CN107058614B - 区分clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的定量PCR引物 - Google Patents

区分clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的定量PCR引物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一组区分clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物，利用clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV血凝素基因（HA）特征性核苷酸序列存在GC含量差异来设计。利用本组引物对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV进行实时荧光定量PCR反应均可有效扩增，但其在clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的实时荧光定量PCR反应后生成的熔解曲线存在熔解温度（Tm值）差异，来对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV进行有效区分。配合和实时荧光定量PCR仪器连接的电脑并利用仪器自带的分析软件，可达到仅需一组引物，即可特异性的对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV感染情况进行鉴别诊断。本发明鉴定方法简单，效率和准确率较高。

Description

区分clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的定量PCR引物
技术领域
本发明属于动物传染病学领域，具体涉及一组区分clade2.3.4和clade2.3.2.1H5 AIV的定量PCR引物。
背景技术
禽流感（Avian influneza，AI）是由A型流感病毒引起的、主要侵害家禽及野鸟的一种急性、高度接触性传染病。高致病性H5亚型禽流感病毒（H5 subtype avian influenzavirus, H5 AIV）引起的感染目前被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病，在我国被列为一类动物疫病。
关于流感的最早记录可追溯到1878年来自意大利的一次报道，随后世界各地陆续发生流感的暴发和流行。1996年，在我国分离到的第一株H5N1亚型HPAIV（A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1），GS/GD/96），紧接着香港于1997年发生H5N1亚型禽流感病毒直接感染人事件，这是第一个禽源流感病毒未经中间宿主而直接感染人的证据。由于从祖源病毒GS/GD/96进化出多个谱系且命名不统一，为此WHO、FAO和OIE联合制定了H5N1 HPAIV统一分类准则，将H5N1 HPAIV分为0~9共计10个不同clade。其中clade 2.3.4最早于2003~2006年间流行于中国、越南、泰国、老挝和马来西亚等地的病毒株，2006~2009年clade 2.3.4分支在我国很多地区是优势流行株；而2010年后逐渐被clade 2.3.2.1分支取代，但clade2.3.4分支依然在我国很多地区流行,并存在两种病毒共存的现象。针对clade 2.3.4分支我国已选取A/duck/Anhui/1/2006毒株为HA和NA的供体，研制出Re-5株疫苗，同时以A/duck/Guangdong/S1322/2006为HA和NA基因供体研制Re-6株疫苗来控制clade 2.3.2.1分支病毒的流行。对clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV进行鉴别诊断有助于指导H5 AIV相应疫苗的科学使用。
然而，clade 2.3.2.1和clade 2.3.4二者之间的HA基因序列核苷酸同源率高达94.3%（以经典毒株的同源率为例），很难通过常规的分子生物学方法（如常规RT-PCR方法）进行鉴别。
本发明的一组区分clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的定量PCR引物仅需1组引物对（2条引物）即可有效对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV进行有效区分。该引物根据clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV血凝素基因（HA）所存在的特征性核苷酸序列差异来设计；利用实时荧光定量PCR反应后生成的熔解曲线的Tm值和其GC含量正相关的特点，通过观察clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV经该组引物进行实时荧光定量PCR扩增反应后的熔解曲线Tm值差异，即可精确对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV感染情况进行准确鉴别诊断，相关研究尚未见国内外文献报道，本发明可填补相关领域空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一组区分clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的定量PCR引物及其应用，该引物能有效区分clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV感染（或共感染），为科学防控 H5 AIV提供技术保证。
本发明根据clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV血凝素基因（HA）存在特征性的核苷酸序列差异来设计一组实时荧光定量PCR引物。利用该扩增区域clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV血凝素基因（HA）存在的核苷酸GC含量差异，通过建立基于Eva Green的实时荧光定量PCR方法对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV血凝素基因（HA）进行实时荧光定量PCR扩增反应，获得的熔解曲线存在不同的熔解温度（Tm值）差异；根据熔解曲线Tm值差异可直接对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV感染情况进行鉴别诊断。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一组区分clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的定量PCR引物F1/R1，其核苷酸序列为：
上游引物F1：5’- AACCCAATGTGTGACGAAT -3’；
下游引物R1：5’- TTGAAATTCCCTGGGTAACA -3’。
