CN109161611B

CN109161611B - 一种基于三重荧光pcr法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组及试剂盒

Info

Publication number: CN109161611B
Application number: CN201810896644.1A
Authority: CN
Inventors: 张欢; 孙九峰; 谈琦琪; 梁楚敏; 张欣; 周惠琼; 张鲍欢; 宁丹; 吴德
Original assignee: GUANGDONG PROVINCIAL INSTITUTE OF PUBLIC HEALTH; CENTRE FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION OF GUANGDONG PROVINCE
Current assignee: GUANGDONG PROVINCIAL INSTITUTE OF PUBLIC HEALTH; CENTRE FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION OF GUANGDONG PROVINCE
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2038-08-08
Also published as: CN109161611A

Abstract

本发明公开了一种三重荧光PCR法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组，包括针对版纳病毒的特异性引物及探针、针对卡地皮诺的探针及引物、针对辽宁病毒的探针及引物，针对版纳病毒的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，针对版纳病毒的反向引物序列如SEQ ID No.2所示，针对卡地皮诺的正向引物序列如SEQ ID No.3所示，针对卡地皮诺的反向引物序列如SEQ ID No.4所示；针对辽宁病毒的正向引物序列如SEQ ID No.5所示，针对辽宁病毒的反向引物序列如SEQ ID No.6所示。本发明引物探针组及试剂盒可以对版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒进行检测，检测灵敏度达1×10³copies/ml，有效克服现有技术中对版纳病毒、卡地皮诺及辽宁病毒检测的缺失，具高度产业利用价值。

Description

一种基于三重荧光PCR法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组及试剂盒，特别是涉及一种基于三重荧光PCR法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组、试剂盒及其使用方法。

背景技术

版纳病毒(Banna virus，BAV)为呼肠科(the family Reoviridae)，东南亚十二节段RNA病毒属(the genus Seadornavirus)病毒。基因组包含12个节段双链病毒RNA,是一种主要经蚊虫传播种虫媒病毒。版纳病毒在云南省西双版纳地区首次分离并命名为版纳病毒，目前该病毒主要分布在中国、越南和印度尼西亚。版纳病毒可感染人及其它脊椎动物，无宿主特异性，可引起人类脑炎的症状。已有的研究发现中国的部分地区脑炎病例中存在版纳病毒特异性抗体，因而版纳病毒可能已经成为我国病毒性脑炎的重要病原体之一，后续的虫病病毒调查研究发现，版纳病毒也存在于北京、海南、贵州、新疆、河南、云南等地采集的蚊虫标本中，因而版纳病毒的流行范围比我们预计的要更加广泛。

卡地皮诺病毒(Kadipiro virus，KDV)同属呼肠科(the family Reoviridae)，东南亚十二节段 RNA病毒属(the genus Seadornavirus)的病毒，1981年首次在印度尼西亚的棕头库蚊(Culex fuscocephalus)中用C6/36细胞系分离出，首次鉴定为呼肠科(thefamily Reoviridae)的杯状病毒属(the genus Coltivirus)，后被重新分类入东南亚十二节段RNA病毒属(the genus Seadornavirus)。随后在我国云南的三带喙库蚊(Culextritaeniorhynchus)、中华按蚊(Anopheles sinensis)、骚扰阿蚊 (Armigeressubalbatus)，山东的中华按蚊(Anopheles sinensis)中也分离出卡地皮诺病毒，显示该病毒具有广泛的地域分布。

辽宁病毒(Liaoning virus，LNV)是呼肠科(the family Reoviridae)，东南亚十二节段RNA病毒属(the genus Seadornavirus)的第三个种。首次在中国辽宁的背点伊蚊(Aedes dorsalis)中分离到，是东南亚十二节段病毒属中唯一可在哺乳动物细胞上复制的种。虽然目前未有辽宁病毒感染人的病例报道，但是这种病毒寄生的背点伊蚊广泛存在于北美、欧洲和亚洲地区，是一些森林哺乳动物及鸟类的食物，是北美西尼罗病毒(West Nilevirus)及西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus)的主要传播媒介，因而具有潜在爆发的危险。最近在我国的新疆及东北的其它地区的背点蚊媒中也分离到了辽宁病毒，且病毒具有较高的进化速率，因而辽宁病毒带来的威胁与日俱增。

