CN115852052A - 一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法，属于病原体检测技术领域。本发明提供了一种高效检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法，包括上游引物序列、下游引物序列和探针序列，还提供了CymRSV的实时荧光定量PCR检测方法。本发明基于CP基因区域设计了一套特异性实时荧光定量PCR引物对和探针，建立了CymRSV的实时荧光定量PCR检测方法，特异性好，灵敏度高达10 copies，重复性实验结果显示本方法具有良好的稳定性，实现了CymRSV的微量检测，可为CymRSV的早检测早防控提供高效可行的检测方法，对工厂化生产健康无毒、观赏价值高的蝴蝶兰等兰属优质种苗具有重要意义。

Description

一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法

技术领域

本发明属于病原体检测技术领域，具体的说，涉及一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法。

背景技术

CymRSV（Cymbidium ringspot virus）通常称为大花蕙兰环斑病毒（美国ATCC），也称为兰花环斑病毒、建兰环斑病毒等，设施条件下可广泛侵染蝴蝶兰、大花蕙兰、建兰、文心兰等兰属植物，属番茄丛矮病毒科番茄丛矮病毒属（Tombusvirus）病毒，病毒粒子为等轴对称二十面体(T=3)，直径32~35nm，无包膜，粒子呈圆形，表面粗糙，有180个蛋白结构亚基。植物侵染该病毒后，形成坏死斑、植株矮小、畸形等症状，导致产量和质量下降。近年来随着兰科植物产品的国内外贸易和种质交流频率的增加，病毒病的发生有蔓延趋势，加速了一些种传病害如病毒病等的发生和蔓延。另外，由于蝴蝶兰等兰科植物的种苗95 %以上采用组培繁殖，长期无性繁殖导致病毒积累严重，兰属植株作为一种高价值的观赏花卉，一旦感染病毒，其观赏价值和经济价值将受到严重影响。CymRSV目前主要在欧洲、北美洲、南美洲等地发生较严重，近年来随着我国兰属种苗进口渠道呈现多元化，开展CymRSV的高效、定量化检测对保证进出口兰属植物产品的质量有非常重要的作用。

目前，病毒的检测方法包括指示植物法、酶联免疫吸附法、电子显微镜技术、逆转录环介导的等温扩增、RT-PCR和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)等，其中，指示植物法可直接检查植株叶子和茎有无可见的病毒症状，虽然简单，但耗时长，最短需10～20d，长时需1～3月，灵敏度较低，受季节限制，人力物力成本高；电镜法费时，设备昂贵，且可靠结果需依据长期经验积累；ELISA法周期性长，灵敏度为纳克水平，对于更低浓度的病毒含量无法检出；RT-PCR分子生物学方法理论上具特异性强，灵敏度达fg极，但在PCR过程中可能存在样品非特异性扩增而出现假阳性，且仅为定性检测；基因芯片技术操作复杂、费时，对操作人员的专业要求较高，且基因芯片制作较昂贵，极大限制了该技术的推广。实时荧光定量RT-qPCR方法（quantitative Real-time RT-PCR）是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，与常规 PCR技术比较，该方法无需电泳等步骤，实现了样品中所含的模板量的定量检测，具特异性高，重复性好，耗时短、操作简便的特点。并可进行多重精准定量，检测灵敏度高达10～100 copies/μl，是目前检测灵敏度最高的方法。该技术因其快速、高效、特异性好、灵敏度高等优点，已广泛应用于病原菌、寄生虫、病毒、疾病和转基因产品检测、基因表达量分析等领域，具有广阔的发展应用空间。

