CN113151597A - 用于检测鹅嵌杯病毒的rt-pcr引物序列、试剂盒及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明中用于检测鹅嵌杯病毒的RT‑PCR引物序列，上游引物的序列如SEQ ID NO：1所述，下游引物的序列如SEQ ID NO：2所述。本发明还提供用于检测鹅嵌杯病毒的RT‑PC试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的RT‑PCR引物序列。本发明还提供一种用于检测鹅嵌杯病毒的方法，包括：S1、提取待检测样品的基因组RNA；S2、采用所述RT‑PCR引物序列，进行扩增RT‑PCR，扩增产物电泳检测后进行紫外分析仪器中观察、拍照及记录，若扩增产物存在270bp的特异性条带，则说明该样品存在鹅嵌杯病毒。本方案鹅嵌杯病毒的RT‑PCR引物特异性高，灵敏度高，最低可检测2.0×10²拷贝/μL。

Description

用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PCR引物序列、试剂盒及其方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PCR引物序列、试剂盒及其方法。

背景技术

鹅嵌杯病毒(Goose calicivirus，GCV)是引起鹅肠道疾病的重要病原体之一。患病雏鹅在临床上表现为腹泻、生长阻滞、肠炎等为特征的急性或慢性肠道性疾病、发育障碍与矮小综合征、营养不良综合征。该病毒为RNA病毒且具有囊膜，属于嵌杯病毒科Sanovirus属的成员。近年来，这种病毒在我国湖北、江西及福建等地引起的雏鹅病毒性肠炎与传染性生长阻滞综合征已呈明显上升趋势，往往导致雏鹅机体免疫混乱、免疫力下降，进而引起多种条件性病原的二次感染。

到目前为止，嵌杯病毒除兔出血热病毒与猫杯状病毒可以分别在RK-13兔肾上皮细胞、F81猫肾传代细胞中增殖传代外，其余成员的细胞培养一直不很成功，无法在实验室完成病毒的分离鉴定，大大限制了对其进行深入研究，因此病原诊断方法相对较少。已建立的诊断方法有电镜法、宏基因组测序法、随机引物扩增法等。这些试验都存在缺点，就是步骤复杂，灵敏度偏低，检测时间具有明显的滞后性。

RT-PCR(reverse transcription-Polymerase Chain Reaction，中文全称为反转录聚合酶链式反应)这种先进的分子生物学检测手段，不仅可以快速准确的检测病原，而且其检测方法特异性强、敏感性高。RT-PCR的基本原理为：在引物的作用下，先对RNA样品进行cDNA合成，再进行PCR扩增。另外，检测的临床样品来源比较广泛，包含组织匀浆、泄殖腔拭子或新鲜粪便拭子等。PCR扩增或者RT-PCR扩增的首要条件是有一对已知引物。引物的设计涉及到长度、特异性、G+C含量、上下游引物互补性、引物3’端匹配碱基数等情况。目前国内外还没有针对鹅嵌杯病毒检测的RT-PCR引物序列、试剂盒及其方法。

综上所述，现在亟需研发出一种用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PCR引物序列、试剂盒及其方法，以实现低成本、快速、准确地检测家禽养殖时的鹅嵌杯病毒，为有效控制家禽养殖业的病毒蔓延以及及时治疗提供检测依据，促进养鹅业的健康发展，填补国内外相关领域空白。

发明内容：

本发明所要解决的首要技术问题是提供一种用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PCR引物序列，该组引物灵敏度好、特异性高，利用该组引物能对用于检测鹅嵌杯病毒。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PCR试剂盒。该试剂盒内的引物灵敏度好、特异性高，利用该组引物能对雏鹅的鹅嵌杯病毒进行早期预警和防治。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PCR方法，以实现低成本、快速、准确地检测家禽养殖时的鹅嵌杯病毒，为有效控制家禽养殖业的病毒蔓延以及及时治疗提供检测依据，填补国内外相关领域空白。

为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的一种含用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PCR引物序列，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述。

本发明还提供一种用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PC试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的RT-PCR引物序列。

本发明还提供一种用于检测鹅嵌杯病毒的方法，具体包括以下步骤：

S1、提取待检测的鹅组织样品，研磨后反复冻融，离心后取上清并提取基因组RNA；

S2、采用如权利要求1中所述的RT-PCR引物序列，使用One-Step RT-PCR方法进行扩增，样品的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后采用溴化乙锭染色，并于紫外分析仪器中观察、拍照及记录，若样品的扩增产物存在270bp的特异性条带，则说明该样品存在鹅嵌杯病毒。

本实施例的改进例中，所述One-Step RT-PCR方法的反应条件为：45℃反转录30min；94℃变性5min；然后进入94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。

