CN116516064A - 鉴别mdgpv基因重组变异毒株、mdgpv弱毒疫苗毒株和gpv经典毒株的三重pcr引物组 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鉴别番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株的三重PCR引物组，包括三对特异性引物，分别具有如序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示的序列。发明人建立了相应的三重PCR检测方法，该法可以特异检测番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株，而与番鸭的其他重要病原无交叉反应。临床检测结果表明，本发明的引物特异性高、且片段小，敏感性高，可同时检测并区分MDGPV基因重组变异毒株、MDGPV弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株，为临床快速鉴别MDGPV及其流行病学调查提供了有效的技术平台。

Description

鉴别MDGPV基因重组变异毒株、MDGPV弱毒疫苗毒株和GPV经典 毒株的三重PCR引物组

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种鉴别番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株的三重PCR检测引物组及其试剂盒。

背景技术

鹅细小病毒(Goose parvoirus，GPV)是小鹅瘟的病原体，主要感染雏鹅，特点是传播迅速，死亡率高，严重危害水禽健康养殖。小鹅瘟是由GPV引起的雏鹅的一种急性、亚急性、败血性传染病，临床上该病主要发生于雏鹅，少见雏番鸭发病死亡的报道。自1997年以来在福建省莆田、福清等番鸭饲养区，发现在雏番鸭群中常出现不同程度腹泻、部分病鸭肠粘膜脱落形成栓塞为主要特征的疫病，发病率50％～70％、病死率40％～65％。番鸭小鹅瘟的病原为番鸭源鹅细小病毒(Muscovy duck-origin goose parvovirus，MDGPV)，是一种由经典鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)自然重组产生又有别于经典GPV的新毒株。

GPV为自主复制型病毒，只有当宿主细胞进入生长周期中的S期时，病毒才会利用宿主DNA聚合酶和其他细胞成分，在宿主细胞核内进行复制。GPV以及亲缘关系密切的MDPV均归类于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒亚科(Subfamily parvovirinae)依赖病毒属(Dependovirus)雁形目依赖细小病毒1(Anseriformdependoparvovirus 1)，是一种无囊膜的二十面体病毒，包含单链线性DNA基因组，含有正链DNA的病毒粒子和含有负链DNA链的病毒粒子数目相等。GPV基因组大小约为5.1kb，中间不连续编码区包含左、右2个开放阅读框分别转译非结构蛋白(Rep)和结构蛋白(VP)，两侧非编码区存在T形反向末端重复序列(ITR)，可以折叠形成回文发夹结构。5’-ITR包含一个末端解析位点(TRS)、Rep蛋白结合位点(RBS)和其他转录因子结合位点，可以用作病毒复制起点和包装信号。

1997年以来，番鸭小鹅瘟在福建省莆田、福清等地的番鸭饲养区暴发流行，目前全国各番鸭饲养区均有发生。临床上该疫病以雏番鸭发生腹泻、肠粘膜脱落形成栓塞为主要特征，发病率50～70％、病死率40～65％，给番鸭养殖业造成较大经济损失。当前，我国番鸭群中流行GPV毒株主要存在两种类型，即MDGPV基因重组变异株和GPV经典病毒株。GPV基因组变异最大的区域位于基因组3’末端非编码区回文序列下游。与可以同时感染多种水禽的GPV经典病毒分离株相比，MDGPV基因重组变异株的5’末端非编码区回文序列存在多处连续碱基缺失，影响了病毒在非免疫番鸭胚中复制与增殖。此外，研究显示在采集的疑似小鹅瘟临床样品中还存在与早期商品化弱毒疫苗株高度同源的地方流行病毒株。我们经病原分离鉴定已确认为番鸭小鹅瘟病毒(MDGPV)，并经细胞传代致弱选育出安全性好免疫原性强的弱毒株，可用于研制活疫苗预防该病。

当前我国番鸭群中广泛流行的GPV具有基因重组变异毒株为优势毒株、经典毒株并存的特点，再加上多种GPV弱毒株的广泛使用，使得临床上的GPV毒株错综复杂。常规检测方法如病毒分离、免疫组化、免疫荧光试验及常规PCR等并不能区分MDGPV毒株类型；基因测序是鉴定毒株类型的有效方式，但该方法操作复杂、消耗时间长、费用成本高。

