CN112458211A

CN112458211A - 一种蓝舌病病毒血清型鉴定的一步法rt-pcr试剂盒和方法

Info

Publication number: CN112458211A
Application number: CN202011447452.6A
Authority: CN
Inventors: 杨恒; 李占鸿; 廖德芳; 李卓然; 杨振兴; 李华春
Original assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Current assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2021-03-09

Abstract

本发明公开了一种用于蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）血清型鉴定的RT‑PCR试剂盒及方法，属于兽医传染病检测技术领域。所述RT‑PCR试剂盒主要用于12种血清型的BTV的血清型鉴定，所述的12种血清型分别为BTV‑1、BTV‑2、BTV‑3、BTV‑4、BTV‑5、BTV‑7、BTV‑9、BTV‑12、BTV‑15、BTV‑16、BTV‑21与BTV‑24。所述RT‑PCR试剂盒包括：12种血清型BTV的特异性RT‑PCR扩增引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.24所示。本发明具有特异性好、快速简便、成本低廉的优势，不仅可进行12种BTV血清型的准确定型，还可通过扩增产物的测序，获取BTV基因节段2的遗传特征，为病毒的进化特征分析提供数据。

Description

一种蓝舌病病毒血清型鉴定的一步法RT-PCR试剂盒和方法

技术领域

本发明属于兽医传染病检测技术领域，具体涉及一种BTV血清型的一步法RT-PCR鉴定方法和试剂盒。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue，BT)是一种通过吸血库蠓(Culicoides spp.)叮咬易感动物传播的烈性出血性虫媒病毒病，其病原为蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)。BT呈世界范围分布，非洲、北美洲、南美洲、大洋洲与亚洲的热带、亚热带与温带地区均有疫病的爆发。BTV可感染几乎所有的反刍动物，牛和山羊感染病毒后，往往无明显的临床症状，成为病毒的储存宿主与传播源。易感绵羊感染BTV后可出现明显的蓝舌病临床症状，表现为高热、消瘦、口唇充血肿胀及糜烂、鼻腔和胃肠黏膜出血溃疡、蹄冠脱落引起跛行等。当新血清型BTV传入时，感染绵羊的发病率可达80％，死亡率高达40％，给养殖业带来毁灭性的灾难。世界动物卫生组织(Office international desépizooties，OIE)将BT列为法定报告的动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。

BTV为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，目前已在世界范围确认了27种BTV血清型(BTV-1～BTV-27)。BTV基因组大小约20kb，由10个节段(Seg-1～Seg-10)的双链RNA(dsRNA)组成。Sge-2编码的VP2蛋白是构成病毒外层衣壳的主要蛋白之一，与病毒感染早期对细胞的吸附和侵入有关，诱导机体产生针对特定血清型BTV的中和抗体，决定着BTV的血清型。BTV的Seg-2/VP2序列具有高度变异的特性，不同血清型BTV毒株之间Seg-2核苷酸序列差异在38.6％～59.5％之间，VP2蛋白的氨基酸序列的差异在40.5％～72.9％之间。根据Seg-2的变异，可将27个血清型的BTV分为A-L等12种基因群。研究发现，同一种血清型BTV的Seg-2/VP2序列差异度可达31.6％/27.4％，可根据这种差异将同一种血清型BTV的Seg-2分为“东方型”(Eastern)和“西方型”(Western)两种地域型。

1979年在我国云南省师宗县爆发BT的发病绵羊上首次分离并确认了BTV在我国的存在。1996年至1997年，申请人在我国云南省设立的哨兵牛中分离出7种血清型BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15和-16)。2012年以来，发明人在全国范围开展了BTV流行病学调查，在我国的云南、广西、广东、江苏与湖南相继分离出了12种血清型的BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24)300余株。多种BTV血清型在我国的流行，不同血清型BTV诱导的中和抗体无明显的交叉保护，给我国BT的防控带来了严峻的挑战。对流行BTV的血清型进行快速准确的鉴定，是确保BTV流行病学研究顺利开展，科学制定BT防控策略的首要前提。

血清中和试验(Serum neutralization test，SNT)是鉴定BTV血清型的经典方法，但该方法存在费时、费力以及实验成本高等缺陷，主要体现在以下四个方面：(1)需准备细胞、细胞培养基、胎牛血清、细胞瓶和细胞培养96孔板；(2)需准备24个血清型BTV(BTV-1至BTV-24)标准参考病毒，制备各个血清型病毒的标准阳性血清；(3)完成中和试验一般需要2周的时间，不利于病毒血清型的快速鉴定；(4)自然界中，几种血清型BTV感染同一个宿主动物的情况十分普遍，通过血清中和试验进行病毒的血清型鉴定，往往存在对其它血清型BTV漏检的可能性。鉴于血清中和试验在鉴定BTV血清型上的不足，亟需开发一种快速、成本低廉、准确的BTV血清型诊断方法。

发明内容

为解决BTV血清型鉴定现有技术的不足，本发明提供了一种BTV血清型鉴定RT-PCR试剂盒。本发明根据我国流行的BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24等12种血清型毒株的Seg-2序列特性，选择每种血清型Seg-2序列高度保守区域设计出12对血清型特异性RT-PCR引物并制备试剂盒。该试剂盒克服了传统血清中和试验耗时长、过程繁琐、实验成本高等方面的不足，具有操作简便、花费时间少、成本低廉、检测结果准确等优势，填补了国内尚无BTV血清型的RT-PCR检测试剂盒的空白。

本发明的技术方案如下：

1.蓝舌病病毒血清型鉴定的一步法RT-PCR试剂盒

本发明第一方面提供一种BTV血清型鉴定的一步法RT-PCR试剂盒，包括用于特异性扩增12种血清型的BTV毒株Seg-2基因序列的引物对组合，其中，所述12种血清型的BTV分别为BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24。

在本发明的一些具体实施方案中，

用于特异性扩增BTV-1型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-2型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-3型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-4型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-5型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-7型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-9型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-12型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-15型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-16型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-21型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-24型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述一步法RT-PCR试剂盒进一步包括RT-PCR缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂。

在本发明的一些实施方案中，所述一步法RT-PCR试剂盒进一步包括病毒RNA提取试剂。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括12种BTV血清型毒株的标准阳性对照样本。在本发明的一些具体实施方案中，所述标准阳性对照样本为所述12种血清型BTV毒株的核酸样本。

2.蓝舌病病毒血清型鉴定的一步法RT-PCR检测方法

本发明第二方面提供一种BTV血清型鉴定的一步法RT-PCR方法，包括以下步骤：

S1，获取待检测BTV的核酸样本；

S2，对步骤S1中提取的核酸样本进行热变性处理；

S3，利用本发明第一方面所述一步法RT-PCR试剂盒，对步骤S2中经变性处理的核酸模板进行一步法RT-PCR；

S4，对步骤S3中的RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序，根据测序结果确认待检测BTV的血清型与Seg-2序列特征。

在本发明的一些具体实施方案中，

在本发明的一些实施方案中，步骤S3中一步法RT-PCR反应体系为：5μL核酸模板，12.5μL one step RT-PCR Buffer，1μL PrimeScript one step Enzyme Mix，上下游引物(20μmol/L)各0.5μL，加入RNase Free ddH₂O补齐至25μL。

在本发明的一些实施方案中，步骤S3中一步法RT-PCR反应程序为：50℃30min；94℃2min；94℃30s、56℃30s、72℃1min 15s，30个循环；72℃10min。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)特异性好、灵敏度高：

本发明设计的12种BTV血清型特异性引物仅能扩增对应血清型BTV的核酸模板，与其他血清型BTV毒株核酸无交叉扩增现象；同时灵敏度试验结果显示本发明建立的12种BTV血清型特异性RT-PCR检测方法的检测灵敏度在1.28×10²拷贝(BTV-2)至9.62×10²拷贝(BTV-1)之间，表明本发明建立的BTV血清型RT-PCR检测方法具有非常好的特异性与灵敏度。

(2)实际应用效果十分明显：

利用本发明试剂盒，发明人对分离自我国云南、广西、广东、江苏等地的BTV共计162株进行了血清型鉴定，检测结果与前期病毒中和试验结果完全一致；对PCR产物进行测序验证，表明本发明扩增所得的中国各血清型BTV毒株的Seg-2序列与对应血清型的BTV国际参考毒株聚为一簇，进一步证实本发明建立的中国流行BTV血清型RT-PCR检测方法准确、可靠，可有效用于中国不同时间与不同地域分离BTV毒株血清型的鉴定。

(3)与传统血清型中和试验比较具有显著的优势：

本发明的方法具有简便、快速、准确等优点，为开展我国BTV血清型的鉴定与分子流行病学调查研究提供了技术支持。本发明提供的BTV血清型特异性RT-PCR检测试剂盒与传统的血清中和试验相比，具有快速、准确、成本低廉、可获取病毒关键遗传信息等明显优势。下表展示了两种检测方法的比较结果。

附图说明

图1显示了中国12种BTV血清型代表毒株Seg-2的RT-PCR扩增结果。M:DNA分子标准量；泳道1至12分别代表BTV1、BTV2、BTV3、BTV4、BTV5、BTV7、BTV9、BTV12、BTV15、BTV16、BTV21与BTV24毒株的RT-PCR扩增结果。

图2显示了以中国12种BTV血清型毒株不同浓度的核酸模板进行RT-PCR检测方法灵敏度验证。M：DNA分子标准量；泳道1至5：BTV核酸拷贝数为10⁵～10¹拷贝/μL的RT-PCR扩增结果；泳道6：阴性对照RT-PCR扩增结果。

图3显示了邻近法构建的中国流行BTV毒株的Seg-2系统发生树图。括号中的N表示研究中鉴定出的同种血清型中国分离BTV毒株的总数。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1一步法RT-PCR试剂盒与方法

1材料

本实施例用到的中国流行的12种血清型BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24)代表毒株信息见表1；BTV-1至BTV-24等24种BTV血清型参考毒源自世界动物卫生组织(OIE)BTV参考实验室Onderstepoort Veterinary Institute:SouthAfrica；体外转录获得的BTV Seg-10单链RNA(Single strand RNA,ssRNA)核酸浓度为1.48×10¹²拷贝/μL(杨振兴,等.蓝舌病病毒和流行性出血病病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学,2019,49(09):1104-1111)。

表1中国流行的12种BTV血清型代表毒株病毒分离信息与序列相似度

2主要试剂与仪器

本实施例及以下实施例用到的MagMax磁珠法病毒核酸提取试剂盒购自美国应用生物系统公司(Applied Biosystem Incoorporation，ABI)；病毒DNA/RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、荧光定量qRT-PCR试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒和DNA marker DL5000均购自宝生物工程(大连)有限公司。

3引物的设计及合成

从GenBank中下载12种血清型(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21、-24)BTV的Seg-2序列，与申请人前期获取的我国流行的12种BTV血清型(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21、-24)毒株的Seg-2全长序列进行序列比对分析。选择不同血清型Seg-2的高度保守区域，分别设计出12对BTV的血清型特异性RT-PCR扩增引物。引物信息见表2，引物由上海捷瑞公司合成，合成的引物均采用PAGE方式进行纯化，引物以无RNA酶水溶解，稀释为20μmol/L，冻存于-20℃备用。