优选的，所述One-Step RT-PCR方法的反应体系为：2×ES One-Step ReactionMix 12.5μL，上游引物和下游引物的浓度均为20μmol/L，含量均为0.5μ，RNA模板2μL，

One-Step Enzyme Mix 0.5μL，加RNase-Free ddH2O补足至25μL。

优选的，所述S2中的琼脂糖凝胶电泳的浓度为1.5％，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压不超过5V/cm，电泳时间40-60min。

优选的，所述鹅嵌杯病毒的最低检测限为2.0×10²拷贝/μL。

本发明的技术方案至少具有以下有益效果：

本发明根据GenBank登录的所有鹅嵌杯病毒全基因序列，设计引物，获得了特异性好、敏感性高的RT-PCR引物序列；RT-PCR产物经测序验证后序列正确且不存在交叉反应，证明该引物具有良好的特异性，检测结果具有可靠性。采用本发明的引物序列和方法测试鹅嵌杯病毒阳性样品，在270bp处扩增出单一目的条带。

本发明的用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PCR方法可用于鹅嵌杯病毒的分子流行病学检测，在国内外首先建立鹅嵌杯病毒One-Step RT-PCR方法，该方法灵敏度高，最低可检测2.0×10³拷贝/μL，特异性强。One-Step RT-PCR方法在处理样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和PCR扩增之间不需要打开管盖，可以得到更高的灵敏度。本发明的方法为雏鹅病毒性肠炎与传染性生长阻滞综合征的早期预防控制奠定技术基础。

附图说明

图1为本发明试验例2中鹅嵌杯病毒的RT-PCR引物序列的退火温度筛选试验结果，其中各个泳道的标号含义为：M：DNA marker 2000bp ladder、1：46℃、2：48℃、3：50℃、4：52℃、5：54℃、6：56℃、7：58℃、8：RNase-Free ddH₂O对照；

图2本发明试验例3中鹅嵌杯病毒的RT-PCR引物序列的特异性检测结果，其中各个泳道的标号含义为：M：DNA marker 2000bp ladder、1：GCV、2：GoAstV、3：GPMV、4：MDRV、5：DHAV-1、6：DTMUV、7：RNase-Free ddH₂O对照；

图3是本发明试验例4中鹅嵌杯病毒的RT-PCR引物序列的敏感性检测结果，其中各个泳道的标号含义为：M：DNA marker 2000bp ladder、1：2.0×10⁶拷贝/μL、2：2.0×10⁵拷贝/μL、3：2.0×10⁴拷贝/μL、4：2.0×10³拷贝/μL、5：2.0×10²拷贝/μL、6：2.0×10¹拷贝/μL、7：2.0×10⁰拷贝/μL、8：RNase-Free ddH₂O对照；

图4是试验例4中采用鹅嵌杯病毒的RT-PCR方法检测份临床样品22份的电泳图，其中各个泳道的标号含义为：M：DNA marker 2000bp ladder、泳道P：阳性对照、N：阴性对照泳道；泳道1、2、3、4、5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21为阳性结果；泳道6、7、22为阴性结果。

具体实施方式

以下提供本发明的优选实施例，以助于进一步理解本发明。本领域技术人员应了解到,本发明实施例的说明仅是示例性的，并不是为了限制本发明的方案。

实施例1

本实施例1提供了含用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PCR引物序列，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述。

其中上游引物命名为GCV-F，DNA序列为5’-TGCMTYTGGGAYGARTTYGACAC-3’；

下游引物命名为GCV-R，DNA序列为5’-MACRCCWGGRTTCTYCTT-3’。

利用本发明的RT-PCR引物序列可检测鹅嵌杯病毒的相应基因，尤其适用于基层科研实验室的检测。该试剂盒内的引物灵敏度好、特异性高，利用该组引物能对雏鹅的鹅嵌杯病毒进行早期预警和防治。

本实施例的含用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PCR引物序列的研发思路如下：参考GenBank中的鹅嵌杯病毒基因组核苷酸序列，利用Lasergene v7.1 DNAStar软件进行同源性分析比较，利用Oligo 6.0软件，设计鹅嵌杯病毒特异性RT-PCR引物，采用BLAST工具进行检索，通过One-step RT-PCR验证其特异性。用于测试的鹅嵌杯病毒阳性样品中，在270bp处扩增出单一目的条带。取该条带的RT-PCR产物，进行测序，验证后序列正确且不存在交叉反应，证明该引物对具有良好的特异性，检测结果具有可靠性。

实施例2

本实施例2提供一种用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PC试剂盒，该试剂盒包含实施例1所述的一组RT-PCR引物序列。

