品的检测荧光扩增曲线。
具体实施方式
以下结合附图与具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒，包括热启动Taq DNA聚合酶、无酶水、PCR反应液、探针法荧光定量PCR配套Buffer，以及用于检测G1基因型猪流行性腹泻病毒、G2基因型猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒的四对特异性引物和相应的TaqMan探针及对照品；其中，所述PCR反应液含有Mg2+离子、PCR缓冲液、dNTPs混合物。
所述对照品包括阳性对照品和阴性对照品：所述阳性对照品为分别将G1基因型猪流行性腹泻病毒和G2基因型猪流行性腹泻病毒的S基因片段、猪A群轮状病毒和猪C群轮状病毒的VP6基因片段四种目的基因扩增，连入pMD18-T载体，构建重组质粒作为标准品模板；所述阴性对照品为无核酶水。
所述四对特异性引物和相应的TaqMan探针具体如下：
(1)用于检测G1基因型猪流行性腹泻病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
PEDV-G1(F)如SEQ ID NO.1所示，具体为：
5’-TGTTTTGGGTGGTTATCTACCTA-3’。
PEDV-G1(R)如SEQ ID NO.2所示，具体为：
5’-AGCTGGTAACCACTAGGAT-3’。
PEDV-G1-Probe如SEQ ID NO.3所示，具体为：
5’-FAM-TGTGCCACAGTACCAGCTAGAAGA-MGB-3’。
(2)用于检测G2基因型猪流行性腹泻病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
PEDV-G2(F)如SEQ ID NO.4所示，具体为：
5’-CCAGTACTTTCAACACTTAGCCTA-3’。
PEDV-G2(R)如SEQ ID NO.5所示，具体为：
5’-GCCACTAGCAGTTGGATG-3’。
PEDV-G2-Probe如SEQ ID NO.6所示，具体为：
5’-Texas Red-CAAGTTGAATTGACACCCTGGTTT-BHQ2-3’。
(3)用于检测猪A群轮状病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
RVA(F)如SEQ ID NO.7所示，具体为：
5’-CAACGAAACGGAATAGCACC-3’。
RVA(R)如SEQ ID NO.8所示，具体为：
5’-CCGCCTATTCTGTAGATTCCAA-3’。
RVA-Probe如SEQ ID NO.9所示，具体为：
5’-CY5-ACCCGACAGCTTTCTTAGTGCTT-BHQ3-3’。
(4)用于检测猪C群轮状病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
RVC(F)如SEQ ID NO.10所示，具体为：
5’-GTGAAGAGAATGGTGHTGTAG-3’。
RVC(R)如SEQ ID NO.11所示，具体为：
5’-CATGCGCATTTGCCCCTACGC-3’。
RVC-Probe如SEQ ID NO.12所示，具体为：
5’-VIC-CATGATTCACGAATGGGTTTAG-BHQ1-3’。
本试剂盒应保存于-20℃，并尽量减少反复冻融次数。
将本实施例的试剂盒用于以下实施例的四重TaqMan qPCR检测方法。
实施例2四重TaqMan qPCR检测方法标准曲线的建立
1、所有的临床样品均保存于-80℃低温冰箱中。将临床样品经冻融处理之后置于1.5mL离心管中，加入PBS缓冲液并充分地研磨，然后以12000rpm离心10～15min，收集样品上清液。按照核酸抽提试剂盒Viral DNA/RNA Kit说明书从上清液中提取病毒核酸。
2、以提取的病毒核酸作为反转录模板，使用反转录酶RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit将病毒核酸反转录为cDNA，其反应总体系为20μL，包括：1μL RandomHexamer Primer，1μL Oligo(dT)18Primer，5μL nuclease-free Water，5μL总RNA，混匀后65℃孵育5min，冰浴3min，继续加入：4μL 5×Reaction Buffer、2μL 10×dNTP预混液、1μLRevertAid M-MuLV Reverse transcriptase(RT)和1μL RiboLock RNase Inhibitor(RI)。反转录的反应程序为：25℃5min，42℃60min，70℃5min，反应后得到cDNA模板。