我国目前尚无鉴别诊断MDGPV基因重组变异毒株、MDGPV弱毒疫苗毒株和GPV经典毒株的三重PCR方法。因此，有必要建立一种快速简便有效的MDGPV基因重组变异毒株、MDGPV弱毒疫苗毒株和GPV经典毒株的三重PCR鉴别检测方法。基于以上的研究和当前的需求，本研究根据MDGPV弱毒疫苗株5’-ITR区存在连续核苷酸缺失的特征，设计并合成了3对检测MDGPV的引物，采用三重PCR方法扩增5’-ITR基因片段，通过扩增片段的分子量大小，判断是MDGPV基因重组变异毒株、MDGPV弱毒疫苗毒株还是GPV经典毒株，从而特异、敏感、快速简便、低成本、有效地鉴别诊断MDGPV的毒株类型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株的三重PCR引物组及其试剂盒，用于番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株的快速鉴别检测。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种鉴别番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株的三重PCR检测引物组，包括三对特异性引物，分别是引物PTQD-F1和PTQD-R1、引物DRD-F2和DRD-R2、引物FJJD-F3和FJJD-R3，它们分别具有如序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6的碱基序列。建立的扩增体系中引物PTQD-F1和PTQD-R1、引物DRD-F2和DRD-R2、引物FJJD-F3和FJJD-R3的摩尔比为1∶1∶1∶1∶0.5∶0.5，所述引物如下：

PTQD-F1：CACGTGACCGGAACTTACG(SEQ ID NO.1)

PTQD-R1：TCCGGTGGGCTCCCAGACC(SEQ ID NO.2)

DRD-F2：GGAAGCACGTGACCGGAAC(SEQ ID NO.3)

DRD-R2：ATGAATGCAACCGGAAAAAGCTC(SEQ ID NO.4)

FJJD-F3：GCACATCCGGTGACGTAGT(SEQ ID NO.5)

FJJD-R3：CGCACATCCGGTGACGTAGT(SEQ ID NO.6)；

其中，引物PTQD-F1与PTQD-R1扩增番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异病毒株(MDGPV-PT)的5’-ITR基因片段。引物DRD-F2与DRD-R2扩增番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗株(MDGPV-D)的5’-ITR基因片段。引物FJJD-F3与FJJD－R3扩增鹅细小病毒经典病毒株(GPV-FJ)的5’-ITR基因片段。

一种鉴别番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。

所述的试剂盒，其三重PCR最佳反应体系(25μL)为：10×Advantage Genomic LABuffer(Mg²⁺)2.5μL，浓度均为20pmol/L的引物PTQD-F1、PTQD-R1、DRD-F2、DRD-R2各0.25μL，浓度均为20pmol/L的引物FJJD-F3、FJJD-R3各0.125μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，核酸模板3μL，Advantage Genomic LA Polymerase Mix 0.25μL，加DNase/RNase-free ddH2O补足至25μL。最佳反应条件为：95℃1min；95℃30s、55℃30s、72℃30s，共33个循环，72℃延伸5min。

所述试剂盒同时对番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株进行鉴别，其判定方法为：

测试扩增产物的电泳图，通过观察扩增产物电泳图是否包含相应病毒对应的预期条带，来判断临床样品是否为番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株的单一感染或混合感染；其中，番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株对应的预期目的片段大小为350bp，番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株对应的预期目的片段大小为165bp，鹅细小病毒经典毒株对应的预期目的片段大小为241bp。即所述的引物对PTQD-F1、PTQD-R1扩增番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异病毒株(MDGPV-PT)，预期目的片段大小为350bp，所述的引物对DRD-F2、DRD-R2扩增番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗株(MDGPV-D)，预期目的片段大小为165bp，所述的引物对FJJD-F3、FJJD-R3扩增鹅细小病毒经典病毒株(GPV-FJ)，预期目的片段大小为241bp。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

根据GenBank中公布的番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒PT株(MDGPV-PT)、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒D株(MDGPV-D)和鹅细小病毒经典毒株(GPV-FJ)的5’-ITR基因，设计合成三对特异性扩增引物，分别是引物PTQD-F1和PTQD-R1、引物DRD-F2和DRD-R2、引物FJJD-F3和FJJD-R3，它们分别具有如序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6的碱基序列，用以特异性扩增MDGPV/GPV 5’-ITR基因，通过目的片段的大小以判断MDGPV的毒株类型。MDGPV基因重组变异毒PT株扩增出1条目的条带，片段大小为350bp；MDGPV弱毒疫苗D株扩增出1条目的条带，片段大小为165bp；GPV经典毒FJ株扩增出1条目的条带，片段大小为241bp。

