CN114606347A

CN114606347A - 一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量pcr方法

Info

Publication number: CN114606347A
Application number: CN202210390754.7A
Authority: CN
Inventors: 白静科; 吴彦辉; 邱睿; 宋鹏宇; 王遂法; 周密; 郝浩浩; 金磊; 董宁禹; 王俊; 陈玉国; 刘翔文; 牛莉莉; 李静静
Original assignee: Tobacco Research Institute Henan Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Tobacco Research Institute Henan Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-04-14
Filing date: 2022-04-14
Publication date: 2022-06-10

Abstract

本发明涉及花叶病毒实时检测领域，具体涉及一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：步骤一：TMV引物及探针的设计与合成；步骤二：总RNA的提取与RT‑PCR；步骤三：目的基因鉴定；步骤四：质粒标准品的制备；步骤五：标准曲线的建立。本发明的方法快速简单，耗时短，灵敏度高，定量检测方便，特异性强，检测结果可靠，使得本发明的方法可作为烟草育苗中TMV有症和隐症筛查的有效手段。

Description

一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法

技术领域

本发明涉及花叶病毒实时检测领域，具体涉及一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法。

背景技术

烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）为RNA病毒，是烟草花叶病等的病原体，属于Tobamovirus群，是烟草生产上分布最广、发生最为普遍的一类病害，对烟草的危害极大，导致叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形，从而直接影响烟叶的产量、质量和种植效益，发生严重时，损失可达30%—50%，甚至可能造成烟田绝收。TMV主要通过机械摩擦传播，幼苗期或大田期均可感染，且苗期带毒是大田烟草普通花叶病毒病的一个主要初侵染源。

因而对烟草漂浮育苗过程中的烟苗进行快速、准确检测是控制TMV流行的重要保证，目前应用于植物病毒病检测的方法主要有血清学检测、生物学检测和分子生物学检测等，如核酸分子杂交技术、反转录聚合酶链式反应技术和实时荧光定量技术等。与实时荧光定量PCR技术相比，其他方法都存在耗时长、灵敏度低和不能对病毒进行定量检测等缺点，然而实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高等特点，同时可以对样本进行实时快速定量检测等优点。因此实时定量作为一个有效的实验方法，被应用于植物病毒的检测，然而现有的检测方法的步骤较繁琐且只能定性分析病毒是否存在，为此需要进一步对检测方法进行研究，从而实现耗时短、灵敏度高、定量检测以及特异性强的检测要求。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，实时荧光定量PCR技术（real-time fluorescent quantitative polymerasechain reaction，RT-qPCR），耗时短，灵敏度高，定量检测，特异性强，从而克服现有技术中缺陷。

本发明采用的技术方案为：一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：步骤一：TMV引物及探针的设计与合成，根据NCBI数据库中TMV的外壳蛋白基因保守序列:AJ239099.1和内参基因HSC70-1：DV161835，根据TMV引物和TaqMan探针设计原则，利用Primer Premier 5.0软件设计荧光定量PCR检测的引物及探针，并通过NCBI中的Primer-BLAST进行比对，保证所设计引物的特异性；其中，上游的引物TMV-F：GTTAGGTTCCCTGACAGTGACTTT，下游引物TMV-R：GTTCGCCTGATTTTCAACTTCT，探针：FAM-TACAGGTACAATGCGGT-MGB，所述的AJ239099.1的序列表为SEQ ID No.1 所示，DV161835的序列表为SEQ ID No.2所示；步骤二：总RNA的提取与RT-PCR，采用Trizol法提取植物总RNA，用Eppendorf D30紫外分光光度计测定所得RNA的浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；进行cDNA第一链的合成反应体系并进行PCR反应体系；步骤三：目的基因鉴定，将步骤二中PCR反应体系产生的常务进行琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，胶回收试剂盒纯化回收后，连接至pMD™18-T Vector，并转化进入感受态细胞Trans 5α，37℃过夜培养后经蓝白斑筛选，分别挑选白色单菌落和蓝色单菌落置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中分开震荡培养，使用天根质粒提取试剂盒完成质粒的提取，提取的质粒用pMD™18-T Vector通用引物BcaBEST Sequencing Primers、M13 Primers进行PCR鉴定，且进行PCR反应体系，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，对符合预期大小目的条带的质粒样品送进测序，余下的质粒样品保存于-20℃内；步骤四：质粒标准品的制备，质粒样品经测序鉴定无误后，用分光光度计测定质粒OD260的值，通过公式：C=A/B×6.02×10¹⁴，计算出质粒浓度拷贝数，将其作为质粒标准品使用；步骤五：标准曲线的建立，将质粒标准品用EASY Dilution进行10倍梯度稀释，分别获得TMV终浓度为4.53×10¹—4.53×10⁹copies/µl的9个质粒样品、内参基因终浓度为5.03×10¹—5.03×10⁹copies/µl的9个质粒样品，以稀释后的质粒样品作为模板，利用ABI 7500 fast实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量（RT-qPCR）反应体系，每个浓度进行三次技术重复，通过仪器生成标准曲线。