在保证BTV血清型特异性RT-PCR引物特异性的前提下，发明人还综合考虑了包括但不限于PCR扩增效率、便于测序、获取足够多的序列信息用于进化分析等多种因素，将BTV血清型特异性RT-PCR的上游引物设置在Seg-2全长序列的202～337之间，下游引物设置在Seg-2全长序列的1460～1637之间，扩增PCR产物大小在1151～1321bp之间，保证了获取的DNA测序信息足够反映BTV的Seg-2序列特征。RT-PCR扩增基因片段可通过两个测序反应进行测通，便于不同血清型毒株Seg-2序列在同一区域进行序列比对，构建系统发生树，从而能够获得待鉴定毒株与不同血清型毒株之间的进化关系。

表2中国流行12种血清型BTV毒株血清型RT-PCR鉴定引物序列信息

利用上述引物，制备得到BTV血清型特异性一步法RT-PCR检测试剂盒。

4病毒核酸提取

取50μL病毒液，使用MagMax磁珠法病毒核酸提取试剂盒，按操作说明书在MagMaXExpress96核酸自动提取仪(ABI)上进行病毒核酸的提取。将提取的核酸于94℃变性3min，立即冰浴，将变性后的病毒核酸于-80℃保存备用。

5 BTV血清型特异性RT-PCR检测方法

以中国流行的12种BTV血清型代表毒株(表1)的核酸为模板，使用表2中的BTV血清型RT-PCR引物，进行BTV Seg-2的一步法RT-PCR扩增，反应体系如下：5μL核酸模板，12.5μLone step RT-PCR Buffer，1μL PrimeScript one step Enzyme Mix，上下游引物(20μmol/L)各0.5μL，加入RNase Free ddH₂O补齐至25μL。反应程序如下：50℃30min；94℃2min；94℃30s、56℃30s、72℃1min 15s，30个循环；72℃10min，4℃保存。反应结束后，取5μL扩增产物进行电泳检测。将扩增的PCR产物进行测序分析。

结果显示，12种血清型BTV毒株的扩增产物大小均在1kb左右，与预期扩增大小一致(图1)。将扩增产物的测序结果进行BLAST比对分析，对12种血清型BTV测序结果显示，分别扩增出BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24的Seg-2序列，与参考毒株的序列相似度在69.0％至97.8％之间(表1)，与血清中和试验鉴定出的BTV血清型一致，表明发明人成功建立了针对中国流行BTV毒株的血清型特异性RT-PCR检测体系和方法。

扩增出的BTV-1血清型毒株的Seg-2序列如下(SEQ ID No.25)：

AAAGACTCGATGGATGCGCAGCCTCTGAAGGTTGGATTAGATGATCGAACGCAAAAGATAGCGCACTCTTTACATAATTGTGTAGTAAAAATTGACTCAAAGAAAGCGGATACGATGTCTTATCATGTCGAGCCGATTGAAGATCCGTTGAAAGGATGTTTACACACAAGAGCGATGCTATGGAATCATTTAGTTCGTATTGAGATGTCGCACGCGGCTCAAGAAATGGCTTACATTTTGAAGCCTACATACGATATTGTCGTGCACGCCGAGAGGAGAGATCGGAGTCAGCCCTTCCAGCCTGGTGATCAAACATTAATCAATTTTGGTAGAGGACAGAAAGTTCAGATGAATCACAGTTCTTACGAGAAGATGGTAGAGGGGTTAGCGCACTTAGTGATAAGAGGTAAGACGCCTGAGTTGATCCGGGACGAAATAGCTAAGTTGGATGAGATATGTAACAGATGGATACGCAGCAGGCATGATCCCGGAGAAATCAAGGCTTATGAATTATGTAAGATACTATCAACTGTTGGTCGGAAAATGCTGGATCAGGAGAAAGAACCTGCGGATGAAGCGAGCCTATCAATTCGGTTTCAGGAGGCTATTGATAATAAATTTAGACAACATGACCCAGAGCGTTTAAAGATATTCGAACACAGAAATCAGCGTAGAGATGAAGATCGATTTTATATTTTATTGATGATTGCCGCTTCAGATACATTTAACACACGCGTATGGTGGTCAAATCCATATCCATGTTTACGGGGAACGTTGATGGCTTCTGAAACGAAGCTTGGTGATGTTTATTCAATGATTCGATCGTGGTATGATTGGAGCGTTAGACCCACGTATACTCCTTATGAGAAATCGAGAGAGCAAGAAAAATATATATACGGTAGAGTTAACCTATTCGATTATGTTGCCGAACCTGGAACAAAGATTATACATTGGGAATATAAGTTAAATCAGCAGACTAAGGACATCACTTATGAGCAAGGTAACCCTTGCGATTTGTTCCCGGATGATGATGAGGCTATCGTAACGAAGTTTGACGATGTGGCGTATGGACAGATGGTGAGTGATTTGATAAACGGCGGCTGGGATCAGGAGAGATTTAAAATGCATAAAATCCTTAAGTCACAAGGAAATGTTTTAACAATAGATTTCGAAAAGGATGCTAAGTTAACATCTAATGAAGGAGTTACGATGCCTGAATATTTTGATAAGTGGATAATAGCACCGATGTTTAACGCTAAATTACGAATCAAACATAGTGAAATCGCACAACGACGGAATGACGATCCAATGGTGAAACGTACGTTATCTCCTATCGCTTTTGACCCTATTGTGTTACAGAGACTAACGTTAGCGCGTTTCTATGATATCCGCCCCGCTATAATGGGACAGGCACTCTCACGACAACAGGGACAATCTACATATGATGAAGAGATTTCAAAGATAGAAGGCTATGCAGAAGTCCTGCAACGGCGCGGAATCGTACAAATTCCTAAGAAACCTTGCCCGACCGTCACCGCGCAATACACCCTAGAGCGTTACGCATTATTCCTGATCAATATCTTAGAGCAGCACGTGATTCAGAGTACTGATGAAGATGTAACATATTCGCACCCACGAGTTGACTATAAATTAGAAATTTATGGTGAGAGCATCGTAGACATTTCCCAGATAGTTATATTTGTGTTTGACTTTTTATTTGAACGGAGACGAACGGTTAGAGGAGTATACGAATCACGATATATGGTGACACGCATAAGGAACGCGCAAGGTCAGAACCG。

扩增出的BTV-2血清型毒株的Seg-2序列如下(SEQ ID No.26)：

GTGCAATGGATGATTAAGGATAGCACTGATCAGCAACCGCTAAAGATATTAATTGATGAGAATCATAGCCGTGTAGTTCATTCGCTTTTTAATTGCCAAGTGAAGATAGATGCGAAGAAGGCTGATACACTATCTTATCATGTTGAGGCGGTTGAGGACCAAACTAAAGCATGTCTCCATACTAAAAGTTATATCTGTAATCATCTAATGAGAATGGATTTGTTTCATGCGGCGCAAGAAATCGCGTATGTGATCAAGCCAACATACCAATTAATAGTTCATTCAGAGAGAGCATCAACGTCAGAGAATTTCGATATCGCTCGGCAGAATGTAATCACTCTGAGGCGAGGGCATAGGGTGCAGATGGGAGATGAAGCATATGCAAAATTAATCCAGCGGCTAGTTCGACTTACTGTACAGGGTAACGTTCCGAGGGCTATTCAGAGCGAAATGGAGCAACTCGAAGCAATTAGATCCAGATGGGCGTCAGGTAGATATGATCCTGTACATGTTAATTCGCAAGAGTTGTGTCGTATACTATCACGCATCGGAAGGATCATGTTAGATCAGGAGGCGGAACCTGTGGATGAAGGTAGTCTTTCACTTAGATTTCAGCAAGCGTTAGATGAAAAATTTCGTTTAAATGATTCAGAGAGAAATAAAATATTCGAGCCTAAGTCGCATCGAAAAGATGAAGATAGGTTTTATGTCTTGTTAGTTATAGCAGCGTCTGACACCAACAACTCAAGGATCTGGTGGTCAAACCCGTACCCATGTCTAAGAGGAGCATTAATCGCTGCTGAGTCGAAGCTGGGAGATGTTTACTTTACATTACGTTCATGGTATGATTGGAGCGTTCGTAGCAACTACGCACCTCGCGAAAGAGAGCGTGAAACAGAGAAGTATATCTTTAGTAGGGTTAATCTTTTTGATTATGATGCGGGACCGTCAAGTAAAATAATACATTGGGAGTACCAGTTGTACAAGAATGAGTGGAAGGTTACCCTTGAACGAGGAAATGCTTGTGATTTGTACCCAGACAGTGATGAGGACGTGATAGTTACGAAATTTGATGAGGCTAAGTACACGGAGATGGTTGGAGAGATAATAAATGGTGGGTGGAATGAGGAAGAATTCAAAATGTATAAATTACTTCAGAGCGACGGTAATGTTCTAACTATTGACTTTGAAAAAGACGCCAAGCTGAACAGCACATCAGAAGTGATCCTACCTGATTACTATAACAAGTGGATCATTGCACCGATGTTTAATTCTAAGTTACGGATAACTGAGACGGAGATTGCTACAAACAAA。

扩增出的BTV-3血清型毒株的Seg-2序列如下(SEQ ID No.27)：

GCTTGCTTGGATGATTGAGGATTCTATGGATGTTCAACCCCTCAGAGTTCAGTTTAAGGAAGACCACAGCACGGTACAATATGAAATGTTCACCGCGAAGTTGCATATCGATTCTAGGAAAACAGATACCACGACTTATCACGTAGCCGCGATTGAATCATCAGGGGAAGGAGGGTGTAACCACATTCATTCCAGTCTATGGAACCACATGGTTCGTAATCACCTATTCCATGCGATACAGGAGTCGTGCTACATATTTAAACCAACATATCAGCTGATTGTTAATTCCGAGCGTTTAACACCAGAGGAGGAATTCAGAATTGGCGCGCCTCAATTCCACACGATACAGCGAAATCACAGGATGCGATTAGGTGATAATGCGTATGATAAATTTTCAAAAGGGTTAGTCCAACTGCGAGTTGATGGCAATGTACCTAGGGCCATACAGGACGAGATAGCAGCGTTAGATGCAATTAGAGATAATTGGATACGCGGGAACTTCAATCGTACGCATATTAAATCGCTTGAGCTATGTAAGCTATTATCTAGTATCGGTCGTAAAATGGTTGATATGGAAGAGGAGCCGAAGGATGAAGGTAGTTTATCGGTTAAATTCCAGTTTAAACTGGATGAGAAATTCTCACAGGATGATTCGGAGAGGGGTGTGATCTTCGCCTCGAGGAGCCATCGGACAAATGAGGAACGTTTCTACGTACTATTGATGATAGCTGCTTCGGATACTAATAATGGACGGGTGTGGTGGTCTAACCCCTACCCTTGTCTTAGAGGCACATTGATAGCATCAGAATGTAAGTTGGGCGATGTGTATCACACATTGCGTAATAAATACGAGTGGAGTGTTCGTCCGGGATATAGTCCAAGGGATTTGGATCGAGAGCGCGATAAATATATATTAGCGCGAACTAACCTATTTGATTTAGATGAAAGACCAGGAGAGAAGGTAATACATTGGGAATATGAGTTAATCTCGGAAGTATATGAAGTCAGCGATCATAAAGGTAATCATTGTGATTTATTTCCTGATGATGTTGAAATAACGACTAAGTTTGATGAAGTTAAATATAGTGAGATGATACAATCGATTATTGATGGTGGATGGAAACGGGAAACATTTAAAATGTATAAGATCTTAAGTGATAACGGTAATCCTTTATTGTATGACCTTGAGAAAGATGTTAAATTGGATAGCAAATCACAAATCGTATTCCCTCCGTATTACAATAAATGGACGTATGCCCCGATGTTCAATGCGAGAGTTAAACCCTGTGACGTAGAAA。