利用所述三重PCR检测引物组组装成的试剂盒简便快速，可同时对番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株进行鉴别检测。引物特异性高、且片段小，敏感性高，整个PCR过程可以在2h内完成，具有特异性强、敏感性高、重复性好等特点，对番鸭细小病毒(MDPV)，鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭副黏病毒(DPMV)，番鸭呼肠孤病毒(MDRV)，新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)，鸭瘟病毒(DPV)均无交叉反应。本发明建立的检测方法敏感性试验显示，对MDGPV-PT、MDGPV-D、GPV-FJ的最低检测限分别为9.3pg/μL、7.6pg/μL、3.4pg/μL。本发明利用所述三重PCR检测引物组建立的检测方法还具有良好的重复性。

利用该方法对2018-2019年采集的18份具有临床症状的番鸭组织样本进行检测。共检出MDGPV-PT阳性5份，GPV-FJ阳性1份，MDGPV-PT和GPV-FJ混合感染样品1份，MDGPV-D未检出阳性样品。利用本发明的引物组可用于番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株相应基因的鉴别检测，尤其适用于基层科研实验室的临床诊断，为番鸭小鹅瘟的流行病学及病原的鉴别诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。

附图说明

图1是具体实施方式中以优化的三重PCR方法扩增目的基因试验结果图，其中M：DNA分子质量标准；泳道1：番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒PT株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒D株和鹅细小病毒经典毒FJ株混合物；泳道2：番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒PT株；泳道3：番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒D株；泳道4：鹅细小病毒经典毒FJ株；泳道5：阴性对照。

图2是具体实施方式中以优化的三重PCR方法检测特异性试验结果图，其中M：DNA分子质量标准；1：番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒PT株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒D株和鹅细小病毒经典毒FJ株混合物；2：番鸭细小病毒；3：鸭坦布苏病毒；4：鸭副黏病毒；5：番鸭呼肠孤病毒；6：新型鸭呼肠孤病毒；7：鸭瘟病毒；8：阴性对照。

图3是具体实施方式中以优化的三重PCR方法检测敏感性试验结果图，番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒PT株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒D株和鹅细小病毒经典毒FJ株核酸DNA等体积混合，并用DNase/RNase-free ddH₂O将其10倍倍比稀释，共8个稀释梯度，其中M：DNA分子质量标准；泳道1～8稀释度分别为：1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8；泳道9：阴性对照。

图4是具体实施方式中以优化的三重PCR方法检测重复性试验结果图，其中M：DNA分子质量标准；泳道1～5：相同条件下的5次重复反应；泳道6：阴性对照。

图5是具体实施方式中以优化的三重PCR方法检测临床样品试验结果图，其中M：DNA分子质量标准；泳道1：阳性对照(番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒PT株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒D株和鹅细小病毒经典毒FJ株混合物)；泳道2～19：临床样品；泳道20：阴性对照。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

实施例1：

1材料与方法

1.1毒株

番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异病毒株(MDGPV-PT)、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗株(MDGPV-D)、鹅细小病毒经典病毒株(GPV-FJ)、番鸭细小病毒(MDPV)，鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭副黏病毒(DPMV)，番鸭呼肠孤病毒(MDRV)，新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)，鸭瘟病毒(DPV)均由本实验室保存提供。

1.2引物设计

参照GenBank中发表的MDGPV基因重组变异株PT(GenBankNo.KY511293)、MDGPV弱毒疫苗株D(OQ301813)与GPV经典株FJ(GenBankNo.KY511292)的基因序列，利用PrimerPremier软件按照引物设计原则设计特异性引物，引物信息见表1。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1引物序列

1.3病料处理

无菌采集2018-2019年番鸭养殖场疑似小鹅瘟感染病例的雏番鸭肝和脾组织，混合后在灭菌的预冷研钵内剪碎，用无菌PBS作1：5倍稀释成悬液，-70℃反复冻融3次。经8000r/min离心30min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，-20℃保存。