3、取上述cDNA为模板，使用设计的引物进行高保真PCR扩增，从而获得用于构建重组质粒的插入DNA片段。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，59℃退火10s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸5min。反应体系参照说明书，设置为：2×Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase(1U/μL)10μL，dNTP Mix(10mM)1μL，25mM MgSO4 1μL，浓度为10μM的上下游引物各1μL，检测模板cDNA 2μL，无酶水将体系补至20μL。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后通过胶回收进行DNA纯化，获得纯化的目的片段DNA。将纯化后的DNA片段连接pMD18-T载体。
4、获得重组质粒后对其浓度进行测量，并计算质粒拷贝数。最后通过倍比稀释将重组质粒的拷贝数浓度设置为从1×107copies/μL-1×101copies/μL。制备稀释倍数为10倍、浓度为1×107copies/μL-1×101copies/μL的PEDV-G1、PEDV-G2、RVC和RVA的质粒标准品。
5、将上述质粒标准品置入qPCR反应体系，使用实施例1所述试剂盒中的引物对与相应的TaqMan探针，进行PCR扩增，收集荧光信号。
6、qPCR反应体系为：10μL Probe Master Mix(含有Mg2+离子、dNTPs混合物、热启动Taq DNA聚合酶等)，PEDV-G1(F)、PEDV-G1(R)、PEDV-G2(F)、PEDV-G2(R)、RVA(F)、RVA(R)、RVC(F)和RVC(R)各0.3μL，PEDV-G1-Probe、PEDV-G2-Probe、RVA-Probe和RVC-Probe各0.2μL，cDNA模板2μL，无核酸酶水加至体系总体积为20μL。
7、qPCR反应程序：荧光通道设置为：针对PEDV-G1的荧光通道为FAM，针对PEDV-G2的荧光通道为Texas Red，针对RVA的荧光通道为CY5，针对RVC的荧光通道为VIC；温控程序设置为：95℃预变性10min；95℃变性10s，59℃退火10s，72℃延伸20s，45个循环；以荧光定量PCR仪器收集荧光信号。
8、得到PEDV-G1、PEDV-G2、RVA和RVC的质粒标准品由1×107copies/μL-1×101copies/μL 7个浓度梯度的荧光扩增曲线和PEDV-G1、PEDV-G2、RVA、RVC的标准品稀释的标准曲线。
如图1所示，图1A-D分别为PEDV-G1、PEDV-G2、RVA和RVC的质粒标准品由1×107copies/μL-1×101copies/μL 7个浓度梯度的荧光扩增曲线，图1E-H分别为PEDV-G1、PEDV-G2、RVA和RVC的标准品稀释的标准曲线。由图1可知，用于测试本发明检测方法的质粒标准品已经成功建立，从而说明本发明检测方法数据的可靠性。
实施例3四重TaqMan qPCR检测方法最适合反应体系探索
1、使用浓度为1×104copies/μL的PEDV-G1、PEDV-G2、RVA和RVC质粒标准品，置入qPCR反应体系，每个体系使用不同浓度的引物，进行PCR扩增，收集荧光信号。
2、最佳引物浓度qPCR反应体系为：10μL Probe Master Mix(含有Mg2+离子、dNTPs混合物、热启动Taq DNA聚合酶等)，PEDV-G1-Probe、PEDV-G2-Probe、RVA-Probe和RVC-Probe各0.1μL，cDNA模板2μL，无核酶水加至体系总体积为20μL，PEDV-G1(F)、PEDV-G1(R)、PEDV-G2(F)、PEDV-G2(R)、RVA(F)、RVA(R)、RVC(F)和RVC(R)分别加入0.1μL、0.2μL、0.3μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL、0.7μL、0.8μL。
3、最佳探针浓度qPCR反应体系为：10μL Probe Master Mix(含有Mg2+离子、dNTPs混合物、热启动Taq DNA聚合酶等)，PEDV-G1(F)、PEDV-G1(R)、PEDV-G2(F)、PEDV-G2(R)、RVA(F)、RVA(R)、RVC(F)和RVC(R)各0.1μL，cDNA模板2μL，无核酶水加至体系总体积为20μL，PEDV-G1-Probe、PEDV-G2-Probe、RVA-Probe和RVC-Probe分别加入0.1μL、0.2μL、0.3μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL、0.7μL、0.8μL。
4、qPCR反应程序：荧光通道设置为：针对PEDV-G1的荧光通道为FAM，针对PEDV-G2的荧光通道为Texas Red，针对RVA的荧光通道为CY5，针对RVC的荧光通道为VIC；温控程序设置为：95℃预变性10min；95℃变性10s，59℃退火10s，72℃延伸20s，45个循环；以荧光定量PCR仪器收集荧光信号，试验结果如下表1所示。
表1四重TaqMan qPCR检测方法最佳反应体系试验结果
由表1所示，采用不同组合的引物浓度进行试验，当探针加入量各0.2μL，引物加入量各0.3μL时，该多重qPCR反应的荧光强度最高，且Cq值也相对最低。
实施例4四重TaqMan qPCR检测方法灵敏性试验