扩增出的BTV-4血清型毒株的Seg-2序列如下(SEQ ID No.28)：

ACTAATGCGAAGTGGATGAAGTGGGCGATTGACGATCGGATGGATATACAACCACTTAAAGTGACGTTAGATCAGCATTATGCCGTAAACCATCAACTGTTTAACTGTGTCGTAAAGGTTAAGACGGCAAACGCAGATACGATATATTATGATCTCCATCCGGTGGAAAGTAAGGCGAAAAAATGTAATCACGCGAACCTGGAGATGATGCGGAGTTTGACAATGATAGAATTGTTTCACGTTTTGCAAGGTGCGGCATACAGCTTGAAGTCAAATTATGACTTGATAGCAAATTCGGAAAGAGAAAGCCTAGAAGAAAGCTACCCAGTTGGGTCTGAGAAGTGGGTGCACCTGACGCGACGGACTAAGATCGGGAAGAGTGGACTATCCTATACCAGGTTTATCTCTAGTATGGTGCAGGTATTGGTGAGAGGAAAGATCCCTGATGAGATAAGAGAGGAGATTGCGCAATTGAATAGAATTCGAACGGAATGGATAGGTGCAGCTTACGATCGGAGTAGAATTAGATCGTTGGAACTGTGTAACATTCTATCCGCCATAGGACGTAAGATGTTGGATACGCAGGAAGAACCTAAAGATGAAATGGACTTATCAACACGCTTTCAATTCCAACTTGATGAAAAGTTTAATACTGCGGACTCCGAGCATGTGAACATATTTAGGACAGGAGGAGCGGCAACAAATGAGGGCAGATTCTATGCTCTTATCGCTATTGCGGCAACTGATACGCAAAAGGGCAGAGTTTGGAGAACGAATCCTTACCCGTGTCTTCGCGGTGCAATAATCGCTTCTGAGTGTGAGTTGGGTGACGTATATTACACATTACGTCATGTATATAGATGGAGCTTACGACCTGAATATGGCCAACGTGATAGGCAGCTCGAGGATAATAAGTATGTGTTTAGTCGCATTAACCTTTTTGATTCAAATTTAGCGGTGGGTGATCAGATCGTCCATTGGAGATATGAATTGGACGAACCGACAGAGACAAACTACGATAATGGCTACATATGTGTACCTCAGGAAAAAGACGATGAACTGTTGTGTAAAGTGGATGAGGAGAGGTATAAGGAGATGTTGGATAGAATGATTCAAGGTGGGTGGGATCAAGAGCGGTTTAAACTTCATAATATACTTACAGCCCCTAACCTCTTGACGATAGATTTTGAGAAGGACGCCTTTCTGAATTCAAGATCGGAGTTAATACTGCCTGATTATTTCGATAAATGGATTAACTCTCCAATGTTTAGCGCACGCTTGAGAATAACTCACGGAGAGATCGGTACAGCTAGAAGTAACG。

扩增出的BTV-5血清型毒株的Seg-2序列如下(SEQ ID No.29)：

CTTACGAGAAAAAGTTTCAACACAAACAGTGGCGTTACATTTCATACGGATCACAAATGGATGGAATGGATGCTATCCGATGCAATGGATGTTCAGCCACTGCGAATCGATTTAGCAGCGCAGAGCGAGTATGCAAAATGTGACTTATTTAATTCTTCGGTCTATGTCAGGAAAAAATATGTTGATGCGATTTCATATAGATACATATCGGTGGAAGATGATTCTAAGGGGTGCAATCATACGAGGATTTATAGCGTGAATCACTTGATAAATTGTGGATTGTATAACGTGGCGCAAGAGTGTGCATATGCGTTTAAGGATACAAATACATTAATAGTTAACTCACAAAGAGAAAACACTAGTGAGCCGTTCCAGCCTGGAAATCCAAGGATTGGAAGTCTGGGGAGGAGGGCGAGGGTTGACATGGCTGATCCTGGGTATCCGCTTTTCCGCGCAGGGTTACTTCAAATAGTCGTTAATGGCACCATACCAGCTGATATACGTAGTGAGATGGATCGCCTGAATCAAATACGTGAGGCATGGAAACGTGATAAAAATACAAGAGAAGTTAGAGCGCTCGATTTATGTATACTGCTATCAAAGATTGGTCGAATTAAGATGAATATGGAAGAAGAACCTAAGGATGAGGGAGCCATGTCGTTAAGATTTCAGGGGAAGATTGACGCGATGTTTTTCTCGGAAAATACGGAGAAAACGAATATTATGCGAGATAGTAGTGGTAGAACTGATGATGAAAGATTTTACGCCTTATTGCTGATTTGCGCTACGGATGCGTTCTCACGACGTATATGGCGCACTAACCCGTATCCATGTTTACGAGGCACCTTAATCGCAGCAGAATGTGTATTGGGAGATCCATATAAAACGTTACGCCGTAAGTTTGATTGGAGTGTACGCCATGCAGGAGATAAGATGCTGGAGGGGTCCTCGTATGTTTTTACAAGGATAAACTTATTCGATACGGATAAGGCGCCAGGCTCACGTGTAATACACTGGATACAGGAGACACTTCCCGTCATAAAAACAACCTGGGCTGAGGGATGTCCTTTAGCTGATGAAGCGCCAGATGATCATTTACATTGCAAAATAGATCACGCACAATATAGAGATCTGGTGTCAAGAGTTATAAATGGAGGTTGGGATCAAGAGAACTTTAAGATACATAAATTATTCGTTGAACGAGGCAATATTTTCTTAATGGATTTTGAAAAGGACGCAAAGATAACTACACAGTCTGAGGTGGAGTATCCATACTATTATGATACATGGGTCT。

扩增出的BTV-7血清型毒株的Seg-2序列如下(SEQ ID No.30)：

CCTCGTATTTTAGATGTGTCCATAGCAGCATATGATACGAGGAAGGGATATTGGAAATATAAAGGCATAGAGAAGATGACAAATCAGACCTGGTTGAAGTGGGCAATCAAGGATTTTATGGATGTGCAGCCACTGAAGGTGGATCTAGCTGATCTTGAAGGCAAAGTGAGGTATGATATGTTTAATTGTTCTGCTCGAATAGATGCTAAAAAGGCCGAGGCAATTTATTATGGTTGGGCTGCTCAGGAGGTAGTGAGCAAAGGTTGTAACCATGCAAAGAGCGAGATATTTCAGCATGTTGTAAGATGCGAGCTGTTGAATTGTTCGCAGGAAAGCGCGTACATTCTAAAGCCGACTCAAAAAATAGAACCCCTCGCTGAGAAGAATGATCTGGGTGAGAGGCTCGGGCCGGGCTCTAATAATTTAATTAATATGCGACGTGGGGATACGTTTAGGATGGGGACAGATCAATACAATCGCATGTTGCAGGGATGGTACCGGGTGAAGGTGAAAGGTCAAATTCCAAATATGGTTAGAGAAGAGATGGCTGAGCTAGTAAAGATAAAAGATAGATGGAAAGTTGCCAAAAACCCCAGAGAAATTAAATCTCTTGAGCTATGTAAATTGCTCTCCGCAATAGGTAGGAAAATGTATAATATGTATGAGGAGCCAAAAGATGAAGAAGCGGTTTCATTAAGGTTTCAGTGGAATTTGGATGAGATTTTCAAAACTGATAATAGAGAGCACGTTAACATTGCCGTCAATAAGAGTGGGAGAACAGATGATGAGCGATTCTTTGCGCTTATCATGATAGCTGCAACCGATACGAATCGCGGAAGGATTTGGTGGTCGAATATGTTTCCGTGCTTACGAGGTGCTTTAATTGCGAGCGAAACTCAATTCGGCGATGTATATAAAATGCTAAGGGTGCGGTTCGAATGGAGTGTGCGGAATGAATATAGCCCTCAGGCCGACGTTGCGAGACAGAATGAGAATTACGTGTACGCACGCGTCAACCTATTTGATCTAGTCGCTGATCCGGCAACATCTGTAATCCACTGGGAATATAAATTGGATGAGCCCTTAAAAACTAGTTACTCAGTAGGCCATCAATGTGATGAATATCCTGATGAATACGAATTGATTTGCTCCTTTGATGAAACTAAATATAGTGAAATGGTCCAACGCATTATAGAGGGTGGATGGGATCATAAAAACTTTAAGCATTATAAGATATTGAAAGAGGCTTCAAATGTGCTCACAATCGATTTTGAGAAAGATGCGAAGTTG。

扩增出的BTV-9血清型毒株的Seg-2序列如下(SEQ ID No.31)：

ATGAGGGTAATCAACTACCGCGAGCGTTAGATATCGCATTGAGTGCGCGTCTTACGAGAAAGAGCGTGCGAAATAATAATGGCTTGGACTTCCTTACTGATGATAAATGGATGGAGTGGATGCTATCTGATGCTATGGACGTTCAGCCACTAAAAATTGATTTGAATGCGCGAAATGGGTTTGTTAAGTGCGATACCTTCAACTCATCCATATATATAAGAAGGAAATACGCTGATGCGATCGCGTACCGATACACGTCATTAGAAGACGAATCAAAAGGTTGCAACCACACGAGAGTGTATATGGTTAACCATCTAATAAATAATGGATTATATAACGCTGCGCAAGAGTGTGCTTACGCTTTAAAAGATACGTATGTTTTACGGGTACACTCACAAAGAGAAAGGATCGATGAACCATTCGAGGCGGGTAGGCCGAGGATAGGTAGTTTGGGGAGGAACGCGAGAATAGACATGAACGAACCAGGGTATTCGCTTTTTAAAGGTGGGATGCTACAGATTACGGTGAGTGGTGAGGTGCCAAGCGATATACGCGTTGAAATGGAACGGTTAAACCAAATCCGTGCCGTTTGGATACGTGATAAGTCTTCAAGGGAAGTGAGGGCCATGGAGCTATGTACGCTATTATCAAAGATTGGACGTGTAAAATGGAATGCAGAGGAAGAACCCAAGGATGAAGGTGCTATGTCATTGAGGTTTCAGAACAAAATAGATTCAATGTTTTTCTCTGAGAATACAGAAAGAACCAACATTATGCAGAATGCAAGTGGTCGCACAGATGAGGAGAGGTTTTATGCCTTGTTGTTGATATGCGCGACGGACGCGTACTCACGTCGCATATGGAGGTCGAATCCATATCCCTGTTTGCGGGGCACGTTGATTGCGGCGGAATGTGTCTTAGGTGACCCGTATAGAACTTTGCGACGGAAATTTAATTGGAGTGTACGCCATTCGGCGGACAAAACGCTAGAAAATAATGCGTATGTCTTTGCAAGAATAAACCTGTTTGATACAGAAAAGACGCCAGGCACGCGGATCATACATTGGACGCAAGAGCTAACTATGGAGTCACAGACAACTTGGGATGAAGGATACCCATTGAAAGATGAAGCGCCCGATGATGAGATGCATTGTAAGATTGATACAAGCAAATATAAAGAGATGGTGACGCGGGTGATTAACGGTGGAT。