CymRSV是RNA单链病毒，容易发生变异，而且不同变异株之间会有许多突变位点，因此，利用RT-qPCR技术检测CymRSV的难点在于保守序列的选择和引物、探针组合的设计以及检测体系的优化，试验时还需要严格的防污染措施来避免假阳性结果。目前国内有关CymRSV的研究较少，国外主要用其进行RNA沉默相关研究，对于其检测方面的研究鲜有报道。因此，建立CymRSV实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针，研发快速高效、稳定可靠的CymRSV检测技术具有重要的现实意义，为培养健康无毒、观赏价值高的兰属种苗，实现带毒苗/盆花的早发现、早隔离及早预防，从而提升产品质量及企业经济效益奠定一定的基础。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法，能够实现高灵敏度、高特异性的CymRSV检测，为对CymRSV的早检测早防控提供条件，对培养健康无毒、观赏价值高的蝴蝶兰等兰属种苗具有重要意义。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明基于CymRSV的外壳蛋白基因(CP)的保守序列设计特异性检测引物和探针，所述引物包括上游引物CymRSV-F和下游引物CymRSV-R。

所述上游引物CymRSV-F和下游引物CymRSV-R的核苷酸序列分别如序列表SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示：

上游引物CymRSV-F：5’-CGCAGTGGGTGACTTATT-3’；

下游引物CymRSV-R：5’-CGTCGTGGCTGTGGTAG-3’。

所述探针根据所述的引物设计得到，探针5’端用Cy5荧光基团修饰，3’端用BHQ3淬灭基团修饰；

所述探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示：

探针CymRSV-P(Cy5)：5’-CACAGTAACCTTCTACGAACCGCAACCG-3’。

本发明还提供了一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合，所述检测组合包括上述用于检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针；

所述实时荧光定量PCR引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1（上游引物）：5’-CGCAGTGGGTGACTTATT-3’；

SEQ ID NO.2（下游引物）：5’-CGTCGTGGCTGTGGTAG-3’；

所述探针的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：5’-CACAGTAACCTTCTACGAACCGCAACCG-3’。

本发明还提供了一种检测CymRSV的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品中的RNA；

（2）以提取的总RNA为模板，进行反转录反应，获得cDNA；

（3）将步骤（2）中获得的cDNA作为待测模板，并使用所述的引物探针组合对所述待测模板进行实时荧光定量PCR扩增反应，得到扩增曲线，扩增曲线线性方程为y＝-3.332x+40.371（E=99.6%，R²=0.999）；

（4）根据步骤（3）得到的扩增曲线判断样品是否为阳性，具体判断方法如下：

当待检样品Ct值≤35，判为阳性；

当待检样品无扩增曲线时，判为阴性；

当待检样品35＜Ct值≤40，判为可疑，需重新检测，若重新检测Ct还是在此范围之内或小于35判断样品为阳性，否则判断样品为阴性。

步骤（3）所述PCR扩增反应的体系组分以总体积25μl计，包括：Premix Ex Taq (2×)混合液12.5 μl、RNase free ddH2O 8.5 μl、上游引物20 μM 0.5 μl、下游引物20 μM0.5 μl、探针10 μM 1 μl、模板cDNA 2 μl。

所述实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环，在每一循环退火结束时收集Cy5荧光信号。

作为优选，所述实时荧光定量PCR反应时，最适退火温度为60℃。

本发明还提供了一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法，所述引物探针组合及检测方法应用于：

（1）定量检测或辅助检测可能感染CymRSV的样品；

（2）制备定量检测或辅助检测可能感染CymRSV的产品。

本发明的有益效果：

1、本发明基于CP基因区域设计了一套特异性实时荧光定量PCR引物对和探针，建立了CymRSV的实时荧光定量PCR检测方法，能够更快速、准确且灵敏地检测出CymRSV，特异性好，灵敏度高达10 copies，重复性实验结果显示本方法具有良好的稳定性，操作简便和耗时短，实现了CymRSV的微量检测，可为CymRSV的早检测早防控提供高效可行的检测方法，对工厂化生产健康无毒、观赏价值高的蝴蝶兰等兰属优质种苗具有重要意义。

2、本发明检测快速、高效，该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。

3、本发明定量准确，通过提取RNA并反转录，根据检测待检样品cDNA进行实时荧光定量PCR结果中的Ct值，直接对CymRSV感染给出判定，并可对其感染程度进行准确定量。