1、制备稀释倍数为10倍、浓度为1×107copies/μL-1×101copies/μL的PEDV-G1、PEDV-G2、RVA和RVC的质粒标准品。
2、将上述质粒标准品置入实施例3所述qPCR最佳反应体系，使用实施例1所述试剂盒中的引物对与相应的TaqMan探针，进行PCR扩增，收集荧光信号。
3、qPCR反应体系为：10μL Probe Master Mix(含有Mg2+离子、dNTPs混合物、热启动Taq DNA聚合酶等)，PEDV-G1(F)、PEDV-G1(R)、PEDV-G2(F)、PEDV-G2(R)、RVA(F)、RVA(R)、RVC(F)和RVC(R)各0.3μL，PEDV-G1-Probe、PEDV-G2-Probe、RVA-Probe和RVC-Probe各0.2μL，cDNA模板2μL，无核酶水加至体系总体积为20μL。
4、qPCR反应程序：针对PEDV-G1的荧光通道为FAM，针对PEDV-G2的荧光通道为Texas Red，针对RVA的荧光通道为CY5，针对RVC的荧光通道为VIC；温控程序设置为：95℃预变性10min；95℃变性10s，59℃退火10s，72℃延伸20s，45个循环；以荧光定量PCR仪器收集荧光信号。
5、得到PEDV-G1、PEDV-G2、RVA和RVC的质粒标准品由1×107copies/μL-1×101copies/μL七个浓度梯度的荧光扩增曲线。根据检测结果可得，该检测方法在检测Cq值小于35的样品时具有稳定性，而对于Cq值大于35的样品检测稳定性较差，所以判断Cq值小于35的样品为阳性样品，对于Cq值大于35的样品为阴性样品。对于在检测1×101copies/μL浓度质粒时Cq值大于35的病原，接着使用2×101copies/μL-9×101copies/μL八个浓度梯度标准质粒进行检测获得荧光扩增曲线，得到Cq值接近35的最低质粒浓度。
6、使用步骤5中的最低浓度质粒标准品作为模板，进行23次重复检测，确定针对该浓度的检测Cq值稳定小于35，以此确定该检测方法针对四种病原的检测灵敏性，试验结果如下表2和表3所示。
表2四重TaqMan qPCR检测方法最低浓度质粒重复试验结果
表3四重TaqMan qPCR检测方法灵敏性重复试验结果
表2为使用四重TaqMan qPCR检测方法对四种病原预估最低浓度质粒标准品进行23次重复检测的Cq值结果。表3为使用四重TaqMan qPCR检测方法对四种病原预估最低浓度及其低稀释倍数浓度的质粒标准品，进行23次重复检测的统计结果，并将其阳性检出率参照95％阳性检出率进行对比。
由表2和表3可知，本发明的四重TaqMan qPCR检测方法针对猪流行性腹泻病毒的G1和G2基因亚型的阳性样品检测灵敏性分别为2×101copies/μL和1×102copies/μL，可以检测A群猪轮状病毒和C群轮状病毒的阳性样品检测灵敏性均为5×101copies/μL。
实施例5四重TaqMan qPCR检测方法共感染样品检测模拟试验
1、制备相同的检测下限浓度的PEDV-G1、PEDV-G2、RVA和RVC质粒标准品，将两种、三种以及四种不同病原质粒标准品同时置于qPCR体系中，使用实施例1所述试剂盒中的引物对与相应的TaqMan探针，进行PCR扩增，收集荧光信号。
2、qPCR反应体系为：10μL Probe Master Mix(含有Mg2+离子、dNTPs混合物、热启动Taq DNA聚合酶等)，PEDV-G1(F)、PEDV-G1(R)、PEDV-G2(F)、PEDV-G2(R)、RVA(F)、RVA(R)、RVC(F)和RVC(R)各0.3μL，PEDV-G1-Probe、PEDV-G2-Probe、RVA-Probe和RVC-Probe各0.2μL，cDNA模板2μL，无核酶水加至体系总体积为20μL；
3、qPCR反应程序：荧光通道设置为：针对PEDV-G1的荧光通道为FAM，针对PEDV-G2的荧光通道为Texas Red，针对RVA的荧光通道为CY5，针对RVC的荧光通道为VIC；温控程序设置为：95℃预变性10min；95℃变性10s，59℃退火10s，72℃延伸20s，45个循环；以荧光定量PCR仪器收集荧光信号。
图2为四种病原中的任意两种病原以检测下限浓度共感染模拟试验结果图：图2A为RVA(5×101copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；图2B为PEDV-G1(2×101copies/μL)和RVA(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；图2C为PEDV-G1(2×101copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；图2D为PEDV-G1(2×101copies/μL)和PEDV-G2(1×102copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；图2E为PEDV-G2(1×102copies/μL)和RVA(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；图2F为PEDV-G2(1×102copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线。