扩增出的BTV-12血清型毒株的Seg-2序列如下(SEQ ID No.32)：

TATAGATGTGTGGGTTAAGAAGCGGTTGGAGGAGCAAGCGGATTTACAAGCCGTATATCATGATGTTGATTTAGGACGTGGTAAGTTAAAGTTTAAAATGCTAACGGGGTTGGTGAAACTAGATTCGAATTATGCGGAAACAGTTGGCTACGATTATGCACCGGTGCCGAAGGTGGGATGCGATCATGGGAATGTCGATTTTCTATATGACTTCATTTTATCGGGTAGCCTCCAGGTATCGAAGACCGCGGGATACATTTTGAAGCAAACGTATCGATTAACTGTGCACGCTGAAGCTAACGCAGAAACACGAGATCAACTTATCGTAAATGGGGTGTATACCGAGGGCGTTACGCGCGGTGAGGAGATAAGGGATATGAAGAAAAAGTGTTATTCAAGATTCCGTGATGGATGGATTCGAGCTACTATACAGCCTAAAATAGTCGAGGAGTTGAGGCAGAGTAAGGAGGTGCTAGACAGAATATCGAGTAAATGGTATGAAGAGTTGACGACGCCAGACGTTGTTGAAATATGTAAAATCGTGTCATCAATTGGACGCCAGATGTGGAATAGTGAGGAATTGCCGGTTGATGATGCAATGAGATCAAAAGTTTTTCAGGAAGAGTTGCGGCTGTTATTCCGAGTTGGGAATAGCGAATATGATACAATTCAGGCTATCCGAAGTGGACAAACGCCTTTGAAGAAATTCTATGCCTTGTTAGCAATTGCCGCGACTGACAGCTATCGTTGGCGTATATGGTGGAGTAATCCGTACCCCTGCTTACGAGGAACGATCATTGCGTGTGAGATGGAACTAGGGGACGTCTACAAAACTTTAAGATCAACTTTCCATTGGAGCTTACGTCCTACATATGCCACCCGGAAGGAGATTGATCGCGAACGAAGAGCCTATCCATATCAGAGAATAAACCTCTTTGAATCGCGTTTAGATCCTGGAACCCGCATAATCAATTGGTTGGTGGTAAGGGAGCCATTAGCTGAACCAGACGTCGAGTCCGGTCGTGTGTGTGTGACGTCGACAGAATCTGAATACATTCTAAAGGTGGATGACACGAAGTATAGAGAAATGATTGGTCAGATAATTGAGCGGGGGTGGGAGAAAGAACATTTGAAACTGGAAAAGATTGTCCAGGATGAGGGTAACGTGTTTCAAATGGAATTTGAAAAAGATGCGAGCTTAGATGAAAGGAGCCATCTAGTTATGCCGTATTATTATGATAAAGAGA。

扩增出的BTV-15血清型毒株的Seg-2序列如下(SEQ ID No.33)：

TGGCGACGTAACGAAGTGGGTTACAAACCGCACGGATGAGTTCCACGATTTACAGCCCATTTATCATTCAACCGATGAAAGGATCAGCAAGATTAAATTCACTTCGCTACTGGGAAGCATCGCCACCGAATCAAATTATGCGGAAAGTATGTCTTATCATTATGTAGGAATTGAGAGAAGTGTCTGCGATCATTCGCGGTGGCATCGATTTTTCCCAATGTTATTATCTGATACGATTAATCTAAGTAAGGAAGTAGGCTATATATTAAAGGAGACCTATAAAATTAAAGCAATTGGAGAGGCGCGAGATGGACAGAGGCAGGAGCTGCATGTGGATGCGCCTTACACGCCCGGCATAAGGAGGAACGAAAAGATAAGCGATATGAAGCAGCCCGTATATAAGAGGTTTGTTGAGGGTTATATACGCTGCCAAATTGAGCCAAATGTTCCAGAAAGACTTACCGAATTGAAGAACCAGCTCGATGGTATAAGCACCGCATGGTATGGTGGACAGACGCCCATTGTAGCCGATGAAATCTGTAGGATAACATCACAGATAGGACGTATGATGTGGAATACGGAGGAAGAACCTGTTGATGAAACTATGAGATCAAGGGCATTCCAGGAGAGCATCAGATTGATGTTTCGTGCCGAGAATAGTGAATACAGCAATATACAGGCGGTTGGAAGTGGTAGGACGCAAAGGCAAAAGTTTTACGCTTTACTGATGATAGCGGCTACCGATAGTTTTAGGTGGCGTATATGGTGGAACAACCCGTACCCGTGTTTGCGTGGCTGTTTGATCGCTTGCGAAATGGAGTTGGGGGATGTTTACAAGAGCCTGAGATCAATTTATAAGTGGACTCTGCGTCCGAGCTATTCGCCGCAGCGTGAGATCGATAGACAACTTAACGTTTTCCCATATCAGAAAATAAATCTGTTTGACTACACTGGTGTACCTGGTACTGAGATAATACATTGGCGCATCGCTCATAGACCAGTACCAAAAGAAGTAGATTATGAGCACGGCTTTCTGTGTCCGGAGAGTGGTGATACGGACATCGTGATGGCGATTGATGACGATCTATATAGCGCTTTTAAACGTAAGGTTATAGAACGAGGGTGGGAGCAGCAGGCGTTAAAATTAGACGAATTGGTCCTATCGGAGAACAATATTTTTAAGATGGAATTTGAAAAGGATGCACACCTCGACAACCGCAATCATCTGGTTATGCCTCCATACTATG。

扩增出的BTV-16血清型毒株的Seg-2序列如下(SEQ ID No.34)：

GTTAGAATGGATGATAGGAGATTCGATGGACGTGCAACCTCTAAGAGTCCAGCTGAAAGAAGATCACAGTACAATACAATATGGGATGTTCTCAAACACGTTACACATCGATTCGAGGAAAGCGGATACCACGTCATATCATACGATTGCTGTAGAATCAAAAGGGGAACGTGGGTGCTGTCACGTTCACACGGCAATTTGGAATCACATGGTACGTAATCACTTGTTTAACGCCGTCCAAGAGGCGTGCTACGTGTTTAAACCGACGTATGATTTAATAGTGATTGGTGAAAAGCAGAATCGTGAGGATGAATTTAGGATTGGCGAACACAATTTTTATACCATAACACGGAATCACCACATGCGTTTAGGCGATAACGCATATAATCAATTCATGAAGGGTTTGGTTCAGTTGCGCGTGGCGGGAGTGACACCGAACGTAATACGAGAGGAAATGGCCGCTTTAGACGCAATAAGGGATACTTGGATAGGAGGGAACTTCGAGCGAACACACATTAAATCTCTTGAAATATGTAAGTTATTATCCAGCATTGGAAGAAAGATGGTTAATATGGAGGAGGAACCAAAGGATGAAAGAGACCTATCAGTTAAATTCCAATTTAAACTCGACGACAAATTTTCAACAACCGATCCGGAAAGAAACGTCATCTTTACACATAAAACACACCGTACGAATCAAGATCGTTTCTATGTGTTGCTAATGATTGCGGCGTCGGACACAAATAACGGTAGAGTATGGTGGTCAAACCCTTATCCATGTTTACGTGGCGCGTTGATCGCGTCTGAATGCAAGCTTGGTGACGTGTACCATAAATTACGGGCGTGGTATGAGTGGAGCGTAAGGCCTGAGTATAAACCGCGAGATTTGGAGCGAGAACAAGAAAAATACATCGTTGGGCGCGTTAACCTCTTTGACTTAGAAGGGGAGCCTGCAACGAAGGTGTTTCACTGGGAGTACGAATTGATTAATAAAGTGTATCAGATAACGAATCATACGGGGAATCATTGCGATTTGTATCCTGACGATGTGGAGATCACGGCCAAATTTGATGAGGAGAGATACGGAGAGATGATTCAAACGATAATTAACGAAGGATGGAAGCACGGTGACTTTAAGATGTTTAAGATTCTGAAGGAAGAGGGTAACCCCTTACTATATGATCTAGAAAAGGACATTAGGTTAGATAGTAGATCACAAGTTATATTTCCACCATATTTTAACAAATGGACGCACGCACCAATGTTTAATGCAAAAGTGAAACCATGCGAAGTCGAGTTAGCACA。

扩增出的BTV-21血清型毒株的Seg-2序列如下(SEQ ID No.35)：

ATGATCCGAGATTCAATGGATGTGCAGCCCTTAAAAGTTAGTCTAGAGCTATCATCAAAGATTAAACATAGTTTGTTTAGTTCTAATGTGTATGTGTCAGTTAAGAAAGCGGACACCATATCGTATCATATAGAGGCAAAGGAGGTTGAAACGAAGGCGTGCGACCATGCACGAGTGGCGATGTGGAATAATCTTGTAAGACATGAGATGATACATAGCGCGCAGGAGCCAGCATACATCTTGAAACCTACGCTCGACATAATTGTGCACTCAGAGAGGGCGTCGACAGATGTCCCATTCGAGCTAGTTGGTCAGCACTATGTTTCGATCGGGAAAAACCATCGAATAGTTTTGGGAGATGATGCTTATCGAAAGACATTAGATGGATTAACGAAATTACGCGTACAAGGACGAATCCCCGAATTAATACGAAATGAGATACAGCAACTTCACCAAATAAGGGATGCGTGGATAGCTGACTCATACAACCAACGACACATACGATCGTTAGAATTATGCAGAATCTTATCGCATATAGGAAGAAAAATGGTGCATATAGAAGAGGAGCCTAAGAATGAGAGTGATTTATCAGTTAAATTCCAGTTTAAGTTGGACGAAAAATTTAGAGTTAATGATGATGAACGTAATGTAATATTCACATCGAAAGGCCAAAGGAATGACCAACAACGGTTCTTCGTATTGATTATGATCGCAGCGTCAGATACTTACAACAGCCGCATTTGGTGGACGAATCCGTACCCATGTTTGCGCGGCGCTTTAATCGCTTCTGAAACTTCGCTTGGAGACGTGTATTGGACATTAAGACATTTCTATGATTGGAGCGTTAGACCAGCATACTCGCCGAGGCAAAAAGAACGAGAAGACGATAAGTACTTATATGGTAGGGTGAATCTATTTGACCTTGATGCCGATCCAGGCACACAAATTATACACTGGGAGTATAAGCCCATTATAAGTACGGTAAAGACTACGTATGAGAAGGGGAATATGTGTGATTTATTTCCTGATGTAGATGGTATTACGACTAAGTTCAATAAGACGGCTTATACTGATATGATTAGCGAGTTGCTAAATGGCGGCTGGAACACACGTGAATTCAAAATGCACAAGATACTTGAAAGCGTGGGAAACGTTCTGACGATCGATTTCGAGAAAGACACAAAGCTTAACTCAAGATCTGAATTCTCATTACCGTACTACTATAATAAGTGGATATATGCTCCAATGTTTAACGCCAAATTAAGGATAACGCAAACGGAAATCGCCCAGGGTAGAGC。