所述的步骤二中采用Trizol法提取植物总RNA包括取出0.1-0.15g TMV烟草病毒样本，使用Trizol试剂提取总RNA，以健康烟草叶片为阴性对照。

所述的步骤二中cDNA第一链的合成反应体系包括RNA 2 µl、Random Primer 1 µl、DEPC-ddH2O 7µl，先在65℃保育5-10min，快速置于冰上放置2-3min以上，然后加入以下试剂：5×RT buffer 5µl、RRI 0.5 µl、M-MLV 1 µl、dNTPmix 5 µl、DEPC-ddH2O 3.5 µl，反应程序依次为30℃ 10min、42℃ 60min以及70℃ 15min，制得的cDNA置于-20℃保存用于后续试验。

所述的步骤二中PCR反应体系包括Premix Taq10 µl，10 µmol/L的上下游引物各0.5 µL，cDNA 2 µl，ddH2O 7 µl；反应程序依次为95℃预变性3min、95℃变性30s、57℃退火30s以及72℃延伸30s，并经过35次循环，最后在72℃延伸10min。

所述的步骤三中PCR反应体系包括Premix Taq 10 µl，BcaBEST SequencingPrimers0.5 µl，M13 Primers0.5 µl，质粒模板2 µl，ddH2O 7 µl；PCR反应程序依次为95℃预变性3min、95℃变性30s、55℃退火30s以及72℃延伸60s，并进行35次循环，最后在72℃延伸10min。

所述的步骤五中实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量反应体系为20 µl：ProbeqPCR Mix10 µl，10 µmol/L的上下游引物各0.4 µL，探针 0.8 µl，ROX Reference DyeII0.2 µl，质粒模板2 µl，灭菌水6.2 µl；反应程序依次为预变性95℃30s、PCR反应95℃5s、57℃15s以及72℃30s，并进行45次循环。

本发明有益效果是：本发明的方法快速简单，耗时短，灵敏度高，定量检测方便，特异性强，检测结果可靠，使得本发明的方法可作为烟草育苗中TMV有症和隐症筛查的有效手段。

附图说明

图1为本发明的TMV标准曲线图。

图2为本发明的内参基因标准曲线图。

图3为本发明的扩增曲线图。

图4为本发明的RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果。

具体实施方式

如图1、2、3、4所示，一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：步骤一：TMV引物及探针的设计与合成，根据NCBI数据库中TMV的外壳蛋白（coat protein，CP）基因保守序列:AJ239099.1和内参基因HSC70-1：DV161835，根据TMV引物和TaqMan探针设计原则，利用Primer Premier 5.0软件设计荧光定量PCR检测的引物及探针，并通过NCBI中的Primer-BLAST进行比对，保证所设计引物的特异性；其中，上游的引物TMV-F： GTTAGGTTCCCTGACAGTGACTTT，下游引物TMV-R：GTTCGCCTGATTTTCAACTTCT，探针：FAM-TACAGGTACAATGCGGT-MGB，引物和探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，所述的AJ239099.1的序列表为SEQ ID No.1 所示，DV161835的序列表为SEQ ID No.2所示；步骤二：总RNA的提取与RT-PCR，采用Trizol法提取植物总RNA，用Eppendorf D30紫外分光光度计测定所得RNA的浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；进行cDNA第一链的合成反应体系并进行PCR反应体系；步骤三：目的基因鉴定，将步骤二中PCR反应体系产生的常务进行琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，胶回收试剂盒纯化回收后，连接至pMD™18-TVector，并转化进入感受态细胞Trans 5α，37℃过夜培养后经蓝白斑筛选，分别挑选白色单菌落和蓝色单菌落置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中分开震荡培养（37℃，220r/min，15h），使用天根质粒提取试剂盒完成质粒的提取，提取的质粒用pMD™18-T Vector通用引物BcaBEST Sequencing Primers、M13 Primers进行PCR鉴定，且进行PCR反应体系，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，对符合预期大小目的条带的质粒样品送进测序，余下的质粒样品保存于-20℃内；步骤四：质粒标准品的制备，质粒样品经测序鉴定无误后，用分光光度计测定质粒OD260的值，通过公式：C=A/B×6.02×1014 (其中A代表质粒浓度ng/µl，B代表质粒DNA分子量，C代表copies/µl)，计算出质粒浓度拷贝数，将其作为质粒标准品使用；步骤五：标准曲线的建立，将质粒标准品用EASY Dilution进行10倍梯度稀释，分别获得TMV终浓度为4.53×101—4.53×109copies/µl的9个质粒样品、内参基因终浓度为5.03×101—5.03×109copies/µl的9个质粒样品，以稀释后的质粒样品作为模板，利用ABI 7500 fast实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量（RT-qPCR）反应体系，每个浓度进行三次技术重复，通过仪器生成标准曲线。