1.4病毒核酸提取

使用全式金Viral DNA/RNA Kit试剂盒提取病毒或组织匀浆样品核酸。提取的病毒核酸-20℃保存备用。

1.5单模板PCR检测方法的建立

(1)MDGPV-PT总反应体积为25μL，其中10×Advantage Genomic LA Buffer(Mg²⁺)2.5μL，10mmol/L dNTP 0.25μL，核酸模板1μL，引物PTQD-F1(20pmol/L)、PTQD-R1(20pmol/L)各0.5μL，Advantage Genomic LA Polymerase Mix 0.25μL，加DNase/RNase-free ddH₂O补足至25μL。按下列程序进行扩增反应：95℃预变性2min；95℃变性40s、53℃退火30s、72℃延伸30s，共33个循环，最后72℃延伸5min。用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

(2)MDGPV-D总反应体积为25μL，其中10×Advantage Genomic LABuffer(Mg²⁺)2.5μL，10mmol/L dNTP 0.25μL，核酸模板1μL，引物DRD-F2(20pmol/L)、DRD-R2(20pmol/L)各1μL，Advantage Genomic LAPolymerase Mix0.25μL，加DNase/RNase-free ddH₂O补足至25μL。按下列程序进行扩增反应：95℃预变性2min；95℃变性40s、56℃退火30s、72℃延伸30s，共33个循环，最后72℃延伸5min。用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

(3)GPV-FJ总反应体积为25μL，其中10×Advantage Genomic LA Buffer(Mg²⁺)2.5μL，10mmol/L dNTP 0.25μL，核酸模板1μL，引物FJJD-F3(20pmol/L)、FJJD-R3(20pmol/L)各1μL，Advantage Genomic LA Polymerase Mix0.25μL，加DNase/RNase-free ddH₂O补足至25μL。按下列程序进行扩增反应：95℃预变性2min；95℃变性40s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共33个循环，最后72℃延伸5min。用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.6三重PCR条件的优化

在单模板PCR基础上，对三重PCR反应体系(包括各引物的比例和浓度)和循环参数(包括退火温度和循环次数等)等条件进一步优化，确定三重PCR的最佳反应条件，并验证其特异性和敏感性。

1.7三重PCR特异性试验

分别提取番鸭细小病毒(MDPV)，鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭副黏病毒(DPMV)，番鸭呼肠孤病毒(MDRV)，新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)，鸭瘟病毒(DPV)基因组核酸，用设计的三重PCR检测引物组按已确定的条件进行PCR扩增。以MDGPV-PT、MDGPV-D和GPV-FJ株作阳性对照，以DNase/RNase-free ddH₂O作阴性对照，验证该方法的特异性。

1.8三重PCR敏感性试验

分别提取MDGPV基因重组变异病毒株、MDGPV弱毒疫苗株与GPV经典病毒株番鸭胚毒病毒液的DNA，用紫外分光光度计分别测定其浓度，然后将MDGPV基因重组变异病毒株(MDGPV-PT)、MDGPV弱毒疫苗株(MDGPV-D)和GPV经典病毒株(GPV-FJ)的核酸DNA等体积混合，并用DNase/RNase-free ddH₂O将其10倍倍比稀释，共8个稀释梯度，将10^-1～10^-8稀释的DNA作为模板，按确定的PCR最适反应条件进行PCR扩增，确定PCR敏感性。

1.9三重PCR方法的重复性

应用建立的三重PCR方法对MDGPV-PT+MDGPV-D+GPV-FJ的核酸样本进行5次重复试验，以验证三重PCR方法的稳定性。

1.10样品检测

应用本试验建立的三重PCR检测方法，对从某地区采集的18份疑似小鹅瘟自然感染的番鸭病料进行检测，同时设置阳性和阴性对照，根据电泳条带大小判断结果，采用测序方法对阳性样本进一步验证。

2结果

2.1三重PCR条件的优化

通过对PCR反应条件与试剂的优化，确定下列三重PCR的反应方法：25μL反应体系中加入浓度均为20pmol/L的引物PTQD-F1、PTQD-R1、DRD-F2、DRD-R2各0.25μL，浓度均为20pmol/L的引物FJJD-F3、FJJD-R3各0.125μL，10×Advantage Genomic LA Buffer(Mg²⁺)2.5μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，核酸模板3μL，Advantage Genomic LA Polymerase Mix0.25μL，加DNase/RNase-free ddH₂O补足至25μL。最佳反应条件为：95℃1min；95℃30s、55℃30s、72℃30s，共33个循环，72℃延伸5min。