扩增出的BTV-24血清型毒株的Seg-2序列如下(SEQ ID No.36)：

ACTAATGCCAAGTGGATGAAATGGGCGATTGATGACAGAATGGACATTCAACCTTTGAAGGTGACGTTGGATGACCATTATTCTGTGAATCACCAGCTATTCAATTGTGTAGTAAAAGCAAAACCGGCTAACGCCGATACGATTTACTATGATTATTATCCACTAGAAAGCAAGATGAAAAAATGTAACCACACGAATTTAGACATGTTGCGCAGTTTGACAACTATGGAGATGTATCATATATTGCAAGGAGCGGCTTACGGTTTGAAATCGACATATGAGTTAAAGGCTCACGCGGAGCGGGAGAATACGGGTGAGAGTTATCCGATAGGGGAAAGACTGTTGCAAATACCTAGAGGAACAAAGATAGGGAGTAGAGGAGAGCCTTATAATAAATTTGTCGCTGGATTGGTAAAAGTAACCATAAAAGGTAAAGTTCCTGCTGAAATCAGGGAAGAGATGAATCAACTAAATCGAATCAAAGAGGAGTGGAAGAGTGCAGCACACGACAGAAGCAGAATACGCGCTTTAGAACTATGTAAGATCCTATCAACGATTGGCCGAAAAATGCTGGACGCGAAGGAAGAGCCGAAGGACGAGATGGATTTATCTACACGATTTCAATTTAAACTAGATGAGAAGTTTACCAAAACTGATTCAGAACATATAAACATATTCAGAGCAGGTGGACCCGCTACAGATGATGGTAGATTCTACGCTTTAATCGCGATTGCGGCAACTGATACGCAAAAAGGTAGGGTGTGGAGGATGAATCCGTATCCGTGTTTACGCGGCGCAATAATAGCGGCCGAATGCGAATTAGGTGATGTGTATTTCACGCTGCGTCAGGTGTACAGTTGGAGCTTGCGGCCAGAGTATGGACAGAAGGAAAAACCATTGGAAGTGAATAAGTATGTATTTAATCGGATTAACCTGTTTGACTCAGATCTGACAGTAGGAGATCAAATTGTACATTGGCGCTATGAGTTATACCCCCCGGTCGAGACGACTTATGATGATGGGTATCTATGTGGATCAGATAAAGAGGATGACGAGCTATTATGTGAAGTTGACGAAGAGAAATATAAGAAGATGTTTGAGGGTATGATCGAAGGCGGTTGGGACCAAGAGAGATTTAAACTTCATAGCATTTTAACTGACCCGAATCTATTAACGATAGATTTTGAAAAGGATGCGTATCTCAATTCAAGGTCGGAGTTGGTGTTTCCTGAATATTTCGATAAGTGGATTAATTCTCCTATGTTCAACGCGAAATTACGATTAGCCCATGGGGAAATCGCAACGCGCAGAGCAAATGATC。

实施例2 BTV血清型特异性RT-PCR检测试剂盒和方法的特异性实验

利用实施例1中提取的24种血清型BTV(BTV-1～BTV-24)参考毒株的核酸5μL为模板，分别以实施例1表2中的BTV血清型特异性RT-PCR引物，按照实施例1的反应条件进行PCR扩增，反应结束取5μL PCR扩增产物进行电泳检测。反应同时设立阴性对照，分析BTV血清型RT-PCR引物在不同血清型毒株间的特异性。

结果显示，每种BTV血清型RT-PCR引物仅与对应血清型的病毒核酸模板之间产生特异性的扩增条带，对其它血清型毒株的核酸扩增结果均为阴性。表明本发明设计的BTV血清型鉴定引物具有良好的特异性，与其它血清型BTV核酸之间无交叉扩增现象。

实施例3 BTV血清型RT-PCR检测试剂盒和方法的敏感性实验

取实施例1表1中12种血清型BTV代表毒株的核酸1μL为模板，以BTV群特异性qRT-PCR检测方法进行BTV核酸的绝对定量qRT-PCR(杨振兴,等.蓝舌病病毒和流行性出血病病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学,2019,49(09):1104-1111)，通过Seg-10ssRNA为模板进行qRT-PCR反应获取的标准曲线，计算出12种血清型BTV毒株核酸的拷贝数，用于BTV血清型qRT-PCR灵敏度分析

将已知核酸拷贝数的不同血清型BTV RNA进行10倍梯度稀释作为模板，选择对应的BTV血清型特异性RT-PCR引物，按照实施例1的反应条件进行一步法RT-PCR扩增。反应同时设立阴性对照，分析BTV血清型RT-PCR方法对不同浓度核酸模板的扩增效果。

对中国流行12种BTV血清型代表毒株的核酸拷贝数进行定量，结果显示各血清型BTV代表毒株的核酸拷贝数在4.54×10⁶拷贝/μL(BTV-4)～6.82×10⁹拷贝/μL(BTV-12)之间(表3)。

表3中国流行的12种BTV血清型代表毒株的核酸拷贝数

毒株号	血清型	核酸拷贝数(拷贝/μL)
			YNSZ/V147	BTV-1	9.62×10<sup>7</sup>
YNPE/V146	BTV-2	1.28×10<sup>9</sup>
			YNDH/V025	BTV-3	3.46×10<sup>9</sup>
YNPE/V030	BTV-4	4.54×10<sup>6</sup>
			YNSZ/V084	BTV-5	7.85×10<sup>7</sup>
GDST/V089	BTV-7	2.66×10<sup>8</sup>
			YNDH/V008	BTV-9	8.45×10<sup>8</sup>
GXNN/V007	BTV-12	6.82×10<sup>9</sup>
			YNPE/V061	BTV-15	1.43×10<sup>9</sup>
YNSZ/V109	BTV-16	2.54×10<sup>8</sup>
			JSXY/V057	BTV-21	7.14×10<sup>6</sup>
YNDH/V015	BTV-24	8.45×10<sup>7</sup>

将提取的BTV核酸进行10倍梯度稀释，以10¹～10⁵拷贝/μL的各血清型BTV毒株的核酸为模板，分析BTV血清型RT-PCR引物的检测灵敏度。结果如图2所示，BTV血清型特异性RT-PCR引物对BTV核酸的检测灵敏度在1.28×10²拷贝(BTV-2)～9.62×10²拷贝(BTV-1)之间，表明本发明设计的BTV血清型特异性RT-PCR引物具有较高的灵敏度。

实施例4中国分离BTV毒株的血清型鉴定

为分析实施例1建立的一步法RT-PCR体系和方法能否对中国分离的BTV毒株进行血清型的准确鉴定，发明人对1996年～2017年分离自我国云南、广西、广东、江苏等地牛或羊的BTV共计162株进行了血清型RT-PCR鉴定。

提取待鉴定病毒的核酸，利用实施例1建立的体系和方法对分离的BTV血清型进行RT-PCR鉴定。将扩增产物送上海铂尚公司，以PCR扩增引物作为测序引物进行测序，对测序结果进行比对并构建系统发生树。

BTV毒株血清型RT-PCR的鉴定结果如表4所示，分离的162株BTV分属12种BTV血清型(BTV-1、-2、-3、-4、-7、-5、-9、-12、-15、-16、-21与-24)，与通过血清中和试验对病毒血清型鉴定的结果一致。对162株BTV Seg-2的RT-PCR产物测序结果与系统发生树构建结果显示，中国流行的12种血清型BTV的Seg-2基因分别与对应血清型的BTV国际参考毒株聚为一簇，分属9种基因型(A、B、C、E、F、G、H、I、J)(图3)。以上结果进一步证实本发明建立的中国流行BTV血清型RT-PCR检测方法准确、可靠，可有效用于中国不同时间与不同地域分离BTV毒株血清型的鉴定。

表4 1996至2017年分离的不同血清型BTV毒株血清型鉴定结果

血清型	分离地	分离动物	分离时间	毒株数
					BTV-1	云南、广西	牛、羊	1996、2012、2013、2015、2016	15
BTV-2	云南、广东	牛、羊	1996、2013、2014	15
					BTV-3	云南	牛	1996、2012、2013、2014	18
BTV-4	云南、广西、广东	牛、羊	1996、2012、2013、2015、2016、2017	31
					BTV-5	云南、广东	牛	2012、2013、2015、2016	8
BTV-7	广东	牛、羊	2014	2
					BTV-9	云南	牛	2012、2015	9
BTV-12	云南、广西、广东、江苏	牛、羊	1996、2012、2014	13
					BTV-15	云南、江苏	牛	1996、2014	5
BTV-16	云南、广西、广东	牛、羊	1996、2012、2013、2014、2015、2017	26
					BTV-21	云南、广西、广西	牛、羊	1996、2013、2014、2015	17
BTV-24	云南	牛	2012、2013、2015	3

实施例5本发明试剂盒和方法与血清中和试验进行BTV血清型鉴定的比较

发明人从12种血清型的BTV毒株随机选择一个毒株进行血清型的鉴定，比较本发明的试剂盒和方法及血清中和试验在BTV血清型鉴定上的不同。

1.血清中和试验鉴定BTV的血清型

1.1材料

(1)细胞与病毒

BHK-21细胞，BTV-1至BTV-24参考毒株阳性血清，无BTV抗体和细胞毒性的牛血清；待鉴定血清型病毒株1株。

(2)试剂、设备与耗材

MEM培养基、胎牛血清、0.1％萘黑蓝染色液、37℃二氧化碳培养箱、倒置显微镜、微型振荡器、96孔平底细胞培养板、单道微量加样器及滴头、多道加样器及滴头。

1.2实验方法

血清中和试验的方法参照国家标准《蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和抗体检测技术》(GB/T 18089-2008)进行，标准全文以引用的方式并入此处。

1.3实验结果

随机选择一株病毒测定病毒的TCID₅₀，7天后观察细胞病变，经测定该毒株的TCID₅₀为6.25×10⁵/100μL。

将100个TCID₅₀的病毒液与24种血清型的BTV阳性血清进行作用，接种BHK-21细胞；37℃培养10天后使用0.1％萘黑蓝染色液进行细胞的染色，结果显示，细胞对照组、阴性对照组、病毒对照组均成立。1:256倍稀释的BTV-16型阳性血清可中和100个TCID₅₀的病毒，而其余23种BTV血清型的阳性血清对细胞无明显的保护作用，因此将该鉴定毒株判定为BTV-16型。