所述的步骤二中采用Trizol法提取植物总RNA包括取出0.1-0.15g TMV烟草病毒样本，使用Trizol（Invirtogen）试剂提取总RNA（具体方法参照Trizol试剂说明书），以健康烟草叶片为阴性对照；所述的步骤二中cDNA第一链的合成反应体系包括RNA 2 µl、RandomPrimer 1 µl、DEPC-ddH2O 7µl，先在65℃保育5-10min，快速置于冰上放置2-3min以上，然后加入以下试剂：5×RT buffer 5µl、RRI 0.5 µl、M-MLV 1 µl、dNTPmix 5 µl、DEPC-ddH2O3.5 µl，反应程序依次为30℃ 10min、42℃ 60min以及70℃ 15min，制得的cDNA置于-20℃保存用于后续试验；所述的步骤二中PCR反应体系包括Premix Taq (TaKaRa Taq Version2.0）10 µl，10 µmol/L的上下游引物各0.5 µL，cDNA 2 µl，ddH2O 7 µl；反应程序依次为95℃预变性3min、95℃变性30s、57℃退火30s以及72℃延伸30s，并经过35次循环，最后在72℃延伸10min。

所述的步骤三中PCR反应体系包括Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0）10 µl，BcaBEST Sequencing Primers(10 µM)0.5 µl，M13 Primers(10 µM)0.5 µl，质粒模板2µl，ddH2O 7 µl；PCR反应程序依次为95℃预变性3min、95℃变性30s、55℃退火30s以及72℃延伸60s，并进行35次循环，最后在72℃延伸10min；所述的步骤五中实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量（RT-qPCR）反应体系为20 µl：Probe qPCR Mix（2×）10 µl，10 µmol/L的上下游引物各0.4 µL，探针 0.8 µl，ROX Reference Dye II（50×）0.2 µl，质粒模板2 µl，灭菌水6.2 µl；反应程序依次为预变性95℃30s、PCR反应95℃5s、57℃15s以及72℃30s，并进行45次循环。

实验结果：

根据图1、2所示，实时荧光定量PCR标准曲线的建立，结果表明，随着阳性质粒模板浓度逐渐降低，Ct值出现递增趋势，TMV、内参基因在质粒标准品浓度101-109copies/µl范围内，Ct值同质粒标准品浓度之间线性关系良好。可根据待检测样品的Ct值参照此标准曲线进行样品含毒量的检测。

TMV、内参基因TaqMan实时荧光定量PCR反应，每个质粒梯度浓度均进行三次技术重复，结果如下表所示，三次重复变异系数均小于2%，表明本实验重复性良好，实验结果可靠。

根据图3、4所示，TMV的TaqMan荧光定量PCR检测方法能够最低检测出4.53×101copies/mL的病毒样品，而常规RT-PCR检测方法能够最低检测出4.53×102copies/mL的病毒样品，表明TaqMan荧光定量PCR检测TMV的灵敏度比常规RT-PCR检测提高了10倍。

序列表

<110> 河南省农业科学院烟草研究所

<120> 一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法

<130> 2022.04.10

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgtcttaca gtatcactac tccatctcag ttcgtgttct tgtcatcagc gtgggccgac 60

ccaatagagt taattaattt atgtactaat gccttaggaa atcagtttca aacacaacaa 120

gctcgaactg tcgttcaaag acaattcagt gaggtgtgga aaccttcacc acaagtaact 180

gttaggttcc ctgacagtga ctttaaggtg tacaggtaca atgcggtatt agacccgcta 240

gtcacagcac tgttaggtgc attcgacact agaaatagaa taatagaagt tgaaaatcag 300

gcgaacccca cgactgccga aacgttagat gctactcgta gagtagacga cgcaacggtg 360

gccataagga gcgcgataaa taatttaata gtagaattga tcagaggaac cggatcttat 420

aatcggagct ctttcgagag ctcttctggt ttggtttgga cctctggtcc tgcaacttga 480

ggtagtcaag atgcataata aataacggat tgtgtccgta atcacacgtg gtgcgtacga 540

taacgcatag tgtttttccc tccacttaaa tcgaagggtt gtgtcttgga tcgcgcgggt 600

caaatgtata tggttcatat acatccgcag gcacgtaata aagcgagggg ttcgaatccc 660

cccgttaccc ccggtagggg ccca 684

<210> 2

<211> 274

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gtaccagggc gcaggtggag acatgggtgg tgccatggat gatgagggtc ctgctcctag 60