实施例3

本实施例3提供一种用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PC方法，具体包括以下步骤：

S1、提取待检测的鹅组织样品，研磨后反复冻融，离心后取上清并提取基因组RNA；

S2、采用如权利要求1中所述的RT-PCR引物序列，使用One-Step RT-PCR方法进行扩增，样品的扩增产物经浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测后采用溴化乙锭染色，并于紫外分析仪器中观察、拍照及记录，若样品的扩增产物存在270bp的特异性条带，则说明该样品存在鹅嵌杯病毒；所述One-Step RT-PCR方法的反应条件为：45℃反转录30min；94℃变性5min；然后进入94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min；所述One-Step RT-PCR方法的反应体系为：2×ES One-Step Reaction Mix 12.5μL，上游引物和下游引物(20μmol/L)各为0.5μL，RNA模板2μL，

One-Step Enzyme Mix0.5μL，加RNase-Free ddH2O补足至25μL，所述S2中的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压不超过5V/cm，电泳时间40-60min。

以下通过试验例1至试验例6介绍本申请的用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PCR引物序列、试剂盒以及方法的具体研发思路及试验验证过程。

材料来源

鹅星状病毒(GoAstV)、鹅副粘病毒(GPMV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHAV-1)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)等水禽易感RNA病毒核酸以及GCV阳性样品均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物病毒室鉴定并保存。

仪器与试剂

T100型梯度PCR仪购自Bio-Rad伯乐公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度计购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；pMD18-T载体、DL2000 Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司；

RNA Kit与

One-Step RT-PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；质粒快速提取试剂盒E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit购自Omega公司。试验1至试验例6中未说明的步骤及试剂均为前述试剂盒中公开的说明操作，为避免赘述，在此不进行一一罗列。

试验例1建立鹅嵌杯病毒的One-Step RT-PCR检测方法

1.引物设计和合成

引物的特异性是本实验所建立方法的最重要因素。根据GenBank登录所有鹅嵌杯病毒全基因序列，通过同源性比较分析，选择保守序列区作为扩增区域，利用Oligo 7.0引物设计软件和BLAST软件程序设计出特异性扩增引物，其中引物的序列分别为：

上游引物及其序列为：

GCV-F(SEQ ID NO:1)：5’-TGCMTYTGGGAYGARTTYGACAC-3’；

下游引物及其序列为：

GCV-R(SEQ ID NO:2)：5’-MACRCCWGGRTTCTYCTT-3’。

2.待测阳性样品RNA的提取

取含有鹅嵌杯病毒的组织阳性样品，首先进行研磨，反复冻融，离心后取上清。再使用

RNA Kit试剂盒进行RNA基因组提取。

3.鹅嵌杯病毒特异性引物One-step RT-PCR检测验证

利用步骤3中从鹅嵌杯病毒阳性样品提取的鹅嵌杯病毒RNA为模板，以GCV-F和GCV-R为引物对，通过

One-Step RT-PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)对鹅嵌杯病毒进行检测验证；反应体系为：2×ES One-Step Reaction Mix 12.5μL，上、下游引物(20μmol/L)各0.5μL，RNA模板2μL，

One-Step Enzyme Mix 0.5μL，加RNase-Free ddH₂O补足至25μL。最佳反应条件为：45℃反转录30min；94℃变性5min；然后进入94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。

4.结果判定

采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法对步骤3中的反应产物进行结果判定：将RT-PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。同时设置阳性对照、阴性对照以及DNA Marker，如果阳性对照中有270bp的特异性条带、阴性对照中没有该条带则说明阳性对照和阴性对照成立。如果样品的扩增产物中也含有270bp的特异性条带，则说明该样品中存在鹅嵌杯病毒；如果样品没有扩增出270bp的特异性条带，则说明该样品不含有牛鹅嵌杯病毒。

5.特异性检测

以提取的GCV阳性样品和对照病毒基因组RNA进行One-Step RT-PCR扩增，检验RT-PCR方法的特异性。

6.敏感性检测

提取GCV基因组RNA后，用分光光度计(NanoDrop 2000C，Thermo)进行定量，并通过(拷贝/μL＝(6.02×10²³)×(ng/μL×10^-9)/(目的片段碱基数×660))公式计算出每微升的拷贝数。测定起始浓度后，用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释，使其分别相当于含有2.0×10⁶拷贝/μL、2.0×10⁵拷贝/μL、2.0×10⁴拷贝/μL、2.0×10³拷贝/μL、2.0×10²拷贝/μL、2.0×10¹拷贝/μL、2.0×10⁰拷贝/μL的样品RNA，采用优化的反应条件分别进行One-StepRT-PCR，测定其敏感性。