4、本发明特异性强，与建兰花叶病毒(CymMV)、齿兰环斑病毒(ORSV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)、香石竹斑驳病毒(CarMV)、百合斑驳病毒(LMoV)均无反应信号，仅对建兰环斑病毒(CymRSV)感染检测出现荧光信号。

5、本发明重复性好，建立的实时荧光定量PCR检测方法进行CymRSV检测的组内和组间变异系数均小于0.6％。

6、本发明检测灵敏度高，可达10 copies。

附图说明

图1是本发明退火温度58℃、不同浓度引物和探针下的实时荧光定量PCR优化结果图；

图2是本发明退火温度60℃、不同浓度引物和探针下的实时荧光定量PCR优化结果图；

图3是本发明退火温度62℃、不同浓度引物和探针下的实时荧光定量PCR优化结果图；

图4是本发明实时荧光定量PCR特异性扩增曲线；CymRSV的扩增曲线为A，其他五种病毒的扩增曲线为B~G，空白对照的检测结果为H；

图5是本发明标准品实时荧光定量PCR的标准曲线；

图6是本发明标准品实时荧光定量PCR的标准曲线扩增曲线；

图7是本发明标准品实时荧光定量PCR灵敏性扩增曲线；A：5×10⁹ copies·μL^-1；B：5×10⁸ copies·μL^-1；C：5×10⁷ copies·μL^-1；D：5×10⁶ copies·μL^-1；E：5×10⁵copies·μL^-1；F：5×10⁴ copies·μL^-1；G：5×10³ copies·μL^-1；H：5×10² copies·μL^-1；I：5×10¹ copies·μL^-1；J：5 copies·μL^-1；

图8是本发明CymRSV 8个标准品、阳性样品和阴性样品的实时荧光定量PCR扩增曲线；A：5×10⁸ copies·μL^-1；B：5×10⁷ copies·μL^-1；C：5×10⁶ copies·μL^-1；D：5×10⁵copies·μL^-1；E：5×10⁴ copies·μL^-1；F：5×10³ copies·μL^-1；G：5×10² copies·μL^-1；H：5×10¹ copies·μL^-1；I：阳性样品；J：阴性样品；K：空白。

具体实施方式

本发明基于CymRSV的外壳蛋白基因(CP)的保守序列设计特异性检测引物和探针，通过优化反应条件，建立了CymRSV实时荧光定量PCR检测技术体系。本发明提供了一种高效检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合，其包括引物和探针，核苷酸序列如下：

上游引物CymRSV-F序列：5’-CGCAGTGGGTGACTTATT-3’；

下游引物CymRSV-R序列：5’-CGTCGTGGCTGTGGTAG-3’；

探针CymRSV-P(Cy5)序列：5’-CACAGTAACCTTCTACGAACCGCAACCG-3’。

其中，CymRSV探针的5’端连接荧光报告基团Cy5，3’端连接荧光淬灭基团BHQ3。

本发明还提供了一种快速检测CymRSV的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）取待测样品的叶片、花梗等组织，提取总RNA；

（2）以提取的总RNA为模板，进行反转录反应，获得cDNA；

（3）将步骤（2）中获得的cDNA作为待测模板，并使用实时荧光定量PCR检测引物探针组合对待测模板进行实时荧光定量PCR扩增反应，得到扩增曲线；

（4）根据步骤（3）的检测结果判断待测样品的带病情况并计算待测植株内病毒浓度。

PCR扩增反应的体系组分以总体积25μl计，包括：Premix Ex Taq (2×)混合液12.5 μl、RNase free ddH₂O 8.5 μl、上游引物20 μM 0.5 μl、下游引物20 μM 0.5 μl、探针10 μM 1 μl、模板cDNA 2 μl；扩增程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40个循环。