2.血清RT-PCR方法鉴定BTV的血清型

取病毒液50μL，利用实施例1中的方法提取病毒核酸，分别以实施例1表2中的BTV血清型特异性RT-PCR引物，按照实施例1中的反应条件进行PCR扩增，反应结束取5μL PCR扩增产物进行电泳检测，全部过程仅需2个小时。结果显示仅BTV-16型引物可扩增出大小约1000bp的目的条带，因此将该毒株初步鉴定为BTV-16型。取PCR产物进行测序，结果显示该毒株的Seg-2核酸序列与BTV-16型参考毒株的序列相似度>94％，因此进一步确定该毒株为BTV-16型毒株，进一步，通过分析测序结果，还可获得毒株遗传背景信息。

根据上述结果，结合本发明其他实施例可知，本发明的试剂盒和方法相对于血清中和试验，具有以下显著优势：

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 云南省畜牧兽医科学院

<120> 一种蓝舌病病毒血清型分型的一步法RT-PCR试剂盒和方法

<130> JIA-2020-1-W-023

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgggtacart ggatgatgaa aga 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgggtacart ggatgatgaa aga 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtdcartgg atgattaagg atag 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcaatctccg tctcagttat cc 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcttgcttgg atgattgagg a 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttctacgtc acagggttta act 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

actaatgcga agtggatgaa gtg 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgttacttct agcygtaccg atct 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttacgagra agagcgtgcg a 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aatccacttr tcatagtagt cagg 24

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggttggarga gcaagcggat 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

actccaygaa gttgcaatct cag 23

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcgatatcga cctgatgctg a 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aattttaacg cctgctgctc cca 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tggatgatag grgattcgat gga 23

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgcgtccatt tgttraaata tggt 24

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgagattcra tggatgtgca gc 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttaaacatyg gagcrtatat cca 23

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggtdcartgg atgattaagg atag 24

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcaatctccg tctcagttat cc 22

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcttgcttgg atgattgagg a 21

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tttctacgtc acagggttta act 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

actaatgcga agtggatgaa gtg 23

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgttacttct agcygtaccg atct 24

<210> 25

<211> 1799

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aaagactcga tggatgcgca gcctctgaag gttggattag atgatcgaac gcaaaagata 60

gcgcactctt tacataattg tgtagtaaaa attgactcaa agaaagcgga tacgatgtct 120

tatcatgtcg agccgattga agatccgttg aaaggatgtt tacacacaag agcgatgcta 180

tggaatcatt tagttcgtat tgagatgtcg cacgcggctc aagaaatggc ttacattttg 240

aagcctacat acgatattgt cgtgcacgcc gagaggagag atcggagtca gcccttccag 300

cctggtgatc aaacattaat caattttggt agaggacaga aagttcagat gaatcacagt 360

tcttacgaga agatggtaga ggggttagcg cacttagtga taagaggtaa gacgcctgag 420

ttgatccggg acgaaatagc taagttggat gagatatgta acagatggat acgcagcagg 480

catgatcccg gagaaatcaa ggcttatgaa ttatgtaaga tactatcaac tgttggtcgg 540

aaaatgctgg atcaggagaa agaacctgcg gatgaagcga gcctatcaat tcggtttcag 600

gaggctattg ataataaatt tagacaacat gacccagagc gtttaaagat attcgaacac 660

agaaatcagc gtagagatga agatcgattt tatattttat tgatgattgc cgcttcagat 720

acatttaaca cacgcgtatg gtggtcaaat ccatatccat gtttacgggg aacgttgatg 780

gcttctgaaa cgaagcttgg tgatgtttat tcaatgattc gatcgtggta tgattggagc 840

gttagaccca cgtatactcc ttatgagaaa tcgagagagc aagaaaaata tatatacggt 900

agagttaacc tattcgatta tgttgccgaa cctggaacaa agattataca ttgggaatat 960

aagttaaatc agcagactaa ggacatcact tatgagcaag gtaacccttg cgatttgttc 1020

ccggatgatg atgaggctat cgtaacgaag tttgacgatg tggcgtatgg acagatggtg 1080

agtgatttga taaacggcgg ctgggatcag gagagattta aaatgcataa aatccttaag 1140

tcacaaggaa atgttttaac aatagatttc gaaaaggatg ctaagttaac atctaatgaa 1200

ggagttacga tgcctgaata ttttgataag tggataatag caccgatgtt taacgctaaa 1260

ttacgaatca aacatagtga aatcgcacaa cgacggaatg acgatccaat ggtgaaacgt 1320

acgttatctc ctatcgcttt tgaccctatt gtgttacaga gactaacgtt agcgcgtttc 1380

tatgatatcc gccccgctat aatgggacag gcactctcac gacaacaggg acaatctaca 1440

tatgatgaag agatttcaaa gatagaaggc tatgcagaag tcctgcaacg gcgcggaatc 1500

gtacaaattc ctaagaaacc ttgcccgacc gtcaccgcgc aatacaccct agagcgttac 1560

gcattattcc tgatcaatat cttagagcag cacgtgattc agagtactga tgaagatgta 1620

acatattcgc acccacgagt tgactataaa ttagaaattt atggtgagag catcgtagac 1680

atttcccaga tagttatatt tgtgtttgac tttttatttg aacggagacg aacggttaga 1740

ggagtatacg aatcacgata tatggtgaca cgcataagga acgcgcaagg tcagaaccg 1799

<210> 26

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gtgcaatgga tgattaagga tagcactgat cagcaaccgc taaagatatt aattgatgag 60

aatcatagcc gtgtagttca ttcgcttttt aattgccaag tgaagataga tgcgaagaag 120

gctgatacac tatcttatca tgttgaggcg gttgaggacc aaactaaagc atgtctccat 180

actaaaagtt atatctgtaa tcatctaatg agaatggatt tgtttcatgc ggcgcaagaa 240

atcgcgtatg tgatcaagcc aacataccaa ttaatagttc attcagagag agcatcaacg 300

tcagagaatt tcgatatcgc tcggcagaat gtaatcactc tgaggcgagg gcatagggtg 360

cagatgggag atgaagcata tgcaaaatta atccagcggc tagttcgact tactgtacag 420

ggtaacgttc cgagggctat tcagagcgaa atggagcaac tcgaagcaat tagatccaga 480

tgggcgtcag gtagatatga tcctgtacat gttaattcgc aagagttgtg tcgtatacta 540

tcacgcatcg gaaggatcat gttagatcag gaggcggaac ctgtggatga aggtagtctt 600

tcacttagat ttcagcaagc gttagatgaa aaatttcgtt taaatgattc agagagaaat 660

aaaatattcg agcctaagtc gcatcgaaaa gatgaagata ggttttatgt cttgttagtt 720

atagcagcgt ctgacaccaa caactcaagg atctggtggt caaacccgta cccatgtcta 780

agaggagcat taatcgctgc tgagtcgaag ctgggagatg tttactttac attacgttca 840

tggtatgatt ggagcgttcg tagcaactac gcacctcgcg aaagagagcg tgaaacagag 900

aagtatatct ttagtagggt taatcttttt gattatgatg cgggaccgtc aagtaaaata 960

atacattggg agtaccagtt gtacaagaat gagtggaagg ttacccttga acgaggaaat 1020

gcttgtgatt tgtacccaga cagtgatgag gacgtgatag ttacgaaatt tgatgaggct 1080

aagtacacgg agatggttgg agagataata aatggtgggt ggaatgagga agaattcaaa 1140

atgtataaat tacttcagag cgacggtaat gttctaacta ttgactttga aaaagacgcc 1200

aagctgaaca gcacatcaga agtgatccta cctgattact ataacaagtg gatcattgca 1260

ccgatgttta attctaagtt acggataact gagacggaga ttgctacaaa caaa 1314

<210> 27

<211> 1298

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcttgcttgg atgattgagg attctatgga tgttcaaccc ctcagagttc agtttaagga 60

agaccacagc acggtacaat atgaaatgtt caccgcgaag ttgcatatcg attctaggaa 120

aacagatacc acgacttatc acgtagccgc gattgaatca tcaggggaag gagggtgtaa 180

ccacattcat tccagtctat ggaaccacat ggttcgtaat cacctattcc atgcgataca 240

ggagtcgtgc tacatattta aaccaacata tcagctgatt gttaattccg agcgtttaac 300

accagaggag gaattcagaa ttggcgcgcc tcaattccac acgatacagc gaaatcacag 360

gatgcgatta ggtgataatg cgtatgataa attttcaaaa gggttagtcc aactgcgagt 420

tgatggcaat gtacctaggg ccatacagga cgagatagca gcgttagatg caattagaga 480

taattggata cgcgggaact tcaatcgtac gcatattaaa tcgcttgagc tatgtaagct 540

attatctagt atcggtcgta aaatggttga tatggaagag gagccgaagg atgaaggtag 600

tttatcggtt aaattccagt ttaaactgga tgagaaattc tcacaggatg attcggagag 660

gggtgtgatc ttcgcctcga ggagccatcg gacaaatgag gaacgtttct acgtactatt 720

gatgatagct gcttcggata ctaataatgg acgggtgtgg tggtctaacc cctacccttg 780

tcttagaggc acattgatag catcagaatg taagttgggc gatgtgtatc acacattgcg 840

taataaatac gagtggagtg ttcgtccggg atatagtcca agggatttgg atcgagagcg 900

cgataaatat atattagcgc gaactaacct atttgattta gatgaaagac caggagagaa 960

ggtaatacat tgggaatatg agttaatctc ggaagtatat gaagtcagcg atcataaagg 1020

taatcattgt gatttatttc ctgatgatgt tgaaataacg actaagtttg atgaagttaa 1080

atatagtgag atgatacaat cgattattga tggtggatgg aaacgggaaa catttaaaat 1140

gtataagatc ttaagtgata acggtaatcc tttattgtat gaccttgaga aagatgttaa 1200

attggatagc aaatcacaaa tcgtattccc tccgtattac aataaatgga cgtatgcccc 1260

gatgttcaat gcgagagtta aaccctgtga cgtagaaa 1298

<210> 28

<211> 1321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

actaatgcga agtggatgaa gtgggcgatt gacgatcgga tggatataca accacttaaa 60

gtgacgttag atcagcatta tgccgtaaac catcaactgt ttaactgtgt cgtaaaggtt 120

aagacggcaa acgcagatac gatatattat gatctccatc cggtggaaag taaggcgaaa 180

aaatgtaatc acgcgaacct ggagatgatg cggagtttga caatgataga attgtttcac 240

gttttgcaag gtgcggcata cagcttgaag tcaaattatg acttgatagc aaattcggaa 300

agagaaagcc tagaagaaag ctacccagtt gggtctgaga agtgggtgca cctgacgcga 360

cggactaaga tcgggaagag tggactatcc tataccaggt ttatctctag tatggtgcag 420

gtattggtga gaggaaagat ccctgatgag ataagagagg agattgcgca attgaataga 480

attcgaacgg aatggatagg tgcagcttac gatcggagta gaattagatc gttggaactg 540

tgtaacattc tatccgccat aggacgtaag atgttggata cgcaggaaga acctaaagat 600

gaaatggact tatcaacacg ctttcaattc caacttgatg aaaagtttaa tactgcggac 660

tccgagcatg tgaacatatt taggacagga ggagcggcaa caaatgaggg cagattctat 720

gctcttatcg ctattgcggc aactgatacg caaaagggca gagtttggag aacgaatcct 780

tacccgtgtc ttcgcggtgc aataatcgct tctgagtgtg agttgggtga cgtatattac 840

acattacgtc atgtatatag atggagctta cgacctgaat atggccaacg tgataggcag 900

ctcgaggata ataagtatgt gtttagtcgc attaaccttt ttgattcaaa tttagcggtg 960

ggtgatcaga tcgtccattg gagatatgaa ttggacgaac cgacagagac aaactacgat 1020

aatggctaca tatgtgtacc tcaggaaaaa gacgatgaac tgttgtgtaa agtggatgag 1080

gagaggtata aggagatgtt ggatagaatg attcaaggtg ggtgggatca agagcggttt 1140

aaacttcata atatacttac agcccctaac ctcttgacga tagattttga gaaggacgcc 1200

tttctgaatt caagatcgga gttaatactg cctgattatt tcgataaatg gattaactct 1260

ccaatgttta gcgcacgctt gagaataact cacggagaga tcggtacagc tagaagtaac 1320

g 1321

<210> 29

<211> 1294

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cttacgagaa aaagtttcaa cacaaacagt ggcgttacat ttcatacgga tcacaaatgg 60