版纳病毒、辽宁病毒及卡地皮诺病毒同属呼肠科(the family Reoviridae)，东南亚十二节段 RNA病毒属(the genus Seadornavirus)的病毒，遗传结构相似，传播媒介均为蚊媒，流行区域均集中在中国的及与中国有密切人员及贸易交流的国家，一旦引起人的感染爆发，三者的的鉴别需依赖于实验室特异性检测，但目前并无同时针对上述三种病毒的特异性检测试剂盒。

发明内容

本发明提供了一种基于三重荧光PCR法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组、试剂盒及其使用方法，以解决缺少对版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒进行有效检测方法的问题。

本发明公开了一种三重荧光PCR法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组，包括针对版纳病毒的特异性引物及探针、针对卡地皮诺的探针及引物、针对辽宁病毒的探针及引物，所述针对版纳病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对版纳病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对版纳病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述针对卡地皮诺的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对卡地皮诺的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对卡地皮诺的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述针对辽宁病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对辽宁病毒的正向引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.5所示，针对辽宁病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

进一步地，所述版纳病毒探针的探针序列如SEQ ID No.7所示。所述针对卡地皮诺的探针序列如SEQ ID No.8所示。所述针对辽宁病毒的探针序列如SEQ ID No.9所示。

进一步地，所述版纳病毒探针、卡地皮诺探针、辽宁病毒探针两端标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

更进一步地，所述版纳病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述卡地皮诺探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述辽宁病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。具体可选用的荧光报告基团包括但不限于 FAM、HEX、CY5等中的一种或多种的组合。在本发明一实施例中，所述版纳病毒探针荧光报告基团为FAM荧光基团，所述卡地皮诺探针荧光报告基团为HEX荧光基团，所述辽宁病毒探针的荧光报告基团为CY5荧光基团，所述版纳病毒探针、卡地皮诺探针、辽宁病毒探针的荧光淬灭基团均为BHQ1。

更进一步地，所述版纳病毒探针上标记的荧光报告基团、所述卡地皮诺探针上标记的荧光报告基团、所述辽宁病毒探针上标记的荧光报告基团的荧光波长不相同。本发明所提供的试剂盒中，版纳病毒、卡地皮诺病毒和辽宁病毒探针上标记的荧光报告基团不相同且荧光波长不相同，优选情况下，三种荧光报告基团的荧光波长相差较大、信号强度相近，保证了检测结果的准确性，避免了信号之间的相互干扰。

本发明还公开了一种三重荧光定量PCR检测版纳病毒、卡地皮诺及辽宁病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物探针组。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR试剂和阳性对照中的一种或多种。

本发明所提供的试剂盒用于版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的荧光PCR检测，所以试剂盒中还可以包括其他荧光PCR检测中的相关试剂，具体包括但不限于：PCR试剂、阴性对照品和阳性对照品等。

所述RNA抽提试剂可使用本领域各种病毒RNA抽提试剂，这些试剂均可通过市售途径获得。

所述PCR试剂可采用本领域各种PCR试剂，具体可包括PCR预混液、PCR酶(包括反转录酶和Taq酶)、工艺用水等，所述工艺用水包括但不限于ddH2O，这些试剂均可通过市售途径获得。

本领域技术人员可根据实际需要确定阴性对照品和阳性对照品，在本发明一实施例中，所述阴性对照品为DEPC-H₂O，所述阳性对照品为含有版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒扩增序列的质粒。

本发明所提供的三重检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的试剂盒采用Taqman荧光定量PCR原理，分别针对版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒设计特异性引物，扩增特异性核酸序列，同时分别设计Taqman探针，并标记不同的荧光报告基团，位于上下游引物之间。探针其 5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。因此，本发明采用的荧光定量PCR技术具有实时检测、定量和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等优点。

本发明还公开了一种上述试剂盒的三重荧光定量PCR检测版纳病毒、卡地皮诺及辽宁病毒的检测方法，具体包括如下步骤：

1)标本的核酸提取：使用病毒RNA抽提试剂盒提取标本RNA；

2)核酸荧光PCR检测混合液的配制：将针对版纳病毒的特异性引物、版纳病毒探针、针对卡地皮诺的特异性引物、卡地皮诺探针、针对辽宁病毒的特异性引物、辽宁病毒探针、工艺用水组成核酸荧光PCR检测混合液体系；