作为优选，上述荧光定量PCR扩增时，最适退火温度为60 ℃。

作为优选，步骤（4）中待测待测样品携带病毒情况的判断方法如下：

当待检样品Ct值≤35，则为阳性，即判断待测植株带毒；

当待检样品无扩增曲线时，判为阴性；

当待检样品35＜Ct值≤40，判为可疑，需重新检测，若重新检测Ct还是在此范围之内或小于35就判断样品为阳性，否则判断样品为阴性。

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

主要试剂与仪器

1、试剂：RNA提取试剂盒：Mini BEST Plant RNA Extraction Kit(目录号：9769)、反转录试剂盒：PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(目录号：RR047A)、PCR试剂盒：Ex Taq(目录号：RR001A)、胶回收试剂盒：Mini BEST Agarose Gel DNA ExtractionKit Ver.4.0(目录号：9760)、克隆载体：pMD19-T Vector Cloning Kit(目录号：6013)、大肠杆菌感受态细胞：E.coliDH5α Competent Cells(目录号：9057)和质粒提取试剂盒：MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0(目录号：9760)、实时荧光定量PCR试剂盒(目录号：RR390A)均购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

2、仪器：设备：超微量紫外分光光度计(Thermo ND2000)、PCR仪(Bio-Rad)、CFX96Real-Time荧光定量PCR仪(Bio-Rad)。

实施例1引物和探针的设计

（1）蝴蝶兰总RNA的提取及反转录：取蝴蝶兰植株的叶片50-100 mg，采用植物RNA提取试剂盒对蝴蝶兰叶片样品进行总RNA提取，之后采用反转录试剂盒获得cDNA。

（2）引物和探针的设计合成：通过DNAMAN对比从NCBI上下载的CymRSV的外壳蛋白序列，在病毒序列的高度保守区域利用Primer 5.0软件根据RT-qPCR引物设计要求设计CymRSV 3对特异性引物和探针，并在NCBI中进行Primer-BLAST比对，以保证引物特异性。将RT-qPCR的特异性引物通过跑RT-PCR跑电泳和染料法进行验证，选择能产生明亮且单一条带、溶解曲线好且扩增效率高的引物，合成其对应的探针，序列如表1所示，5’端进行Cy5荧光基团修饰，3’端进行BHQ3淬灭基团修饰。引物及探针均送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列合成。

表1 引物探针序列

实施例2病毒质粒标准品制备

（1）以cDNA为模板，用上述所设计引物进行PCR扩增，反应体系总体积25.0 μL：10×Ex Taq Bμffer 2.5 μl，dNTP Mixtμre 2.5 μl，Ex Taq 0.25 μl，Primer F 0.5 μl，Primer R 0.5 μl，cDNA 2.5 μl，RNase Free ddH₂O 16.25 μl，缓慢混匀，按下列条件进行扩增反应：95 °C 5 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10min，4℃保温。利用1％的琼脂糖凝胶进行PCR产物切胶回收。

（2）PCR纯化产物的连接反应参照说明书进行。反应体系10.0 μL：pEASY-T1Simple Cloning Vector 1 μL、胶回收产物4 μL，Solμtion I 5 μl。混合液混匀后室温放置1 h，进行连接反应，将连接后的质粒迅速转化到DH5α感受态细胞，并均匀涂抹于LB平板上，12-16小时后，挑取单菌落。将单菌落置于3 mL LB液体培养基中，37 ℃摇床上(200r·min^-1)培养12-16小时后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。选择测序结果中序列完全正确的阳性克隆样品，使用宝日医质粒提取试剂盒完成CymRSV质粒的提取。将提取的质粒用Hind III进行酶切，将酶切产物取5 μl进行跑胶及胶回收。

（3）质粒浓度换算拷贝数：用分光光度计测定胶回收质粒浓度为17.3 ng/μL，pMD-19T载体的碱基数为2692 bp，每个碱基的平均分子量为660道尔顿/bp，扩增产物大小为145bp，每μL样品中检测基因拷贝数按照公式估算：样品copies/μL＝阿伏伽德罗常数(6.02×10²³)×质粒浓度ng/μL×10^-9/(660×重组质粒碱基数)，其中，重组质粒碱基数＝载体序列碱基数+插入序列碱基数。计算得出拷贝数为，5.56×10⁹ copies/μL，将其稀释为5×10⁹copies/μL。