通过所述引物建立基于Eva Green的实时荧光定量PCR方法，根据该引物扩增的clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV血凝素基因（HA）所存在的核苷酸特征性差异——GC含量差异，可导致实时荧光定量PCR反应扩增反应后的生成的熔解曲线存在不同的熔解温度（Tm值）的特点，可直接对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV感染进行鉴别。
具体包括以下步骤：
（1）设计并合成上述特异性引物对F1/R1；
（2）病毒RNA提取：从检测样品中分别提取clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的RNA；
（3）RT-PCR扩增：设计并合成H5 AIV血凝素基因HA特异性引物对H5-HAF/H5-HAR对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增，获得其HA基因序列；将RT-PCR扩增的目的片段进行胶回收并纯化后，克隆到T载体上，获得含有clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的血凝素基因HA的阳性重组质粒（T-clade2.3.4-1和T-clade2.3.2.1-1），测定其OD值计算出拷贝数后，连续倍比稀释，作为实时荧光定量PCR反应的标准品。
所用H5 AIV血凝素基因HA特异性引物对H5-HAF/H5-HAR的核苷酸序列为：
H5-HAF: 5’- TGGTTACCATGCAAACAAC -3’；
H5-HAR: 5’- TTACACTTTCCATACATTCATTATC -3’。
（4）实时荧光定量PCR：用所述实时荧光定量引物对F1/R1对阳性重组质粒T-clade2.3.4-1和T-clade 2.3.2.1-1进行Eva Green实时荧光定量PCR扩增，反应完成后获得相应的扩增曲线，并生成Eva Green实时荧光定量PCR扩增的熔解曲线。
（5）病毒感染情况判断：实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察扩增曲线判断是否存在clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV感染；通过观察溶解曲线其Tm值差异可对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV进行鉴别。
其中，本发明所设计的定量PCR引物对F1/R1满足如下要求：
（1）特异性强：该实时荧光定量PCR引物在针对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5AIV血凝素基因HA核苷酸序列进行分析后保守的区域设计，对二者均具有高特异性，达到仅需一组引物便能对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV进行扩增的目的。即观察实时荧光定量PCR反应后的扩增曲线即可判断是否感染clade2.3.4或clade2.3.2.1 H5 AIV。
（2）两种病毒的扩增区域GC含量不同：该组引物扩增的血凝素基因HA在clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV中存在核苷酸序列GC含量差异。基于实时荧光定量PCR反应生成的熔解曲线的Tm值差异（该差异和核苷酸序列的GC含量差异正相关），即可通过观察实时荧光定量PCR反应后的熔解曲线对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV感染进行判断（可有效区分是clade2.3.4 H5 AIV还是clade2.3.2.1 H5 AIV）。
其中，所述的步骤（5）的病毒感染情况判断方法如下：
若在Tm=（83.56±0.08）℃出现单一的特异性Tm峰判为clade2.3.4 H5 AIV阳性；
若在Tm=（82.72±0.11）℃出现单一的特异性Tm峰判为clade2.3.2.1 H5 AIV阳性；
若在Tm=（83.56±0.08）℃以及Tm=（82.72±0.11）℃出现双峰，则判断为clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV双重感染；
其他情况均判为阴性。
本发明所设计的定量PCR引物对F1/R1可用于制备区分clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV感染的试剂盒。
本发明的有益效果：鉴定方法简单，效率和准确率较高。使用本研究提供的一组实时荧光定量PCR引物对前期分离的2株clade2.3.4 H5 AIV和2株clade2.3.2.1 H5 AIV进行实时荧光定量PCR检测，均和预期相符。且仅需1组引物对（2条引物）即可有效对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV进行有效区分。
附图说明
图1 为clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV血凝素基因HA引物设计区及核苷酸序列特征性差异图。
图2 引物F1/R1对clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV进行实时荧光定量PCR反应的扩增曲线：F1/R1对clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV病毒感染结果的判断须在扩增成功的前提下做出，若扩增失败，则不可依据熔解曲线做出感染类型判断；若拷贝数相同，则clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV扩增曲线一致。
图3 引物对F1/R1对clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV进行实时荧光定量PCR反应的熔解曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
1、毒株：
H5亚型流感病毒clade 2.3.4分支（CX1株）和clade 2.3.2.1分支（DY1株）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。
2、引物设计与合成
根据clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV的血凝素基因HA核苷酸特征性差异区设计实时荧光定量PCR反应的引物F1和R1，其中F1和R1引物序列为：
上游引物F1：5’- AACCCAATGTGTGACGAAT -3’
下游引物R1：5’- TTGAAATTCCCTGGGTAACA -3’。
3、病毒RNA提取以及RT-PCR扩增：