3)试剂配制：对核酸荧光PCR检测混合液体系进行振荡混匀，并离心；

4)加样：将步骤3所得混合液置于PCR管中，然后将步骤1所得标本、阳性对照品、DEPC-H₂O分别加入PCR管中，离心后立即进行PCR扩增反应；

5)通过定量荧光PCR仪器对样品进行PCR反应，并通过荧光信号的强度判断版纳病毒、卡地皮诺和辽宁病毒的阳性和阴性。

所述步骤3中，本领域技术人员可根据实际反应情况或现有试剂盒的使用说明，确定核酸荧光PCR检测混合液体系的配比。所述步骤4中，本领域技术人员可根据实际反应情况或现有试剂盒的使用说明，确定核酸荧光PCR检测混合液体系的使用比例。

所述步骤5中，具体指步骤2所得标本、阳性对照品、DEPC-H2O(阴性对照)的平行实验，分别将试样加入到对应的PCR管中，离心后进行PCR扩增反应。

所述步骤4和步骤5中，离心的时间为数秒，本领域技术人员可根据实验需求确定实际所需要的离心时间。

本发明发明人通过长期研究和大量的筛选实验，通过特定引物的设计，从而提供了一种能够同时检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的试剂盒。所述试剂盒具体涉及三对特异性PCR 引物和探针，分别特异性扩增版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒，三对特异性PCR引物能在同一PCR反应体系中同时进行扩增，实现了多重PCR检测，不仅操作简便，还大大缩短了检测时间。此外，所述三对特异性引物和探针均具有高度的保守性和特异性，三对引物和探针之间无互补配对或交叉扩增的情况，且对于三种病毒的检测灵敏度均可达到1×10³copies/ml以上，保证了检测结果灵敏度和准确性的同时，避免了信号之间的相互干扰。

附图说明

图1为本发明实施例版纳病毒灵敏度检测曲线图示意图；

图2为本发明实施例卡地皮诺灵敏度检测曲线图示意图；

图3显示为本发明实施例辽宁病毒灵敏度检测曲线图示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的三重检测试剂盒(荧光PCR法)检测引物探针的设计和合成：

按SEQ ID No.1-9合成针对版纳病毒的特异性引物及版纳病毒探针、针对卡地皮诺病毒的特异性引物以及卡地皮诺病毒探针、针对辽宁病毒的特异性引物以及辽宁病毒探针，并在版纳病毒探针的5’标记FAM荧光基团，卡地皮诺病毒探针的5’标记HEX荧光基团，辽宁病毒探针的 5’标记CY5荧光基团，三者的3’端均标记BHQ1，合成版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针，引物和探针序列具体如下：

版纳病毒：

上游引物：GTATCTGTAGTACATAATTTC(SEQ ID No.1)

下游引物：GTTTCTTACTACTATCAGTG(SEQ ID No.2)

探针：5’FAM-AAATCAAGAAGTTTACATTCAATTA-BHQ1 3’(SEQ ID No.7)

卡地皮诺：

上游引物:ATAAAGTAGTAGCAGTAATAG(SEQ ID No.3)

下游引物:AAATAATCGTCAGTTGATAA(SEQ ID No.4)

探针:5’HEX-AATTATTGTTTCATCTGGAATTACC-BHQ13’(SEQ ID No.8)

辽宁病毒：

上游引物:TTCGCAGAATATATGGAAAC(SEQ ID No.5)

下游引物:ATTTGTCGTTTTCCTGGAAATA(SEQ ID No.6)

探针:5’CY5-CTAAATTACAAAGCTGTTGTTGAAT-BHQ1 3’(SEQ ID No.9)

实施例2

版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒三重核酸检测试剂盒(荧光PCR法)检测混合液的配制：

