CN108823332A - 一组gpv和n-gpv通用型检测引物和探针 - Google Patents

Abstract

本发明提供一组GPV和N‑GPV通用型检测引物和探针，所述引物和探针序列如下：上游引物NGG‑F：5’‑TAGGGAGGAGTTAGAAGA‑3’；下游引物NGG‑R：5’‑CATCCATAGAATTGTCATAAGTA‑3’；所述探针NGG‑P序列为：5’‑ACCTGGTAATTGTTCCTG CTTCTCT‑3’，其5’‑端标记荧光报告基团FAM，3’‑端标记荧光淬灭基团Eclipse。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，可检测N‑GPV感染，为后续研究N‑GPV的致病机理和开展分子流行病学奠定基础。

Description

一组GPV和N-GPV通用型检测引物和探针

技术领域

本发明涉及一组GPV和N-GPV通用型检测引物和探针，属于禽病学领域。

背景技术

实时荧光定量PCR方法（qPCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针（荧光共振能量传递探针）和分子信标（molecular Beacon）。TaqMan探针法是指qPCR 扩增时在加入一对引物时，还同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA、BHQ等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号。随着qPCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与qPCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。由于TaqMan实时荧光定量探针在常规SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的基础上，加入一条更特异性的探针，使检测目的基因只有和TaqMan探针特异性的结合，才能检测到阳性扩增信号，使检测结果更特异性，避免了SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法可能导致的结果误读误判，被广泛应用于病原学检测领域。

鹅细小病毒（Goose parvovirus, GPV）为无囊膜、正二十面体对称、单股DNA病毒；其基因组全长均为5.1Kb左右。研究发现，其基因组在5’-末端（terminal）和3’-末端均为含有发夹结构（hairpin structure）的末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR），以及2个大的开放阅读框（ORF）组成。左侧的ORF编码病毒复制相关蛋白NS，右侧的ORF编码病毒抗原相关蛋白VP（VP蛋白可经不同的切割形成3个主要抗原蛋白VP1、VP2和VP3），VP2、VP3与VP1共同使用相同的3’-末端和同一终止密码子。2015年以来我国多地樱桃谷鸭、北京鸭和半番鸭出现以上喙变短、舌头伸出为典型特征，由新型鹅细小病毒（novel GPV，N-GPV）感染所致的短喙与侏儒综合征（short beak and dwarfism syndrome，SBDS），并对家养水禽表现出广泛的致病性(Chen H, et al. Isolation and genomic characterization of aduck-origin GPV-Related Parvovirus from Cherry Valley ducklings in China.PLoS One, 2015, 10: e0140284.)。经过流行病学调查发现，GPV和N-GPV在致病型和宿主上存在差别：GPV可感染鹅和番鸭（偶见可感染天鹅和鸿雁）；N-GPV可感染北京鸭、樱桃谷鸭和半番鸭。

关于GPV和MDPV的实时荧光定量PCR方法，见有Woźniakowski等于2012年基于GPV和MDPV的ITR区的发夹结构特征建立了一种检测GPV和MDPV的实时荧光定量PCR方法(Woźniakowski G, et al. Quantitative analysis of waterfowl parvoviruses in geeseand Muscovy ducks by real-time polymerase chain reaction: correlation betweenage, clinical symptoms and DNA copy number of waterfowl parvoviruses. BMC VetRes. 2012, 8:29. )，但该方法无法科学有效区分GPV和MDPV感染。近年来研究发现，GPV的ITR区存在大量的变异[Wang J, Duan J, Zhu L, Jiang Z, Zhu G. Sequencing andgeneration of an infectious clone of the pathogenic goose parvovirus strainLH. Arch Virol. 2015，160(3): 711-718. doi: 10.1007/s00705-014-2319-5.]，使得该方法在GPV的检测上会由于病毒的变异而导致探针不匹配，导致出现错误的检测结果，而无法科学有效的应用到GPV和N-GPV的检测上。