以常规方法提取clade 2.3.4分支（CX1株）和clade 2.3.2.1分支（DY1株） H5AIV的病毒RNA。利用针对 H5 AIV血凝素基因HA设计特异性引物（ H5-HAF: 5’-TGGTTACCATGCAAACAAC -3’和H5-HAR: 5’- TTACACTTTCCATACATTCATTATC -3’） 对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增，获得其HA基因编码区序列；将RT-PCR扩增的目的片段进行胶回收后纯化后，克隆到T载体上，获得含有clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的血凝素基因HA的阳性重组质粒（T-clade2.3.4-1和T-2.3.2.1-2），测定其OD值计算出拷贝数后，连续倍比稀释，作为实时荧光定量PCR反应的标准品。
4、实时荧光定量PCR反应：
优化出的20 μL最佳反应体系为体系：Eva Green 10 μL，浓度为10 μmol/L的F1、R1各0.2 μL、模板2 μL、水补足至20 μL。最佳反应条件为：95℃，2 min预变性；95℃ 10 s，60℃ 15 s，共40个循环，循环结束后，根据条件做出对应的熔解曲线。
5、病毒感染情况判断：
实时荧光定量PCR反应结束后，观察扩增曲线，判断建立的方法有无特异性扩增（没有扩增曲线，熔解曲线的检测结果没有意义）。实时荧光定量PCR反应结束后做出的熔解曲线，直接在和实时荧光定量PCR仪器连接的电脑上，利用实时荧光定量PCR对应的软件进行分析（可直接肉眼观察），对clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV感染情况进行判断，判断方法为：
若在Tm=（83.56±0.08）℃出现单一的特异性Tm峰判为clade2.3.4 H5 AIV阳性；
若在Tm=（82.72±0.11）℃出现单一的特异性Tm峰判为clade2.3.2.1 H5 AIV阳性；
若在Tm=（83.56±0.08）℃以及Tm=（82.72±0.11）℃出现双峰，则判断为clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV双重感染；
其他情况均判为阴性。
从图3可以看出，引物对F1/R1对两株病毒血凝集素基因（HA）片段扩增特异性强，且二者的Tm值存在差异，可有效区分两株病毒。试验结果表明， 使用本研究提供的一组实时荧光定量PCR引物对前期分离的2株clade2.3.4 H5 AIV和2株clade2.3.2.1 H5 AIV进行实时荧光定量PCR检测，均和预期相符。且仅需1组引物对（2条引物）即可有效对clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV进行有效区分。
实施例2
对临床送检的41份死亡鸭病料经处理后进行实时荧光定量PCR检测后发现，clade2.3.4 H5 AIV感染阳性有2株，阳性率为4.87%（2/41）；clade2.3.2.1 H5 AIV感染阳性有3株，阳性率为7.31%（3/41）；未检测到临床送检的41份死亡鸭存在clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV共感染现象。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 区分clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> F1
<400> 1
aacccaatgt gtgacgaat 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> R1
<400> 2
ttgaaattcc ctgggtaaca 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> H5-HAF
<400> 3
tggttaccat gcaaacaac 19
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> H5-HAR
<400> 4
ttacactttc catacattca ttatc 25

Claims (2)

1.一组区分clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物，其特征在于：所述PCR引物的核苷酸序列为：
上游引物F1：5’- AACCCAATGTGTGACGAAT -3’，
下游引物R1：5’- TTGAAATTCCCTGGGTAACA -3’。
2.利用权利要求1所述一组区分clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物在制备区分clade2.3.4和clade2.3.2.1 H5 AIV试剂盒上的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103882153A (zh) * 2014-04-04 2014-06-25 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物
CN105969914A (zh) * 2016-07-26 2016-09-28 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一组区分鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量pcr引物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103882153A (zh) * 2014-04-04 2014-06-25 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一组用于水禽细小病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物
CN105969914A (zh) * 2016-07-26 2016-09-28 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一组区分鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量pcr引物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The rapid molecular subtyping and pathotyping of avian influenza viruses;A.Yacoub等;《Journal of virological methods》;20081206;第156卷(第1-2期);1第158页左栏第5-6段、第160页左栏第1段、图3 *
不同H5亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR试剂盒的比较;陈裕等;《广东畜牧兽医科技》;20161218;第41卷(第6期);第38~41页 *

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