按照版纳病毒上游引物0.5μl/test；下游引物0.5μl/test；探针0.25μl/test；卡地皮诺上游引物 0.5μl/test；下游引物0.5μl/test；探针0.25μl/test；辽宁病毒上游引物0.5μl/test；下游引物0.5μl/test；探针0.25μl/test；引物浓度均为10μM，探针浓度均为10μM；PCR MIX 12.5μl/test；工艺用水 (ddH₂O)3.75μl/test进行混匀即为核酸荧光PCR检测混合液。

实施例3

版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒三重核酸检测试剂盒(荧光PCR法)的灵敏度分析：

3.1样品的准备：

取1×10⁹copies/ml的版纳病毒质粒(BAV-S1)(将目标扩增序列通过TA克隆至PEGM-T载体上，获得的BAV-S1质粒。目标扩增序列为：

GTATCTGTAGTACATAATTTCGCTAGGAGTCAAGGCTTGCCGCTTAACTTTGAAACTGTGGG TTGTGAGGGTCCAAGTCACGACCCACGCTTCGTAATTGAATGTAAACTTCTTGATTTCCAGCATCAGTGCACTGATAGTAGTAAGAAAC(SEQ ID No.10))分为5份，其中4份依次按照10倍、 100倍、1000倍、10000倍进行稀释，获得BAV-S2(1×10⁸copies/ml)、BAV-S3(1×10⁷copies/ml)、BAV-S4(1×10⁶copies/ml)、BAV-S5(1×10⁵copies/ml)，得到共5份作为检测样品。

取1×10⁹copies/ml的卡地皮诺质粒(KDV-S1)(将目标扩增序列通过TA克隆至PEGM-T载体上，获得的KDV-S1质粒。目标扩增序列：

ATAAAGTAGTAGCAGTAATAGTAATTATTGTTTCATCTGGAATTACCGTAGTTAATCAGATTGGTCAAAAGAAATTATCAACTGACGATTATTT(SEQ ID No.11))分为5份，，按照10倍、100倍、 1000倍、10000倍进行稀释，获得KDV-S2(1×10⁸copies/ml)、KDV-S3(1×10⁷copies/ml)、 KDV-S4(1×10⁶copies/ml)、KDV-S5(1×10⁵copies/ml)，得到共5份作为检测样品。

取1×10⁹copies/ml的辽宁病毒质粒(LNV-S1)(将目标扩增序列通过TA克隆至PEGM-T载体上，获得的LNV-S1质粒。目标扩增序列：

TTCGCAGAATATATGGAAACGGAATTTCTAAATTACAAAGCTGTTGTTGAATTACAGAAAAC GAAATTAAATCAATTATTTCCAGGAAAACGACAAAT(SEQ ID No.12))分为5份，，按照10倍、 100倍、1000倍、10000倍进行稀释，获得LNV-S2(1×10⁸copies/ml)、LNV-S3(1×10⁷copies/ml)、 LNV-S4(1×10⁶copies/ml)、LNV-S5(1×10⁵copies/ml)，得到共5份作为检测样品。

3.2试剂配制：

每个反应管中，加入上述20μl核酸荧光PCR检测混合液。

3.3加样：

将BAV-S1～S5、KDV-S1～S5、LNV-S1～S5、阳性对照品(见3.1)、DEPC-H₂O(阴性对照品)各 5μl分别加入薄壁PCR反应管或PCR反应板中，每个反应管中含有20μl核酸荧光PCR检测混合液，盖好薄壁PCR反应管盖或PCR反应板膜，离心数秒后立即进行PCR扩增反应。

3.4 PCR扩增：

反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：

反应管置于荧光PCR仪上，反应条件设置为(反应体积设置为25μl)：①95℃2min，②95℃ 15s，③53℃30s，②-③循环40次，单点荧光检测在53℃。

荧光通道检测选择：选用FAM、HEX和CY5通道。

基线和阈值设定：基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过 DEPC-H₂O检测荧光曲线的最高点。

质量控制：试剂盒各对照品须达到以下要求(表1)，否则实验视为无效。

表1

检测结果判断标准如表2所示：

表2

3.5各检测样品的检测结果如图1、图2所示：

由图1可知，对于版纳病毒质粒，BAV-S1(1×10⁹copies/ml)～BAV-S5(1×10⁵copies/ml)均检测为阳性，表明试剂盒检测版纳病毒的检测灵敏度能达到1×10⁵copies/ml。(图1中在24-28Cycles 之间的曲线从高至低依次对应BAV-S1～BAV-S5)。