图3为四种病原中的任意三种病原和四种病原以检测下限浓度共感染模拟试验结果图：图3A为PEDV-G1(2×101copies/μL)、RVA(5×101copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；图3B为PEDV-G1(2×101copies/μL)、PEDV-G2(1×102copies/μL)和RVA(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；图3C为PEDV-G1(2×101copies/μL)、PEDV-G2(1×102copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；图3D为PEDV-G2(1×102copies/μL)、RVA(5×101copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线；图3E为PEDV-G1(2×101copies/μL)、PEDV-G2(1×102copies/μL)、RVA(5×101copies/μL)和RVC(5×101copies/μL)质粒模拟共感染样品检测荧光扩增曲线。
由图2和图3可知，用本发明的四重TaqMan qPCR检测方法检测最低浓度下质粒标准品的多重感染，检测结果均正常，说明本发明的检测方法适用于共感染样品的检测。
实施例6四重TaqMan qPCR检测方法特异性试验
1、将PRRSV(猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒)、CSFV(经典猪瘟病毒)、TGEV(猪传染性胃肠炎病毒)、PDCoV(猪δ冠状病毒)、SIV(猪流感病毒)阳性的临床样品以及PEDV-G1、PEDV-G2、RVA、RVC阳性临床样品分别置于四重qPCR体系中，使用实施例1所述试剂盒中的引物对与相应的TaqMan探针，进行PCR扩增，收集荧光信号。
2、qPCR反应体系为：10μL Probe Master Mix(含有Mg2+离子、dNTPs混合物、热启动Taq DNA聚合酶等)，PEDV-G1(F)、PEDV-G1(R)、PEDV-G2(F)、PEDV-G2(R)、RVA(F)、RVA(R)、RVC(F)和RVC(R)各0.3μL，PEDV-G1-Probe、PEDV-G2-Probe、RVA-Probe和RVC-Probe各0.2μL，cDNA模板2μL，无核酶水加至体系总体积为20μL。
3、qPCR反应程序：荧光通道设置为：针对PEDV-G1的荧光通道为FAM，针对PEDV-G2的荧光通道为Texas Red，针对RVA的荧光通道为CY5，针对RVC的荧光通道为VIC；温控程序设置为：95℃预变性10min；95℃变性10s，59℃退火10s，72℃延伸20s，45个循环；以荧光定量PCR仪器收集荧光信号。
图4为使用四重TaqMan qPCR检测方法对PRRSV、CSFV、TGEV、PDCoV、SIV以及PEDV-G1、PEDV-G2、RVA、RVC的阳性临床样品的检测荧光扩增曲线。
由图4可知，用本发明的四重TaqMan qPCR检测方法同时检测多种其它消化道疾病病原，结果只有四种目标病原被正常检出，其他消化道疾病病原均不能被检出，说明实施例1所述试剂盒中的引物对与相应的TaqMan探针与猪的其他重要病原体不会产生交叉反应，本发明的检测方法具有良好的特异性。
实施例7四重TaqMan qPCR检测方法稳定性试验
1、制备稀释倍数为10倍，浓度为1×107copies/μL至检测下限浓度的PEDV-G1、PEDV-G2、RVA和RVC的质粒标准品。
2、将相同浓度的质粒标准品置入四重qPCR反应体系，使用实施例1所述试剂盒中的引物对与相应的TaqMan探针，进行PCR扩增，收集荧光信号，每次设置3个相同的体系作为重复，共进行三次重复实验。
3、qPCR反应体系为：10μL Probe Master Mix(含有Mg2+离子、dNTPs混合物、热启动Taq DNA聚合酶等)，PEDV-G1(F)、PEDV-G1(R)、PEDV-G2(F)、PEDV-G2(R)、RVA(F)、RVA(R)、RVC(F)和RVC(R)各0.1μL，PEDV-G1-Probe、PEDV-G2-Probe、RVA-Probe和RVC-Probe各0.1μL，cDNA模板2μL，无核酶水加至体系总体积为20μL。
4、qPCR反应程序：荧光通道设置为：针对PEDV-G1的荧光通道为FAM，针对PEDV-G2的荧光通道为Texas Red，针对RVA的荧光通道为CY5，针对RVC的荧光通道为VIC；温控程序设置为：95℃预变性10min；95℃变性10s，59℃退火10s，72℃延伸20s，45个循环；以荧光定量PCR仪器收集荧光信号。
5、计算三次重复实验中1×107copies/μL至检测下限浓度浓度梯度的PEDV-G1、PEDV-G2、RVA和RVC质粒标准品扩增Cq值的变异系数，判断该检测方法的稳定性，试验结果如下表4所示。
表4四重TaqMan qPCR检测方法重复性试验结果
