CN102251057A - 对虾传染性肌肉坏死病毒一步法rt-pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对虾传染性病毒的检测试剂盒及检测方法，属于海洋生物病原检测技术领域。本发明目的提供检测试剂盒及检测方法，该检测方法更加灵敏、特异，且可缩短反应时间，减少实验步骤。检测试剂盒包括：(1)、RT-PCR buffer管，内装2×RT-PCR buffer；(2)、引物管，内装传染性肌肉坏死病毒正反引物；(3)、酶管，内装反转录酶及DNA聚合酶；(4)、去离子水管，内装无菌去离子水；(5)、阴性对照管，内装SPF对虾核酸；(6)、阳性对照管，内装传染性肌肉坏死病毒cDNA阳性克隆。检测方法：包括(1)RT-PCR反应体系(2)RT-PCR反应程序。
Description
技术领域
本发明涉及对虾传染性病毒的检测试剂盒及检测方法，属于海洋生物病原检测技术领域。
背景技术
传染性肌肉坏死病为2002年在巴西发现的一种危害对虾生产的新的病毒性传染病，2004年美国亚利桑纳大学Donald V.Lightner博士研究发现该病由一种新的病毒引起并将之定名为传染性肌肉坏死病毒(Infectiousmyonecrosis virus，简称IMNV)。这种新型病毒为双链RNA病毒，属于整体病毒科。对虾传染性肌肉坏死病毒的易感对虾种类为南美白对虾，主要是感染60-80天的幼虾。该病毒能造成感病对虾全身肌肉组织坏死，一般情况下，病理死亡发生缓慢，死亡率不高，但整个养殖过程都有死亡，累积死亡率可达70％。
目前已有的传染性肌肉坏死病毒RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)检测方法为套式RT-PCR检测方法，检测过程较为繁琐、费时。而进行对虾传染性肌肉坏死病毒早期检测并采取预防措施是对虾养殖中降低对虾传染性肌肉坏死病毒流行风险、减少对虾发病导致经济损失的有效手段，所以建立简单快速高灵敏的检测方法，以及配合该检测方法使用的病毒检测试剂盒极为重要。
发明内容
本发明的目的在于解决现有套式RT-PCR检测方法中存在的检测过程繁琐费时的问题，提供对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒，同时还提供了利用该试剂盒进行检测的检测方法，该检测方法灵敏、特异，且可缩短反应时间，减少实验步骤。
本发明是通过以下技术方案实现的：
对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒，其特殊之处在于包括：
(1)、RT-PCR buffer管，内装2×RT-PCR buffer；
(2)、引物管，内装传染性肌肉坏死病毒正反引物；
(3)、酶管，内装反转录酶及DNA聚合酶；
(4)、去离子水管，内装无菌去离子水；
(5)、阴性对照管，内装SPF(无特定病原体)对虾核酸；
(6)、阳性对照管，内装传染性肌肉坏死病毒cDNA阳性克隆。
所述RT-PCR引物对包括
正向引物序列5’-CCAACATACGGTACAGTGGCAG-3’
反向引物序列5’-ATCGGTTGCCCAGGATACAAG-3’
产物长度为123bp。
对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测方法如下
(1)RT-PCR反应体系：
(2)RT-PCR反应程序：
cDNA合成和预变性：45℃30min，94℃2min，1个循环；
PCR扩增：94℃变性15s，55℃退火30s，72℃cDNA合成1min，40个循环；
终延伸：72℃延伸5min，1个循环；
4℃保存。
本发明对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒，根据传染性肌肉坏死病毒的全基因序列重新设计引物，经一步法RT-PCR检测传染性肌肉坏死病毒，此试剂盒可应用于对虾健康苗种培育、养殖防病、病毒生态调查、虾苗放流等过程的传染性肌肉坏死病毒检测，具有很高的推广应用价值。该方法灵敏、特异，且可缩短反应时间，减少实验步骤。
附图说明
图1：对虾传染性肌肉坏死病毒的灵敏度检测示意图；
M Marker；1-9 108-1拷贝经10倍梯度稀释的传染性肌肉坏病毒cDNA克隆；N空白对照。
图2：对虾传染性肌肉坏死病毒的特异性检测示意图；
M Marker；1传染性肌肉坏病毒；2肝胰腺细小病毒；3斑节对虾杆状病毒；4传染性皮下及造血组织坏死病毒；5白斑综合征病毒；6桃拉综合征病毒；7黄头病毒；8 SPF对虾DNA；9水；10空白对照。
具体实施方式
以下参照附图，给出本发明的具体实施方式，用来对本发明的构成进行进一步说明。
实施例1
本实施例对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒及检测方法
引物：根据GenBank中的IMNV全基因序列(AY570982)，设计了RT-PCR引物，正向引物序列5’-CCAACATACGGTACAGTGGCAG-3’，反向引物序列5’-ATCGGTTGCCCAGGATACAAG-3’，产物长度为123bp。
RT-PCR反应体系：
RT-PCR反应程序：
cDNA合成和预变性：45℃30min，94℃2min，1个循环；
PCR扩增：94℃变性15s，55℃退火30s，72℃cDNA合成1min，40个循环；
终延伸：72℃延伸5min，1个循环；
4℃保存。
检测灵敏度：该方法检测到100拷贝的传染性肌肉坏死病毒。(见图1)
检测特异性：该方法检测传染性肌肉坏死病毒特异性较好，仅传染性肌肉坏死病毒在123bp处有条带，对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、白斑综合征病毒、桃拉综合征病毒、黄头病毒及SPF对虾DNA在123bp处均无条带。(见图2)
检测试剂盒包括
(1)RT-PCR buffer管，内装2×buffer，10μl；(2)引物管：内装传染性肌肉坏死病毒正反引物；(3)酶管，反转录酶及DNA聚合酶；(4)去离子水管，内装无菌去离子水；(5)阴性对照管，内装SPF对虾核酸；(6)阳性对照管：内装传染性肌肉坏死病毒cDNA阳性克隆。
应用
此试剂盒可应用于对虾健康苗种培育、养殖防病、病毒生态调查、虾苗放流等过程的传染性肌肉坏死病毒检测，具有很高的推广应用价值。
本方法优点：
(1)灵敏度高：可以检测到100拷贝的传染性肌肉坏死病毒。
(2)特异性好：与图2中其它6种常见对虾病毒不发生交叉反应。
(3)安全：本试剂盒中的阳性对照为PCR产物克隆，不具有传染性。
Claims (4)
1.对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒，特征在于包括：
(1)、RT-PCR buffer管，内装2×RT-PCR buffer；
(2)、引物管，内装传染性肌肉坏死病毒正反引物；
(3)、酶管，内装反转录酶及DNA聚合酶；
(4)、去离子水管，内装无菌去离子水；
(5)、阴性对照管，内装SPF对虾核酸；
(6)、阳性对照管，内装传染性肌肉坏死病毒cDNA阳性克隆。
2.按照权利要求1所述对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述RT-PCR引物对包括
正向引物序列5’-CCAACATACGGTACAGTGGCAG-3’
反向引物序列5’-ATCGGTTGCCCAGGATACAAG-3’
产物长度为123bp。
3.权利要求1所述检测试剂盒用于检测对虾传染性肌肉坏死病毒。
4.利用上述权利要求1或2所述试剂盒实现的一种对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测方法，其特征在于