由图2可知，对于卡地皮诺质粒，KDV-S1(1×10⁹copies/ml)～KDV-S5(1×10⁵copies/ml)均检测为阳性，表明试剂盒检测卡地皮诺的检测灵敏度能达到1×10⁵copies/ml。(图2中在18-20Cycles 之间的曲线从高至低依次对应KDV-S1～KDV-S5)。

由图3可知，对于辽宁病毒质粒，LNV-S1(1×10⁹copies/ml)～LNV-S5(1×10⁵copies/ml)均检测为阳性，表明试剂盒检测辽宁病毒的检测灵敏度能达到1×10⁵copies/ml。(图3中在20-26Cycles 之间的曲线从高至低依次对应LNV-S1～LNV-S5)。

3.6对于版纳病毒、卡地皮诺质粒、辽宁病毒质粒进行极限稀释灵敏度测定：

取1×10⁹copies/ml的版纳病毒质粒(BAV-S1)分为4份，依次按照10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍进行稀释，获得BAV-S6(1×10⁴copies/ml)、BAV-S7(1×10³copies/ml)、BAV-S8(1×10²copies/ml)、 BAV-S9(1×10copies/ml)，得到共4份作为检测样品；卡地皮诺质粒(KDV-S1)采用相同方式进行稀释，得到KDV-S6(1×10⁴copies/ml)、KDV-S7(1×10³copies/ml)、KDV-S8(1×10²copies/ml)、KDV-S9(1×10copies/ml)；辽宁病毒质粒(LNV-S1)采用相同方式进行稀释，得到 LNV-S6(1×10⁴copies/ml)、LNV-S7(1×10³copies/ml)、LNV-S8(1×10²copies/ml)、 LNV-S9(1×10copies/ml)；重复步骤3.1-3.4，发现BAV-S7、KDV-S7、LNV-S7的检测结构Ct值为38-40之间，结果为阳性，而BAV-S8、BAV-S9、KDV-S8、KDV-S9、LNV-S8、LNV-S9的Ct 值大于38，结果为阴性。

综上所述，本发明实施例的检测灵敏度均可达1×10³copies/ml，有效克服了现有技术中对版纳病毒、卡地皮诺、辽宁病毒检测的缺失，具高度产业利用价值。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省疾病预防控制中心

<120> 一种基于三重荧光PCR法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探

针组及试剂盒

<130> 1

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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gtatctgtag tacataattt c 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtttcttact actatcagtg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ataaagtagt agcagtaata g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaataatcgt cagttgataa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttcgcagaat atatggaaac 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atttgtcgtt ttcctggaaa ta 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aattattgtt tcatctggaa ttacc 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctaaattaca aagctgttgt tgaat 25

Claims

1.一种基于三重荧光定量 PCR 检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组，所述引物探针组包括针对版纳病毒的特异性引物、版纳病毒探针、针对卡地皮诺的特异性引物、卡地皮诺探针、针对辽宁病毒的特异性引物及辽宁病毒探针，所述针对版纳病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，所述针对版纳的正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述针对版纳的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述针对卡地皮诺的特异性引物包括正向引物和反向引物，所述针对卡地皮诺的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述针对卡地皮诺的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述针对辽宁病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对辽宁病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，针对辽宁病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述版纳病毒探针、卡地皮诺探针、辽宁病毒探针两端标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；所述版纳病毒探针 5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述卡地皮诺探针 5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述辽宁病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述版纳病毒探针的探针序列如 SEQ ID No.7 所示，所述针对辽宁病毒的探针序列如 SEQ ID No.9 所示，所述针对卡地皮诺的探针序列如SEQ ID No.8 所示。

2.如权利要求 1 所述的引物探针组，其特征在于，所述版纳病毒探针上标记的荧光报告基团、所述卡地皮诺探针上标记的荧光报告基团、所述辽宁病毒探针上标记的荧光报告基团的荧光波长不相同。

3.一种三重荧光定量 PCR 检测版纳病毒、卡地皮诺及辽宁病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-2 任一所述引物探针组。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括 PCR 试剂和阳性对照中的一种或多种。