由表4可知，各个浓度梯度的变异系数(CV值)均小于3％，说明本发明的检测方法具有高稳定性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgttttgggt ggttatctac cta 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agctggtaac cactaggat 19
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtgccacag taccagctag aaga 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccagtacttt caacacttag ccta 24
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccactagca gttggatg 18
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagttgaat tgacaccctg gttt 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caacgaaacg gaatagcacc 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgcctattc tgtagattcc aa 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acccgacagc tttcttagtg ctt 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtgaagagaa tggtghtgta g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catgcgcatt tgcccctacg c 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
catgattcac gaatgggttt ag 22
Claims (4)
1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括热启动Taq DNA聚合酶、无酶水、PCR反应液、探针法荧光定量PCR配套Buffer，以及用于检测G1基因型猪流行性腹泻病毒、G2基因型猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒的四对特异性引物和相应的TaqMan探针及对照品；其中，所述PCR反应液含有Mg2+离子、PCR缓冲液、dNTPs混合物；
用于检测G1基因型猪流行性腹泻病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
PEDV-G1上游引物如SEQ ID NO.1所示；
PEDV-G1下游引物如SEQ ID NO.2所示；
PEDV-G1-Probe如SEQ ID NO.3所示；
用于检测G2基因型猪流行性腹泻病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
PEDV-G2上游引物如SEQ ID NO.4所示；
PEDV-G2下游引物如SEQ ID NO.5所示；
PEDV-G2-Probe如SEQ ID NO.6所示；
用于检测猪A群轮状病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
RVA上游引物如SEQ ID NO.7所示；
RVA下游引物如SEQ ID NO.8所示；
RVA-Probe如SEQ ID NO.9所示；
用于检测猪C群轮状病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
RVC上游引物如SEQ ID NO.10所示；
RVC下游引物如SEQ ID NO.11所示；
RVC-Probe如SEQ ID NO.12所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述对照品包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为带有G1基因型猪流行性腹泻病毒和G2基因型猪流行性腹泻病毒的S基因片段、猪A群轮状病毒和猪C群轮状病毒的VP6基因片段的标准品模板，所述阴性对照品为无核酶水。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述标准品模板为分别将G1基因型猪流行性腹泻病毒和G2基因型猪流行性腹泻病毒的S基因片段、猪A群轮状病毒和猪C群轮状病毒的VP6基因片段四种目的基因扩增后连入pMD18-T载体得到的重组质粒。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒保存于-20℃，并避免反复冻融。
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