新型番鸭细小病毒（novel Muscovy duck parvovirus，N-MDPV）为近年来鸭群新发传染病，目前报道见有可感染番鸭和半番鸭。通过对N-MDPV分离株（NM100株）进行基因组序列测序分析发现，其基因组为5073 nt，具有MDPV基因组结构特征。经序列比对分析发现，其与番鸭细小病毒重组株（SAAS-SHNH株）核苷酸序列同源性最高为99.5%，与经典MDPV代表株（FM株）基因组核苷酸同源性为93.7%，与经典GPV代表株（B株）基因组核苷酸同源性为85.5%。经遗传进化分析发现，NM100株在基因组全长、VP1基因的遗传进化上与MDPV处于同一大的遗传分支，但在VP3基因遗传进化上却与GPV处于同一大的遗传分支；与2015年感染樱桃谷鸭的新型GPV分离株差别较大，两者之间的基因组核苷酸同源性仅为85.4%，并处于不同的遗传进化分支[Wan C（万春和）, et al. Complete Genome Sequence of a NovelDuck Parvovirus Isolated in Fujian, China. Kafkas Univ Vet Fak, 2016, 22:971-975.）]。目前，检测N-GPV的实时荧光定量PCR方法的引物和探针均见有针对VP3基因设计(Wang J, et al. Development of a taqman-based real-time PCR assay for therapid and specific detection of novel duck- origin goose parvovirus. Mol CellProbes. 2017, 34: 56-58.和Niu X, et al. Development of a TaqMan-based real-time PCR assay for the detection of Novel GPV. J Virol Methods. 2016, 237:32-37.)，但由于N-MDPV在VP3基因上存在MDPV和GPV的长片段（3116-4249位）基因重组，使得基于VP3基因的检测N-GPV的TaqMan探针qPCR检测方法在检测半番鸭源病料时，由于N-MDPV的潜在交叉反应，可能会出现错误结果，影响对疫病的准确诊断和治疗。

本发明基于GenBank数据库中水禽细小病毒（MDPV、N-MDPV、GPV和N-GPV）的NS基因（NS基因在水禽细小病毒中的长度一致，均为1884bp，不存在缺失现象）特征，设计特异性的引物和探针，建立基于TaqMan探针检测GPV和N-GPV的实时荧光定量PCR方法，该方法对MDPV、N-MDPV无交叉反应，为后续开展GPV和N-GPV分子流行病学调查奠定基础，本发明的建立可填补相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一组GPV和N-GPV通用型检测引物和探针，该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，为后续开展GPV和N-GPV分子流行病学调查奠定基础。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一组GPV和N-GPV通用型检测引物和探针，所述引物和探针序列如下：

上游引物NGG-F：5’-TAGGGAGGAGTTAGAAGA-3’；

下游引物NGG-R：5’- CATCCATAGAATTGTCATAAGTA-3’ ；

所述探针NGG-P序列为： 5’-ACCTGGTAATTGTTCCTGCTTCTCT-3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

反应体系为：Probe qPCR Mix混合液12.5 μL、上/下游引物（NGG-F和NGG-R）（10 μmol/L） 各0.6 μL、探针（NGG-P）（10 μmol/L）1.2 μL、DNA模板1 μL、水（Nuclease-freeWater）补足至25 μL。

反应条件为：95℃ 30s 预变性；95℃ 5 s、58℃ 10s、72℃ 20s，共40个循环。

本发明的另一目的是提供所述的检测引物和探针在制备检测试剂盒中的应用。

本发明的有益效果：

1、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。

2、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中GPV（或N-GPV）的Ct值，直接对其感染进行准确定量。

3、灵敏度高：最低可检测50.2拷贝/μL。

4、特异性强：和水禽中的常见传染病[如MDPV、N-MDPV、鸭腺病毒A型（DAdV-A）、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌（E. coli）、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)]均未检测到扩增信号，仅对GPV（或N-GPV）检测出现荧光信号。

5、重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法的组内变异系数为0.61%-1.44%，组间变异系数0.67%-2.11%。