RT-PCR反应体系：
RT-PCR反应程序：
cDNA合成和预变性：45℃30min，94℃2min，1个循环；PCR扩增：94℃变性15s，55℃退火30s，72℃cDNA合成1min，40个循环；
终延伸：72℃延伸5min，1个循环；
4℃保存。
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| CN (1) | CN102251057A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102559484A (zh) * | 2012-01-31 | 2012-07-11 | 鲁东大学 | 对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
| CN102888468A (zh) * | 2012-10-11 | 2013-01-23 | 中华人民共和国中山出入境检验检疫局 | 南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法及试剂盒 |
| CN109468415A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-03-15 | 四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法 |
| CN111690775A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-22 | 哈尔滨元亨生物药业有限公司 | 一种非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒 |
| CN113151597A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-07-23 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 用于检测鹅嵌杯病毒的rt-pcr引物序列、试剂盒及其方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101921873A (zh) * | 2010-04-13 | 2010-12-22 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 对虾传染性肌肉坏死病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法 |
| CN101942527A (zh) * | 2010-08-03 | 2011-01-12 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 检测多种对虾病原的基因芯片及其检测方法 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101921873A (zh) * | 2010-04-13 | 2010-12-22 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 对虾传染性肌肉坏死病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法 |
| CN101942527A (zh) * | 2010-08-03 | 2011-01-12 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 检测多种对虾病原的基因芯片及其检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 《水产科学》 20100831 谢玮等 《核酸探针斑点杂交检测对虾传染性肌肉坏死病毒》 第443－446页 2 第29卷, 第8期 * |
| THALES P.D.ANDRADE等: "《Real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay using TaqMan probe for detection and quantification of Infectious myonecrosis virus (IMNV)》", 《AQUACULTURE》, vol. 264, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 9 - 15, XP005918987, DOI: 10.1016/j.aquaculture.2006.11.030 * |
| 谢玮等: "《核酸探针斑点杂交检测对虾传染性肌肉坏死病毒》", 《水产科学》, vol. 29, no. 8, 31 August 2010 (2010-08-31), pages 443 - 446 * |
| 闫冬春等: "《对虾传染性肌肉坏死病研究进展》", 《海洋科学》, vol. 33, no. 9, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 89 - 91 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102559484A (zh) * | 2012-01-31 | 2012-07-11 | 鲁东大学 | 对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
| CN102559484B (zh) * | 2012-01-31 | 2015-12-16 | 鲁东大学 | 对虾传染性肌肉坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
| CN102888468A (zh) * | 2012-10-11 | 2013-01-23 | 中华人民共和国中山出入境检验检疫局 | 南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法及试剂盒 |
| CN102888468B (zh) * | 2012-10-11 | 2014-01-29 | 中华人民共和国中山出入境检验检疫局 | 南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法及试剂盒 |
| CN109468415A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-03-15 | 四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法 |
| CN111690775A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-22 | 哈尔滨元亨生物药业有限公司 | 一种非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒 |
| CN113151597A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-07-23 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 用于检测鹅嵌杯病毒的rt-pcr引物序列、试剂盒及其方法 |
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