实施例3实时荧光定量PCR检测体系的建立及优化

（1）体系建立：Premix Ex Taq (2×)混合液12.5 μl、RNase free ddH₂O 8.5 μl、上游引物10 μM 0.5 μl、下游引物10 μM 0.5 μl、探针10 μM 1 μl、模板DNA 2μl；扩增程序为：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 30 s，40个循环，同时收集荧光信号。

（2）体系优化：以cDNA为模板，应用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR扩增体系和程序筛选，采用矩阵法分别对退火温度(58 ℃、60 ℃、62 ℃)、引物浓度(1 μM、10 μM、20 μM、50 μM)及探针浓度(1 μM、10 μM、20 μM、50 μM)进行优化，如图1-3。

（3）优化结果：最适温度为60 ℃，最适引物浓度为20 μM，探针浓度为10 μM。最终建立的实时荧光定量PCR最佳反应体系(25 μL)：Premix Ex Taq (2×)混合液12.5 μl、RNase free ddH₂O 8.5 μl、上游引物20 μM 0.5 μl、下游引物20 μM 0.5 μl、探针10 μM 1μl、模板DNA 2 μl；扩增程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40个循环，同时收集荧光信号。

实施例4特异性检测

用已检测含有建兰花叶病毒(CymMV)、齿兰环斑病毒(ORSV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)、香石竹斑驳病毒(CarMV)、百合斑驳病毒(LMoV)的cDNA样品进行CymRSV的RT-qPCR特异性检测。

结果表明(如图4所示)，仅有CymRSV的cDNA出现扩增曲线，且Ct值小于35个循环，表明CymRSV检测结果为阳性；而其他病毒检测结果则为阴性，其中，CymRSV的扩增曲线为A，其他五种病毒的扩增曲线为B~G，空白对照的检测结果为H。因此，该荧光定量体系具有较强的特异性。

实施例5实时荧光定量PCR标准曲线的建立

用EASY Dilution稀释CymRSV质粒标准品，按10倍梯度将其稀释为1×10⁹ copies~ 1×10² copies 8个梯度。在上述优化后的反应条件下进行RT-qPCR检测，每组试验重复3次，建立了实时荧光定量PCR的标准曲线(如图5-6所示)。方程式为y＝-3.332x+40.371，R²=0.999，E=99.6%。结果显示所建立检测体系的荧光曲线与靶基因浓度之间相关性好，准确性高。

实施例6应用可靠性检验

（1）灵敏度检测

以10¹⁰～10¹ copies为梯度稀释的CymRSV质粒标准品为模板(每个浓度3个平行实验)，进行RT-qPCR扩增(如图7所示)，计算该技术体系检测CymRSV的灵敏度，其中，A：5×10⁹copies·μL^-1；B：5×10⁸ copies·μL^-1；C：5×10⁷ copies·μL^-1；D：5×10⁶ copies·μL^-1；E：5×10⁵ copies·μL^-1；F：5×10⁴ copies·μL^-1；G：5×10³ copies·μL^-1；H：5×10²copies·μL^-1；I：5×10¹ copies·μL^-1；J：5 copies·μL^-1；K：空白对照。计算检测结果得出，该实时荧光定量PCR检测方法的CymRSV的检出下限为5×10¹ copies·μL^-1，结果表明，该方法灵敏度较高。

（2）检测CymRSV的重复性试验

取CymRSV质粒标准品5×10⁷ copies·μL^-1、5×10⁶ copies·μL^-1、5×10⁵copies·μL^-1、5×10³ copies·μL^-1、5×10² copies·μL^-1作为模板，应用所建立的实时荧光定量PCR进行扩增，验证该方法的重复性。组内重复性试验时，重复3次反应；组间重复性试验时，重复3次反应。