采用优化的PCR反应条件，以MDGPV-PT、MDGPV-D、GPV-FJ混合核酸为模板，应用3对特异性引物进行扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，试验结果显示(见图1)，发现3条清晰的目的条带，大小分别为350bp、165bp、241bp，与预期条带大小相等。

2.2三重PCR的特异性试验

在优化的三重PCR条件下，该三重PCR可以从人工混合的3种病毒核酸模板中同时检测上述3条特异性扩增条带，且在番鸭细小病毒(MDPV)，鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭副黏病毒(DPMV)，番鸭呼肠孤病毒(MDRV)，新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)，鸭瘟病毒(DPV)、DNase/RNase-free ddH2O对照中未检测到特异性扩增条带，试验结果见图2。

2.3三重PCR的敏感性试验

用紫外分光光度计测量提取的病毒DNA含量：MDGPV-PT含量为9.33μg/μL，MDGPV-D含量为7.62μg/μL，GPV-FJ含量为3.44μg/μL。番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒PT株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒D株和鹅细小病毒经典毒FJ株核酸DNA等体积混合，并用DNase/RNase-free ddH₂O将其10倍倍比稀释，共8个稀释梯度，将10^-1～10^-8稀释的DNA作为模板，按确定的PCR最适反应条件进行PCR扩增，MDGPV-PT、MDGPV-D、GPV-FJ的最低检测限分别为9.3pg/μL、7.6pg/μL、3.4pg/μL，试验结果见图3。

2.4三重PCR方法的重复性试验

重复性实验结果显示，MDGPV-PT+MDGPV-D+GPV-FJ的核酸模板均能扩增与预期大小一致的目的条带，表明该三重PCR方法具有良好的重复性，试验结果见图4。

2.5临床样品的检测

在优化的三重PCR条件下，该三重PCR检测方法对2018-2019年采集的18份具有临床症状的番鸭组织样本进行检测。共检出MDGPV-PT阳性5份，GPV-FJ阳性1份，MDGPV-PT和GPV-FJ混合感染样品1份，MDGPV-D未检出阳性样品，与单模板PCR检测结果一致(见表2、图5)。试验结果表明，所建立的三重PCR检测方法能够用于MDGPV-PT、MDGPV-D和GPV-FJ临床样品的检测。

表2番鸭养殖场病料样品检测结果

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种鉴别番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株的三重PCR检测引物组，其特征在于：所述引物组的序列如下所示：

PTQD-F1：CACGTGACCGGAACTTACG，

PTQD-R1：TCCGGTGGGCTCCCAGACC；

DRD-F2：GGAAGCACGTGACCGGAAC，

DRD-R2：ATGAATGCAACCGGAAAAAGCTC；

FJJD-F3：GCACATCCGGTGACGTAGT，

FJJD-R3：CGCACATCCGGTGACGTAGT。

2.一种鉴别番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：其PCR反应体系为：

在25μL体系中含有以下成分：

10×Advantage Genomic LA Buffer(Mg²⁺)2.5μL，浓度均为20pmol/L的引物PTQD-F1、PTQD-R1、DRD-F2、DRD-R2各0.25μL，浓度均为20pmol/L的引物FJJD-F3、FJJD-R3各0.125μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，核酸模板3μL，Advantage Genomic LA Polymerase Mix 0.25μL，加DNase/RNase-free ddH₂O补足至25μL；

PCR反应条件为：95℃1min；95℃30s、55℃30s、72℃30s，共33个循环，72℃延伸5min。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒同时对番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株进行鉴别，其判定方法为：

测试扩增产物的电泳图，通过观察扩增产物电泳图是否包含相应病毒对应的预期条带，来判断临床样品是否为番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株、番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株和鹅细小病毒经典毒株的单一感染或混合感染；其中，番鸭小鹅瘟病毒基因重组变异毒株对应的预期目的片段大小为350bp，番鸭小鹅瘟病毒弱毒疫苗毒株对应的预期目的片段大小为165bp，鹅细小病毒经典毒株对应的预期目的片段大小为241bp。