atggaatgga tgctatccga tgcaatggat gttcagccac tgcgaatcga tttagcagcg 120

cagagcgagt atgcaaaatg tgacttattt aattcttcgg tctatgtcag gaaaaaatat 180

gttgatgcga tttcatatag atacatatcg gtggaagatg attctaaggg gtgcaatcat 240

acgaggattt atagcgtgaa tcacttgata aattgtggat tgtataacgt ggcgcaagag 300

tgtgcatatg cgtttaagga tacaaataca ttaatagtta actcacaaag agaaaacact 360

agtgagccgt tccagcctgg aaatccaagg attggaagtc tggggaggag ggcgagggtt 420

gacatggctg atcctgggta tccgcttttc cgcgcagggt tacttcaaat agtcgttaat 480

ggcaccatac cagctgatat acgtagtgag atggatcgcc tgaatcaaat acgtgaggca 540

tggaaacgtg ataaaaatac aagagaagtt agagcgctcg atttatgtat actgctatca 600

aagattggtc gaattaagat gaatatggaa gaagaaccta aggatgaggg agccatgtcg 660

ttaagatttc aggggaagat tgacgcgatg tttttctcgg aaaatacgga gaaaacgaat 720

attatgcgag atagtagtgg tagaactgat gatgaaagat tttacgcctt attgctgatt 780

tgcgctacgg atgcgttctc acgacgtata tggcgcacta acccgtatcc atgtttacga 840

ggcaccttaa tcgcagcaga atgtgtattg ggagatccat ataaaacgtt acgccgtaag 900

tttgattgga gtgtacgcca tgcaggagat aagatgctgg aggggtcctc gtatgttttt 960

acaaggataa acttattcga tacggataag gcgccaggct cacgtgtaat acactggata 1020

caggagacac ttcccgtcat aaaaacaacc tgggctgagg gatgtccttt agctgatgaa 1080

gcgccagatg atcatttaca ttgcaaaata gatcacgcac aatatagaga tctggtgtca 1140

agagttataa atggaggttg ggatcaagag aactttaaga tacataaatt attcgttgaa 1200

cgaggcaata ttttcttaat ggattttgaa aaggacgcaa agataactac acagtctgag 1260

gtggagtatc catactatta tgatacatgg gtct 1294

<210> 30

<211> 1290

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cctcgtattt tagatgtgtc catagcagca tatgatacga ggaagggata ttggaaatat 60

aaaggcatag agaagatgac aaatcagacc tggttgaagt gggcaatcaa ggattttatg 120

gatgtgcagc cactgaaggt ggatctagct gatcttgaag gcaaagtgag gtatgatatg 180

tttaattgtt ctgctcgaat agatgctaaa aaggccgagg caatttatta tggttgggct 240

gctcaggagg tagtgagcaa aggttgtaac catgcaaaga gcgagatatt tcagcatgtt 300

gtaagatgcg agctgttgaa ttgttcgcag gaaagcgcgt acattctaaa gccgactcaa 360

aaaatagaac ccctcgctga gaagaatgat ctgggtgaga ggctcgggcc gggctctaat 420

aatttaatta atatgcgacg tggggatacg tttaggatgg ggacagatca atacaatcgc 480

atgttgcagg gatggtaccg ggtgaaggtg aaaggtcaaa ttccaaatat ggttagagaa 540

gagatggctg agctagtaaa gataaaagat agatggaaag ttgccaaaaa ccccagagaa 600

attaaatctc ttgagctatg taaattgctc tccgcaatag gtaggaaaat gtataatatg 660

tatgaggagc caaaagatga agaagcggtt tcattaaggt ttcagtggaa tttggatgag 720

attttcaaaa ctgataatag agagcacgtt aacattgccg tcaataagag tgggagaaca 780

gatgatgagc gattctttgc gcttatcatg atagctgcaa ccgatacgaa tcgcggaagg 840

atttggtggt cgaatatgtt tccgtgctta cgaggtgctt taattgcgag cgaaactcaa 900

ttcggcgatg tatataaaat gctaagggtg cggttcgaat ggagtgtgcg gaatgaatat 960

agccctcagg ccgacgttgc gagacagaat gagaattacg tgtacgcacg cgtcaaccta 1020

tttgatctag tcgctgatcc ggcaacatct gtaatccact gggaatataa attggatgag 1080

cccttaaaaa ctagttactc agtaggccat caatgtgatg aatatcctga tgaatacgaa 1140

ttgatttgct cctttgatga aactaaatat agtgaaatgg tccaacgcat tatagagggt 1200

ggatgggatc ataaaaactt taagcattat aagatattga aagaggcttc aaatgtgctc 1260

acaatcgatt ttgagaaaga tgcgaagttg 1290

<210> 31

<211> 1209

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

atgagggtaa tcaactaccg cgagcgttag atatcgcatt gagtgcgcgt cttacgagaa 60

agagcgtgcg aaataataat ggcttggact tccttactga tgataaatgg atggagtgga 120

tgctatctga tgctatggac gttcagccac taaaaattga tttgaatgcg cgaaatgggt 180

ttgttaagtg cgataccttc aactcatcca tatatataag aaggaaatac gctgatgcga 240

tcgcgtaccg atacacgtca ttagaagacg aatcaaaagg ttgcaaccac acgagagtgt 300

atatggttaa ccatctaata aataatggat tatataacgc tgcgcaagag tgtgcttacg 360

ctttaaaaga tacgtatgtt ttacgggtac actcacaaag agaaaggatc gatgaaccat 420

tcgaggcggg taggccgagg ataggtagtt tggggaggaa cgcgagaata gacatgaacg 480

aaccagggta ttcgcttttt aaaggtggga tgctacagat tacggtgagt ggtgaggtgc 540

caagcgatat acgcgttgaa atggaacggt taaaccaaat ccgtgccgtt tggatacgtg 600

ataagtcttc aagggaagtg agggccatgg agctatgtac gctattatca aagattggac 660

gtgtaaaatg gaatgcagag gaagaaccca aggatgaagg tgctatgtca ttgaggtttc 720

agaacaaaat agattcaatg tttttctctg agaatacaga aagaaccaac attatgcaga 780

atgcaagtgg tcgcacagat gaggagaggt tttatgcctt gttgttgata tgcgcgacgg 840

acgcgtactc acgtcgcata tggaggtcga atccatatcc ctgtttgcgg ggcacgttga 900

ttgcggcgga atgtgtctta ggtgacccgt atagaacttt gcgacggaaa tttaattgga 960

gtgtacgcca ttcggcggac aaaacgctag aaaataatgc gtatgtcttt gcaagaataa 1020

acctgtttga tacagaaaag acgccaggca cgcggatcat acattggacg caagagctaa 1080

ctatggagtc acagacaact tgggatgaag gatacccatt gaaagatgaa gcgcccgatg 1140

atgagatgca ttgtaagatt gatacaagca aatataaaga gatggtgacg cgggtgatta 1200

acggtggat 1209

<210> 32

<211> 1247

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tatagatgtg tgggttaaga agcggttgga ggagcaagcg gatttacaag ccgtatatca 60

tgatgttgat ttaggacgtg gtaagttaaa gtttaaaatg ctaacggggt tggtgaaact 120

agattcgaat tatgcggaaa cagttggcta cgattatgca ccggtgccga aggtgggatg 180

cgatcatggg aatgtcgatt ttctatatga cttcatttta tcgggtagcc tccaggtatc 240

gaagaccgcg ggatacattt tgaagcaaac gtatcgatta actgtgcacg ctgaagctaa 300

cgcagaaaca cgagatcaac ttatcgtaaa tggggtgtat accgagggcg ttacgcgcgg 360

tgaggagata agggatatga agaaaaagtg ttattcaaga ttccgtgatg gatggattcg 420

agctactata cagcctaaaa tagtcgagga gttgaggcag agtaaggagg tgctagacag 480

aatatcgagt aaatggtatg aagagttgac gacgccagac gttgttgaaa tatgtaaaat 540

cgtgtcatca attggacgcc agatgtggaa tagtgaggaa ttgccggttg atgatgcaat 600

gagatcaaaa gtttttcagg aagagttgcg gctgttattc cgagttggga atagcgaata 660

tgatacaatt caggctatcc gaagtggaca aacgcctttg aagaaattct atgccttgtt 720

agcaattgcc gcgactgaca gctatcgttg gcgtatatgg tggagtaatc cgtacccctg 780

cttacgagga acgatcattg cgtgtgagat ggaactaggg gacgtctaca aaactttaag 840

atcaactttc cattggagct tacgtcctac atatgccacc cggaaggaga ttgatcgcga 900

acgaagagcc tatccatatc agagaataaa cctctttgaa tcgcgtttag atcctggaac 960

ccgcataatc aattggttgg tggtaaggga gccattagct gaaccagacg tcgagtccgg 1020

tcgtgtgtgt gtgacgtcga cagaatctga atacattcta aaggtggatg acacgaagta 1080

tagagaaatg attggtcaga taattgagcg ggggtgggag aaagaacatt tgaaactgga 1140

aaagattgtc caggatgagg gtaacgtgtt tcaaatggaa tttgaaaaag atgcgagctt 1200

agatgaaagg agccatctag ttatgccgta ttattatgat aaagaga 1247

<210> 33

<211> 1247

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tggcgacgta acgaagtggg ttacaaaccg cacggatgag ttccacgatt tacagcccat 60