结果表明(如表2所示)，Ct值的变异系数在组内与组间重复性试验中均小于0.6％，说明该体系重复性良好。

表2 实时荧光定量PCR检测体系的重复性试验

实施例7蝴蝶兰样本检测

用上述方法对已确认蝴蝶兰CymRSV阳性样本、阴性样本和8个质粒标准品同时进行检测，实时荧光定量PCR扩增曲线见图8，其中，A：5×10⁸ copies·μL^-1；B：5×10⁷copies·μL^-1；C：5×10⁶ copies·μL^-1；D：5×10⁵ copies·μL^-1；E：5×10⁴ copies·μL^-1；F：5×10³ copies·μL^-1；G：5×10² copies·μL^-1；H：5×10¹ copies·μL^-1；I：阳性样品；J：阴性样品；K：空白对照，阳性样品检测结果为Ct值为15.92，阴性样品检测没有扩增曲线。

综上所述，本发明提供了一种快速鉴定蝴蝶兰感染CymRSV的引物探针组合及方法。根据CymRSV的外壳蛋白基因的保守序列设计特异性检测引物和探针，通过对引物浓度、探针浓度和反应退火温度进行优化，建立了最优的反应体系和程序，本发明建立的蝴蝶兰CymRSV的RT-qPCR检测方法，具有高效、快速、灵敏度高等优越性，可对蝴蝶兰样品中的CymRSV进行准确高效检测，以用于CymRSV的长期监测预警和流行趋势研究。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合，其特征在于：所述检测组合包括引物和探针；

所述上游引物CymRSV-F和下游引物CymRSV-R的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：

上游引物CymRSV-F：5’-CGCAGTGGGTGACTTATT-3’；

下游引物CymRSV-R：5’-CGTCGTGGCTGTGGTAG-3’；

所述探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示：

探针CymRSV-P(Cy5)：5’-CACAGTAACCTTCTACGAACCGCAACCG-3’；

所述探针根据所述的引物设计得到，所述探针5’端用Cy5荧光基团修饰，3’端用BHQ3淬灭基团修饰。

2.根据权利要求1所述的一种检测CymRSV的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）提取待测样品中的RNA；

（2）以提取的总RNA为模板，进行反转录反应，获得cDNA；

（3）将步骤（2）中获得的cDNA作为待测模板，并使用权利要求1所述的引物探针组合对所述待测模板进行实时荧光定量PCR扩增反应，得到扩增曲线，扩增曲线线性方程为y＝-3.332x+40.371（E=99.6%，R²=0.999）；

（4）根据步骤（3）得到的扩增曲线判断样品是否为阳性，具体判断方法如下：

当待检样品Ct值≤35，判为阳性；

当待检样品无扩增曲线时，判为阴性；

当待检样品35＜Ct值≤40，判为可疑，需重新检测，若重新检测Ct还是在此范围之内或小于35判断样品为阳性，否则判断样品为阴性。

3.根据权利要求2所述的一种检测CymRSV的方法，其特征在于：所述PCR扩增反应的体系组分以总体积25μ1计，所述上游引物的用量为20μM 0.5μl。

4.根据权利要求2所述的一种检测CymRSV的方法，其特征在于：所述PCR扩增反应的体系组分以总体积25μ1计，所述下游引物的用量为20μM 0.5μl。

5.根据权利要求2所述的一种检测CymRSV的方法，其特征在于：所述PCR扩增反应的体系组分以总体积25μ1计，所述探针的用量为10μM 1μl。

6.根据权利要求2所述的一种检测CymRSV的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环，在每一循环退火结束时收集Cy5荧光信号。

7.根据权利要求1所述的一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合以及权利要求2~6所述的一种检测CymRSV的方法在定量检测或辅助检测可能感染CymRSV的样品和制备定量检测或辅助检测可能感染CymRSV的产品中的应用。

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