CN103882153B - 一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物 - Google Patents

一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组用于鹅细小病毒和番鸭细小病毒感染情况的可视化检测的实时荧光定量PCR引物的方法，该方法是利用该引物扩增的GPV和MDPV特异基因片段区域核苷酸GC含量的差异导致溶解曲线温度的差异来对GPV和MDPV感染情况进行检测，该方法仅需一组基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR引物结合反应结束后自动生成的溶解曲线即可特异性的对GPV和MDPV感染情况进行可视化鉴别诊断。本发明鉴定方法简单，效率和准确率较高。

Description

一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物
技术领域
  本发明属于动物分子病原学领域，具体涉及一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物。
背景技术
鹅细小病毒( Goose parvovirus，GPV) 是感染禽类的主要自主复制型细小病毒，由我国学者方定一于1956年首先在江苏省扬州地区发现（方定一．小鹅瘟的介绍[J]．中国兽医学杂志，1962，8：19-20．]，以后在许多国家也分离到该病毒，世界禽类学会为纪念匈牙利学者Derzsy的先进工作而将此病命名为Derzsy’s病（万春和，朱海侠，黄瑜，等．一株鹅细小病毒全基因特征分析[J]．中国动物传染病学报，2011，1,9（4）：19-24．）。
鹅细小病毒属于细小病毒科、细小病毒属，只有一个血清型。该病主要侵害30d以内的雏鹅和雏番鸭，引起以急性肠炎及肝、肾、心等实质脏器败血性病变，尤其是小肠部位的纤维性、栓塞性病变，是目前危害养鹅业健康发展的最严重的传染病之一，造成了严重的经济损失，引起国内外学者的广泛重视。
番鸭细小病毒病又叫 “三周病”，是由番细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）引起的一种急性、败血性传染病，其特点是具有高度传染性和死亡率。主要发生于3周龄以内的雏番鸭，病变的主要特征是肠道严重发炎，肠黏膜坏死，脱落，肠管肿脓、出血。本病可造成雏番鸭大批死亡，即使耐过也成僵鸭。
目前，关于鹅细小病毒和番鸭细小病毒病原学检测的实时荧光定量PCR方法均有相关报道。其中关于鹅细小病毒和番鸭细小病毒病原学检测的实时荧光定量PCR方法都是根据鹅细小病毒和番鸭细小病毒基因组特征分别设计引物，分别进行实时荧光定量PCR来进行诊断。
鹅细小病毒对雏鹅和雏番鸭均易感，在临床上对番鸭感染细小病毒的检测时，由于鹅细小病毒和番鸭细小病毒基因组NS基因同源性较高，PCR实验结果可能会造成假阳性扩增。目前，对GPV和MDPV感染情况用实时荧光定量PCR方法需分别进行实时荧光定量PCR反应，成本较高。
目前，国内外还没有仅需一组实时荧光定量PCR引物同时对GPV和MDPV感染情况进行可视化鉴别诊断的相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物及其检测方法，该方法能有效区分鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MDPV）感染（或共感染），为番鸭健康养殖提供技术保证。
本发明根据鹅细小病毒和番鸭细小病毒基因组中NS基因特征，设计一组实时荧光定量PCR引物，该引物针对鹅细小病毒和番鸭细小病毒进行PCR扩增可得到特异性目的条带，用常规PCR无法对GPV和MDPV感染情况进行鉴别诊断，对其扩增的GPV和MDPV基因在该区域存在有GC含量差异，通过建立基于SYBR  GreenⅠ实时荧光定量PCR对GPV和MDPV反应后的溶解曲线存在不同的特异峰，根据溶解曲线的特异峰的差异可直接对GPV和MDPV感染情况进行可视化观察。
本发明采用以下技术方案：
一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物，所述PCR引物P1和P2的序列为：上游引物P1：5’- TTCTTTGCTGCTCTGTTGGAAATA -3’，
下游引物P2：5’- GCTTTTACCAATATGCC -3’。
通过所述引物建立基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，根据利用该引物扩增的鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MDPV）特异基因片段区域核苷酸GC含量的差异导致溶解曲线温度Tm值的差异，根据溶解曲线Tm值的差异可直接对GPV和MDPV感染进行定量检测。
具体包括以下步骤：
（1）提取鹅细小病毒GPV和番鸭细小病毒MDPV基因组DNA；
（2）用所述实时荧光定量引物P1和P2同时对GPV和MDPV进行基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测，反应完成后作出溶解曲线；
（3）实时荧光定量PCR反应结束后，根据溶解曲线特异性峰值的差异直接对鹅细小病毒和番鸭细小病毒感染情况进行可视化检测。
所述PCR引物在检测鹅细小病毒和番鸭细小病毒感染情况方面的应用。
其中，实时荧光定量PCR引物需满足如下要求：
（1）该实时荧光定量PCR引物是选择GPV和MDPV非结构蛋白NS中的保守区域进行设计，该引物进行常规PCR时，均可对GPV和MDPV进行扩增，但扩增的PCR产物用常规琼脂糖凝胶电泳无法区别。
（2））该实时荧光定量PCR引物能一组实时荧光定量PCR反应能对鹅细小病毒基因组DNA和番鸭细小病毒基因组DNA均能阳性扩增，通过生成的溶解曲线获得特异性峰。
（3）该实时荧光定量PCR引物需选择能对GPV和MDPV进行实时荧光定量PCR阳性扩增，但是实时荧光定量PCR引物针对的GPV和MDPV在该扩增区域的基因片段存在有GC含量差异。由于GPV和MDPV在该扩增区域的基因片段存在有GC含量差异导致进行实时荧光定量PCR进行扩增后，生成的溶解曲线Tm值不同而存在有各自特异峰，可通过和实时荧光定量PCR仪器连接的电脑直接对GPV和MDPV感染情况进行可视化观察。