ttatcattca accgatgaaa ggatcagcaa gattaaattc acttcgctac tgggaagcat 120

cgccaccgaa tcaaattatg cggaaagtat gtcttatcat tatgtaggaa ttgagagaag 180

tgtctgcgat cattcgcggt ggcatcgatt tttcccaatg ttattatctg atacgattaa 240

tctaagtaag gaagtaggct atatattaaa ggagacctat aaaattaaag caattggaga 300

ggcgcgagat ggacagaggc aggagctgca tgtggatgcg ccttacacgc ccggcataag 360

gaggaacgaa aagataagcg atatgaagca gcccgtatat aagaggtttg ttgagggtta 420

tatacgctgc caaattgagc caaatgttcc agaaagactt accgaattga agaaccagct 480

cgatggtata agcaccgcat ggtatggtgg acagacgccc attgtagccg atgaaatctg 540

taggataaca tcacagatag gacgtatgat gtggaatacg gaggaagaac ctgttgatga 600

aactatgaga tcaagggcat tccaggagag catcagattg atgtttcgtg ccgagaatag 660

tgaatacagc aatatacagg cggttggaag tggtaggacg caaaggcaaa agttttacgc 720

tttactgatg atagcggcta ccgatagttt taggtggcgt atatggtgga acaacccgta 780

cccgtgtttg cgtggctgtt tgatcgcttg cgaaatggag ttgggggatg tttacaagag 840

cctgagatca atttataagt ggactctgcg tccgagctat tcgccgcagc gtgagatcga 900

tagacaactt aacgttttcc catatcagaa aataaatctg tttgactaca ctggtgtacc 960

tggtactgag ataatacatt ggcgcatcgc tcatagacca gtaccaaaag aagtagatta 1020

tgagcacggc tttctgtgtc cggagagtgg tgatacggac atcgtgatgg cgattgatga 1080

cgatctatat agcgctttta aacgtaaggt tatagaacga gggtgggagc agcaggcgtt 1140

aaaattagac gaattggtcc tatcggagaa caatattttt aagatggaat ttgaaaagga 1200

tgcacacctc gacaaccgca atcatctggt tatgcctcca tactatg 1247

<210> 34

<211> 1305

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gttagaatgg atgataggag attcgatgga cgtgcaacct ctaagagtcc agctgaaaga 60

agatcacagt acaatacaat atgggatgtt ctcaaacacg ttacacatcg attcgaggaa 120

agcggatacc acgtcatatc atacgattgc tgtagaatca aaaggggaac gtgggtgctg 180

tcacgttcac acggcaattt ggaatcacat ggtacgtaat cacttgttta acgccgtcca 240

agaggcgtgc tacgtgttta aaccgacgta tgatttaata gtgattggtg aaaagcagaa 300

tcgtgaggat gaatttagga ttggcgaaca caatttttat accataacac ggaatcacca 360

catgcgttta ggcgataacg catataatca attcatgaag ggtttggttc agttgcgcgt 420

ggcgggagtg acaccgaacg taatacgaga ggaaatggcc gctttagacg caataaggga 480

tacttggata ggagggaact tcgagcgaac acacattaaa tctcttgaaa tatgtaagtt 540

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cctatcagtt aaattccaat ttaaactcga cgacaaattt tcaacaaccg atccggaaag 660

aaacgtcatc tttacacata aaacacaccg tacgaatcaa gatcgtttct atgtgttgct 720

aatgattgcg gcgtcggaca caaataacgg tagagtatgg tggtcaaacc cttatccatg 780

tttacgtggc gcgttgatcg cgtctgaatg caagcttggt gacgtgtacc ataaattacg 840

ggcgtggtat gagtggagcg taaggcctga gtataaaccg cgagatttgg agcgagaaca 900

agaaaaatac atcgttgggc gcgttaacct ctttgactta gaaggggagc ctgcaacgaa 960

ggtgtttcac tgggagtacg aattgattaa taaagtgtat cagataacga atcatacggg 1020

gaatcattgc gatttgtatc ctgacgatgt ggagatcacg gccaaatttg atgaggagag 1080

atacggagag atgattcaaa cgataattaa cgaaggatgg aagcacggtg actttaagat 1140

gtttaagatt ctgaaggaag agggtaaccc cttactatat gatctagaaa aggacattag 1200

gttagatagt agatcacaag ttatatttcc accatatttt aacaaatgga cgcacgcacc 1260

aatgtttaat gcaaaagtga aaccatgcga agtcgagtta gcaca 1305

<210> 35

<211> 1298

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

atgatccgag attcaatgga tgtgcagccc ttaaaagtta gtctagagct atcatcaaag 60

attaaacata gtttgtttag ttctaatgtg tatgtgtcag ttaagaaagc ggacaccata 120

tcgtatcata tagaggcaaa ggaggttgaa acgaaggcgt gcgaccatgc acgagtggcg 180

atgtggaata atcttgtaag acatgagatg atacatagcg cgcaggagcc agcatacatc 240

ttgaaaccta cgctcgacat aattgtgcac tcagagaggg cgtcgacaga tgtcccattc 300

gagctagttg gtcagcacta tgtttcgatc gggaaaaacc atcgaatagt tttgggagat 360

gatgcttatc gaaagacatt agatggatta acgaaattac gcgtacaagg acgaatcccc 420

gaattaatac gaaatgagat acagcaactt caccaaataa gggatgcgtg gatagctgac 480

tcatacaacc aacgacacat acgatcgtta gaattatgca gaatcttatc gcatatagga 540

agaaaaatgg tgcatataga agaggagcct aagaatgaga gtgatttatc agttaaattc 600

cagtttaagt tggacgaaaa atttagagtt aatgatgatg aacgtaatgt aatattcaca 660

tcgaaaggcc aaaggaatga ccaacaacgg ttcttcgtat tgattatgat cgcagcgtca 720

gatacttaca acagccgcat ttggtggacg aatccgtacc catgtttgcg cggcgcttta 780

atcgcttctg aaacttcgct tggagacgtg tattggacat taagacattt ctatgattgg 840

agcgttagac cagcatactc gccgaggcaa aaagaacgag aagacgataa gtacttatat 900

ggtagggtga atctatttga ccttgatgcc gatccaggca cacaaattat acactgggag 960

tataagccca ttataagtac ggtaaagact acgtatgaga aggggaatat gtgtgattta 1020

tttcctgatg tagatggtat tacgactaag ttcaataaga cggcttatac tgatatgatt 1080

agcgagttgc taaatggcgg ctggaacaca cgtgaattca aaatgcacaa gatacttgaa 1140

agcgtgggaa acgttctgac gatcgatttc gagaaagaca caaagcttaa ctcaagatct 1200

gaattctcat taccgtacta ctataataag tggatatatg ctccaatgtt taacgccaaa 1260

ttaaggataa cgcaaacgga aatcgcccag ggtagagc 1298

<210> 36

<211> 1321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

actaatgcca agtggatgaa atgggcgatt gatgacagaa tggacattca acctttgaag 60

gtgacgttgg atgaccatta ttctgtgaat caccagctat tcaattgtgt agtaaaagca 120

aaaccggcta acgccgatac gatttactat gattattatc cactagaaag caagatgaaa 180

aaatgtaacc acacgaattt agacatgttg cgcagtttga caactatgga gatgtatcat 240

atattgcaag gagcggctta cggtttgaaa tcgacatatg agttaaaggc tcacgcggag 300

cgggagaata cgggtgagag ttatccgata ggggaaagac tgttgcaaat acctagagga 360

acaaagatag ggagtagagg agagccttat aataaatttg tcgctggatt ggtaaaagta 420

accataaaag gtaaagttcc tgctgaaatc agggaagaga tgaatcaact aaatcgaatc 480

aaagaggagt ggaagagtgc agcacacgac agaagcagaa tacgcgcttt agaactatgt 540

aagatcctat caacgattgg ccgaaaaatg ctggacgcga aggaagagcc gaaggacgag 600

atggatttat ctacacgatt tcaatttaaa ctagatgaga agtttaccaa aactgattca 660

gaacatataa acatattcag agcaggtgga cccgctacag atgatggtag attctacgct 720

ttaatcgcga ttgcggcaac tgatacgcaa aaaggtaggg tgtggaggat gaatccgtat 780

ccgtgtttac gcggcgcaat aatagcggcc gaatgcgaat taggtgatgt gtatttcacg 840

ctgcgtcagg tgtacagttg gagcttgcgg ccagagtatg gacagaagga aaaaccattg 900

gaagtgaata agtatgtatt taatcggatt aacctgtttg actcagatct gacagtagga 960

gatcaaattg tacattggcg ctatgagtta taccccccgg tcgagacgac ttatgatgat 1020

gggtatctat gtggatcaga taaagaggat gacgagctat tatgtgaagt tgacgaagag 1080

aaatataaga agatgtttga gggtatgatc gaaggcggtt gggaccaaga gagatttaaa 1140

cttcatagca ttttaactga cccgaatcta ttaacgatag attttgaaaa ggatgcgtat 1200

ctcaattcaa ggtcggagtt ggtgtttcct gaatatttcg ataagtggat taattctcct 1260

atgttcaacg cgaaattacg attagcccat ggggaaatcg caacgcgcag agcaaatgat 1320

c 1321

Claims

1.一种蓝舌病病毒血清型鉴定的一步法RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括用于特异性扩增12种血清型的BTV毒株Seg-2基因序列的引物对组合，其中，所述12种血清型的BTV毒株分别为BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24。

2.根据权利要求1所述的一步法RT-PCR试剂盒，其特征在于，

用于特异性扩增BTV-1型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 1和SEQID No. 2所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-2型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 3和SEQID No. 4所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-3型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 5和SEQID No. 6所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-4型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 7和SEQID No. 8所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-5型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 9和SEQID No. 10所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-7型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 11和SEQID No. 12所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-9型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 13和SEQID No. 14所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-12型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 15和SEQID No. 16所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-15型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 17和SEQID No. 18所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-16型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 19和SEQID No. 20所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-21型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 21和SEQID No. 22所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增BTV-24型毒株Seg-2基因序列的引物对分别具有SEQ ID No. 23和SEQID No. 24所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的一步法RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述一步法RT-PCR试剂盒包括RT-PCR缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂。

4.根据权利要求1所述的一步法RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述一步法RT-PCR试剂盒进一步包括病毒RNA提取试剂。

5.根据权利要求1所述的一步法RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括12种BTV血清型毒株的核酸对照样本。

6.根据权利要求5所述的一步法RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的12种血清型BTV为BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21和BTV-24。

7.一种BTV血清型鉴定的一步法RT-PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，获取待检测BTV的核酸；

S2，对步骤S1中获取的核酸样本进行热变性处理；

S3，利用权利要求2所述的一步法RT-PCR试剂盒，对步骤S2中经变性处理的核酸样本进行一步法RT-PCR；

S4，对步骤S3的RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序，根据测序结果确认待检测BTV的血清型与基因节段2序列特征。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S3中一步法RT-PCR反应体系为：5 μL核酸模板，12.5 μL one step RT-PCR Buffer，1 μL PrimeScript one step Enzyme Mix，浓度为20 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，加入RNase Free ddH₂O补齐至25 μL。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S3中一步法RT-PCR反应程序为：50 ℃30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 15 s，30个循环；72℃ 10min。