7.临床样品检测

将临床采集的60份组织样品分别研磨，反复冻融，使用

RNA Kit(北京全式金生物技术有限公司)提取基因组RNA，使用建立的One-Step RT-PCR方法进行扩增。

试验例2用于检测鹅嵌杯病毒One-Step RT-PCR方法的退火温度试验

分别对退火温度46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃进行One-Step RT-PCR扩增，确定最佳的退火温度。结果显示，所设计的引物对退火温度在退火温度为50℃、52℃、的反应程序下，能很好的扩增出单一的目的条带，且52℃的扩增效果好于50℃(参见附图1的电泳图所示)。因此，所使用的One-Step RT-PC反应程序为：45℃30min；94℃，5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸5min。

试验例3检测测鹅嵌杯病毒One-Step RT-PCR方法的特异性检测结果

以提取的GCV阳性样品和对照水禽易感RNA病毒(GoAstV、GPMV、MDRV、DHAV-1、DTMUV)基因组RNA为模板，使用优化好的反应体系和反应程序进行One-Step RT-PCR扩增，检测本发明检测方法的特异性，结果显示，只有鹅嵌杯病毒样品扩增出了270bp的目的片段条带，为阳性结果，5株对照病毒株反应管和水对照反应管均无扩增情况出现，为阴性结果(参见附图2的电泳图所示)，表明本方法具有很好的特异性。

试验例4检测鹅嵌杯病毒One-Step RT-PCR方法的的敏感性检测结果

提取GCV阳性样品RNA，测定起始浓度为2.0×10⁶拷贝/μL后，然后分别取5μL各个稀释倍数的GCV RNA为模板进行RT-PCR，结果表明，每个反应当病毒RNA含量为2.0×10⁶拷贝/μL、2.0×10⁵拷贝/μL、2.0×10⁴拷贝/μL、2.0×10²拷贝/μL均能扩增出目的条带，而每个反应病毒RNA拷贝数从2.0×10¹拷贝/μL与2.0×10⁰拷贝/μL均不能扩增出目的条带。上述结果表明，应用该GCV特异性引物所建立的One-step RT-PCR方法最低检测限为2.0×10²拷贝/μL(参见附图3的电泳图所示)。

试验例5用于检测鹅嵌杯病毒的One-Step RT-PCR方法的应用

将临床采集的60份疑似传染性生长阻滞综合征鹅组织样品分别研磨，反复冻融，使用

Viral DNA/RNA Kit(北京全式金生物技术有限公司)提取基因组RNA，使用建立的One-Step RT-PCR方法进行扩增。附图4的电泳图展示了其中22份样品的检测结果，结果表明，有19份样品检测出鹅嵌杯病毒的特异性条带，为阳性结果。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本申请的技术方案而非对其保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本申请进行了详细的说明，所述领域的普通技术人员应当理解：本领域技术人员阅读本申请后依然可对申请的具体实施方式进行种种变更、修改或等同替换，但以上变更、修改或等同替换，均在本申请的待授权或待批准之权利要求保护范围之内。

序列表

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PCR引物序列、试剂盒及其方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 鹅嵌杯病毒(Goose calicivirus)

<400> 1

tgcmtytggg aygarttyga cac 23

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 鹅嵌杯病毒(Goose calicivirus)

<400> 2

macrccwggr ttctyctt 18

Claims (7)

1.一种用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PCR引物序列，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述。

2.一种用于检测鹅嵌杯病毒的RT-PC试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的RT-PCR引物序列。

3.一种用于检测鹅嵌杯病毒的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1、提取待检测的鹅组织样品，研磨后反复冻融，离心后取上清并提取基因组RNA；

S2、采用如权利要求1中所述的RT-PCR引物序列，使用One-Step RT-PCR方法进行扩增，样品的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后采用溴化乙锭染色，并于紫外分析仪器中观察、拍照及记录，若样品的扩增产物存在270bp的特异性条带，则说明该样品存在鹅嵌杯病毒。

4.根据权利要求3所述的用于检测鹅嵌杯病毒的方法，其特征在于，所述One-Step RT-PCR方法的反应条件为：45℃反转录30min；94℃变性5min；然后进入94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。

5.根据权利要求4所述的用于检测鹅嵌杯病毒的方法，其特征在于，所述One-Step RT-PCR方法的反应体系为：2×ES One-Step Reaction Mix 12.5μL，上游引物和下游引物的浓度均为20μmol/L，含量均为0.5μL，RNA模板2μL，

One-Step Enzyme Mix 0.5μL，加RNase-Free ddH₂O补足至25μL。

6.根据权利要求5所述的用于检测鹅嵌杯病毒的方法，其特征在于，所述S2中的琼脂糖凝胶电泳的浓度为1.5％，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压不超过5V/cm，电泳时间40-60min。

7.根据权利要求6所述的用于检测鹅嵌杯病毒的方法，其特征在于，所述鹅嵌杯病毒的最低检测限为2.0×10²拷贝/μL。

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