tggtggtggt gctggtccta agattgagga ggtggactaa gttggtgctc ctctattgtt 120

ttttatttct tgttagagac ttgcaatttt atttcagaga tctgtgtgcc taatgatttt 180

tgcctagtag atggattata ttattttcat tctgcaatca agtaatacct atcttttatt 240

tctcggtttt tattaaaagt tgctcttcct tttg 274

Claims

1.一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：TMV引物及探针的设计与合成，根据NCBI数据库中TMV的外壳蛋白基因保守序列:AJ239099.1和内参基因HSC70-1：DV161835，根据TMV引物和TaqMan探针设计原则，利用Primer Premier 5.0软件设计荧光定量PCR检测的引物及探针，并通过NCBI中的Primer-BLAST进行比对，保证所设计引物的特异性；

其中，上游的引物TMV-F： GTTAGGTTCCCTGACAGTGACTTT，下游引物TMV-R：GTTCGCCTGATTTTCAACTTCT，探针：FAM-TACAGGTACAATGCGGT-MGB，所述的AJ239099.1的序列表为SEQ ID No.1 所示，DV161835的序列表为SEQ ID No.2所示；

步骤二：总RNA的提取与RT-PCR，采用Trizol法提取植物总RNA，用Eppendorf D30紫外分光光度计测定所得RNA的浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；进行cDNA第一链的合成反应体系并进行PCR反应体系；

步骤三：目的基因鉴定，将步骤二中PCR反应体系产生的常务进行琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，胶回收试剂盒纯化回收后，连接至pMD™18-T Vector，并转化进入感受态细胞Trans 5α，37℃过夜培养后经蓝白斑筛选，分别挑选白色单菌落和蓝色单菌落置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中分开震荡培养，使用天根质粒提取试剂盒完成质粒的提取，提取的质粒用pMD™18-T Vector通用引物BcaBEST Sequencing Primers、M13 Primers进行PCR鉴定，且进行PCR反应体系，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，对符合预期大小目的条带的质粒样品送进测序，余下的质粒样品保存于-20℃内；

步骤四：质粒标准品的制备，质粒样品经测序鉴定无误后，用分光光度计测定质粒OD260的值，通过公式：C=A/B×6.02×10¹⁴，计算出质粒浓度拷贝数，将其作为质粒标准品使用；

步骤五：标准曲线的建立，将质粒标准品用EASY Dilution进行10倍梯度稀释，分别获得TMV终浓度为4.53×10¹—4.53×10⁹copies/µl的9个质粒样品、内参基因终浓度为5.03×10¹—5.03×10⁹copies/µl的9个质粒样品，以稀释后的质粒样品作为模板，利用ABI 7500fast实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量（RT-qPCR）反应体系，每个浓度进行三次技术重复，通过仪器生成标准曲线。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的步骤二中采用Trizol法提取植物总RNA包括取出0.1-0.15g TMV烟草病毒样本，使用Trizol试剂提取总RNA，以健康烟草叶片为阴性对照。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的步骤二中cDNA第一链的合成反应体系包括RNA 2 µl、Random Primer 1 µl、DEPC-ddH2O 7µl，先在65℃保育5-10min，快速置于冰上放置2-3min以上，然后加入以下试剂：5×RT buffer 5µl、RRI 0.5 µl、M-MLV 1 µl、dNTPmix 5 µl、DEPC-ddH2O 3.5 µl，反应程序依次为30℃ 10min、42℃ 60min以及70℃ 15min，制得的cDNA置于-20℃保存用于后续试验。

4.根据权利要求1所述的一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的步骤二中PCR反应体系包括Premix Taq10 µl，10 µmol/L的上下游引物各0.5 µL，cDNA 2 µl，ddH2O 7 µl；反应程序依次为95℃预变性3min、95℃变性30s、57℃退火30s以及72℃延伸30s，并经过35次循环，最后在72℃延伸10min。

5.根据权利要求1所述的一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的步骤三中PCR反应体系包括Premix Taq 10 µl，BcaBEST SequencingPrimers0.5 µl，M13 Primers0.5 µl，质粒模板2 µl，ddH2O 7 µl；PCR反应程序依次为95℃预变性3min、95℃变性30s、55℃退火30s以及72℃延伸60s，并进行35次循环，最后在72℃延伸10min。

6.根据权利要求1所述的一种用于检测烟草普通花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的步骤五中实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量反应体系为20 µl：ProbeqPCR Mix10 µl，10 µmol/L的上下游引物各0.4 µL，探针 0.8 µl，ROX Reference DyeII0.2 µl，质粒模板2 µl，灭菌水6.2 µl；反应程序依次为预变性95℃30s、PCR反应95℃5s、57℃15s以及72℃30s，并进行45次循环。