其中，所述的步骤（3）的峰值如下：
若在Tm=（86.17±0.06）℃出现单一的特异性峰判为GPV阳性；若在Tm=（84.27±0.06）℃出现单一的特异性峰判为MDPV阳性；若在Tm=（86.17±0.06）℃和Tm=（84.27±0.06）℃均出现特异性峰判为GPV和MDPV阳性。
本发明的有益效果：鉴定方法简单，效率和准确率较高。使用本研究提供的一组实时荧光定量PCR引物对本临床送检5份疑似水禽细小病毒（GPV和MDPV）感染情况进行可视化鉴别诊断的方法，其中GPV3株，MDPV 2株，其中1份样品还存在有GPV和MDPV共感染。
附图说明
图1 特异性实时荧光定量PCR引物对GPV和MDPV进行检测的溶解曲线。1为GPV阳性，2为MDPV阳性，3为GPV和MDPV阳性，4为GPV和MDPV阴性。
具体实施方式
   下面实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
1、毒株：
鹅细小病毒和番鸭细小病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。
2、引物设计与合成
根据GPV和MDPV非结构蛋白基因特征设计实时荧光定量PCR引物P1和P2，其中引物P1和P2序列为：
上游引物P1：5’- TTCTTTGCTGCTCTGTTGGAAATA -3’，
下游引物P2：5’- GCTTTTACCAATATGCC -3’。
3、实时荧光定量PCR扩增
     以常规方法提取GPV和MDPV基因组DNA。用所设计的特异性实时荧光定量PCR引物P1和P2进行实时荧光定量PCR扩增。
优化出的20 μL 最佳反应体系为体系：SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL、上、下游引物（10 μmol/L） 各0.2 μL、模板2 μL、水补足至20 μL。最佳反应条件为：95 ℃，2 min预变性；95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，共40个循环，循环结束后，做出溶解曲线。
4、实时荧光定量PCR溶解曲线
实时荧光定量PCR反应结束后，根据做出的溶解曲线，直接在和实时荧光定量PCR仪器连接的电脑上直接分析溶解曲线，对GPV和MDPV感染情况进行判断，判断方法为：
从生成的溶解曲线可见看出，若在Tm=（86.17±0.06）℃出现单一的特异性峰判为GPV阳性；若在Tm=（84.27±0.06）℃出现单一的特异性峰判为MDPV阳性；若在Tm=（86.17±0.06）℃和Tm=（84.27±0.06）℃均出现特异性峰判为GPV和MDPV阳性。
5、临床应用
使用本发明提供的引物方法对临床送检5份疑似水禽细小病毒（GPV和MDPV）感染情况进行可视化鉴别诊断的方法，其中鹅细小病毒3株，番鸭细小病毒2株，其中1份样品还存在鹅细小病毒和番鸭细小病毒共感染。本发明通过的方法用一组实时荧光定量PCR引物即可确定感染的水禽细小病毒类型，同时还能对GPV和MDPV感染类型和感染情况进行准确分析。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  福建省农业科学院畜牧兽医研究所
 
<120>  一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物
 
<130>  2
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
ttctttgctg ctctgttgga aata                                            24
 
 
<210>  2
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
gcttttacca atatgcc                                                    17

Claims (2)

1.一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量PCR引物，其特征在于：所述PCR引物P1和P2的序列为：上游引物P1：5’- TTCTTTGCTGCTCTGTTGGAAATA -3’，下游引物P2：5’- GCTTTTACCAATATGCC -3’。
2.一种如权利要求1所述的一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量PCR引物在制备检测鹅细小病毒和番鸭细小病毒试剂盒上的应用。
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Quantitative analysis of waterfowl parvoviruses in geese and Muscovy ducks by real-time polymerase chain reaction:correlation between age,clinical symptoms and DNA copy number of waterfowl parvorius;Wozniakowski et al;《BMC》;20121231;第8卷(第29期);摘要、第3页右栏—第4页以及Table3 *
番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立;刘家森等;《中国兽医科学》;20071231;第37卷(第6期);全文 *
鹅细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用;董浩等;《中国兽药杂志》;20111231;第45卷(第9期);全文 *

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