附图说明

图1 水禽细小病毒NS蛋白遗传进化分析。

图2敏感性试验，其中1-5： 5.02×10⁵ 拷贝/μL-5.02×10⁰ 拷贝/μL的标准品；6：阴性对照。

图3 实时荧光定量PCR的标准曲线。

图4 特异性试验；其中1：N-GPV；2：GPV；Controls：N-MDPV、MDPV、DAdV-A、DPV、E.coli、R.A.和P.M.等阴性试验对照。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、相关试验病原

1.1 试验用毒株

GPV、N-GPV由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定和保存。

1.2 试验对照毒株和菌株

半番鸭中常见核酸类型为DNA的病原，如MDPV、N-MDPV、鸭腺病毒A型（DAdV-A）、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌（E. coli）、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

、引物和探针的设计与分析

2.1 NS基因比较分析

对GenBank中上传的52株水禽细小病毒 [其中37株GPV（含14株N-GPV）和15株MDPV]NS基因序列进行核苷酸同源性比较。结果可见，MDPV相互之间的核苷酸同源性大于98.1%；GPV相互之间的核苷酸同源性大于93.3%；MDPV与GPV相互之间的核苷酸同源性大于81.0-83.4%。应用遗传进化软件MEGA 6.0绘制相互之间的遗传进化树，结果可见，15株MDPV在遗传进化上和GPV（含N-GPV）处于明显不同的分支；N-GPV在GPV分支内形成独立的遗传进化分支（图1）。

可见，MDPV和GPV（含N-GPV）的NS基因相互之间的核苷酸同源性较高，但也存在一定的差别；在遗传进化上也处于不同的遗传进化分支。上述结果为开展GPV（含N-GPV）特异性TaqMan的检测方法的引物和探针设计提供理论依据和设计基因靶区。

2.2 引物和探针的设计

根据NS基因的分析比对结果，设计针对GPV（含N-GPV）的特异性引物，

上游引物NGG-F：5’-TAGGGAGGAGTTAGAAGA-3’， NS基因位置：1554-1571；

下游引物NGG-R：5’- CATCCATAGAATTGTCATAAGTA-3’ ， NS基因位置：1689-1711；

所述探针NGG-P序列为： 5’-ACCTGGTAATTGTTCCTGCTTCTCT-3’， NS基因位置：1649-1673，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。引物和探针均在宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

表1 设计的引物和探针的比较分析

^b1表示和引物不同的变异以粗体和下划线表示。

^b2本研究中水禽细小病毒基因登陆号。GPV毒株仅标注变异的毒株，MDPV均见表格。

从表1可见，所设计的特异性上/下游引物仅存在个别变异[且不位于3’末端，覆盖了97.30%的GPV（含N-GPV）]，对GPV（含N-GPV）特异性强。从探针的特异性可见，仅存在个别点变异（且不位于3’末端，不影响探针的特异性），将其和MDPV进行对比分析可见，MDPV在该探针区域和GPV（含N-GPV）差异明显，表明本研究设计的引物特异性好。经NCBI数据库进行引物的Primer-BLAST分析。Primer-BLAST分析表明，本发明设计的相关引物和探针特异性强、无交叉干扰，符合试验设计预期。

实时荧光定量PCR检测方法的建立

3.1 阳性标准品的构建

利用NS的基因特征，利用Oligo 7 引物设计软件设计引物，上游引物GNSF1：5＇-ATACATATTGCACTACCTGATAC-3＇、下游引物GNSR1：5＇- TTATTGTTCATTTTCAGCATCATC-3＇，预期扩增片段大小为1417 bp。使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50 μL体系进行扩增，其中2×PCR Master Mix反应液 25 μL、上/下游引物（GNSF1/ GNSR1）（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1 μL、提取的核酸(GPV分离株 G7株)模板DNA 1 μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5 min后进入循环，94℃变性50s 、53℃退火35s、72 ℃延伸90s，35个循环结束后，72℃终延伸10 min。

PCR反应结束后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（GNSF1/GNSR1）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经Blast分析后，符合实验预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品（P-GNS）。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为5.02×10⁷ 拷贝/μL。经线性化酶切后，进行连续10倍倍比稀释，获得的浓度分别为5.02×10⁶ 拷贝/μL、5.02×10⁵ 拷贝/μL、5.02×10⁴ 拷贝/μL、5.02×10³ 拷贝/μL、5.02×10² 拷贝/μL、5.02×10¹ 拷贝/μL、5.02×10⁰ 拷贝/μL。

3.2 TaqMan实时荧光定量PCR反应条件优化

按照Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)试剂盒说明书配制25 μL的实时荧光定量PCR反应体系，筛选出的最佳反应体系为：Probe qPCR Mix混合液12.5 μL、上/下游引物（NGG-F和NGG-R）（10 μmol/L） 各0.6 μL、探针（NGG-P）（10 μmol/L）1.2 μL、DNA模板1 μL、水（Nuclease-free Water）补足至25 μL。最佳反应条件为：95℃ 30s 预变性；95℃ 5 s、58℃10s、72℃ 20s，共40个循环。

分别以标准品（P-GNS）含量为5.02×10⁵ 拷贝/μL-5.02×10⁰ 拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得本发明的最低检测限为50.2拷贝/μL（图2）。

分别以标准品（P-GNS）含量为5.02×10⁶ 拷贝/μL-5.02×10¹ 拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线，见图3）。获得实时荧光定量PCR标准曲线的线性方程的斜率为-3.337，相关系数为0.999，扩增效率为0.99，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。

3.3 特异性检测

用优化后的实时荧光定量PCR条件，分别对试验用病原GPV、N-GPV、新型番鸭细小病毒（N-MDPV）、番鸭细小病毒（MDPV）、鸭腺病毒A型（DAdV-A）、鸭瘟病毒(DPV)、鸭大肠杆菌（E.coli）、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)进行检测。结果可见（图4），仅对GPV和N-GPV出现阳性扩增，对N-MDPV、MDPV、DAdV-A、DPV、E. coli、R.A.和P.M.（图中的Controls）均未见阳性扩增信号。

3.4重复性试验

用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为5.02×10⁶拷贝/μL、5.02×10⁴拷贝/μL、5.02×10²拷贝/μL的标准品进行检测，每种质粒含量重复3次，计算组内（intra-group）变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于-20 ℃保存，每隔7d取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测3次，计算组间（inter-group）变异系数。建立的实时荧光定量PCR检测方法进行的组内变异系数为0.61%-1.44%，组间变异系数0.67%-2.11%，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

临床应用

使用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测的引物和探针的检测方法，对临床收集的30份番鸭泄殖腔棉拭子、30份半番鸭泄殖腔棉拭子、30份樱桃谷鸭和30份鹅泄殖腔棉拭子进行检测，并结合GPV和N-GPV致病特征的宿主差异（GPV对鹅和番鸭中致病；N-GPV对樱桃谷鸭和半番鸭致病；本次未收集到北京鸭材料），结果可见30份番鸭泄殖腔棉拭子检测到阳性样品2份，阳性率为6.67%，判定为GPV阳性；30份半番鸭泄殖腔棉拭子检测到阳性样品4份，阳性率为13.33%，判定为N-GPV阳性；30份樱桃谷鸭泄殖腔棉拭子检测到阳性样品3份，阳性率为10%，判定为N-GPV阳性；30份鹅泄殖腔棉拭子检测到阳性样品5份，阳性率为16.67%，判定为GPV阳性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一组GPV和N-GPV通用型检测引物和探针

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tagggaggag ttagaaga 18

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catccataga attgtcataa gta 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acctggtaat tgttcctgct tctct 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atacatattg cactacctga tac 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttattgttca ttttcagcat catc 24

Claims (2)

1.一组GPV和N-GPV通用型检测引物和探针，其特征在于，所述引物和探针序列如下：

上游引物NGG-F：5’-TAGGGAGGAGTTAGAAGA-3’；

下游引物NGG-R：5’- CATCCATAGAATTGTCATAAGTA-3’ ；

所述探针NGG-P序列为： 5’-ACCTGGTAATTGTTCCTGCTTCTCT-3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

2.如权利要求1所述的一组GPV和N-GPV通用型检测引物和探针在制备检测试剂盒中的应用。