CN101624636A - 传染性脾肾坏死病毒的lamp-lfd检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了传染性脾肾坏死病毒的LAMP－LFD检测方法，包括DPOL基因纯化克隆和测序步骤，设计三对LAMP的引物BIP、FIP、B3、F3、LF、LB和一条探针FITC－Probe步骤，其中FIP为5’端BIPO生物素标记引物，FITC－Probe为5’端FITC标记探针，配制含三对引物和样品模板的LAMP反应体系步骤，对LAMP反应体系扩增步骤，用探针杂交然后用LFD检测步骤，本发明具有比现有技术的PCR检测ISKNV的方法具有更高的特异性、灵敏度和便捷性，并且可以在于实际生产中现场应用检测，有利于控制鱼类养殖中传染性脾肾坏死病毒的传染和暴发。

Description

传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法

技术领域

本发明涉及传染性脾肾坏死病毒的检测方法，具体涉及传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法。

背景技术

虹彩病毒是一类对鱼类、两栖类和爬行类水生动物具有广泛感染性的致病病原，由其感染所致的疾病已成为世界水产养殖业的严重问题。根据国际病毒分类委员会(International Committee On Taxonomy of Viruses，ICTV)第八个病毒报告，传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)为虹彩病毒科细胞肿大病毒属代表种，是大型二十面体细胞质型线性双链DNA病毒，直径大小约为150nm。它能引起全身性、系统性地感染，对感病鱼的脾脏、肾脏等造血器官和组织造成严重破坏，导致病鱼贫血、多器官衰竭而死亡。ISKNV是许多重要养殖鱼类如鳜鱼、花鲈、大黄鱼及重要的观赏鱼类如蓝眼灯和丽丽鱼等的爆发性流行病的病原，这类病毒侵染鱼体流行快，极易引起鱼的暴发性死亡，给我国水产养殖业造成巨大经济损失。因此快速、准确、灵敏的检测ISKNV的新技术，对控制早期病毒感染、切断病毒传播，保障我国鱼类水产养殖业的健康持续发展具有重要意义。

目前公开的ISKNV检测方法的是采用PCR检测体系，实现了实验室条件下对ISKNV的简便、快速、敏感、特异检测。如授权公告号为CN11864359C，公告日为2005年1月26日，发明名称为鳜鱼传染性脾肾坏死病毒基因诊断试剂盒及检测方法，就公开了设计有二对引物的PCR反应液对样品模板进行PCR扩增反应检测。但PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)以及分子生物学专业实验人员操作，这只能在实验室条件下才可以检测，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。

环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本学者Notomi(2000年)发明的一种新式恒温核酸扩增技术。反应采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在恒温条件下(65℃左右)高效(30min～1h)扩增目标DNA。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料目测观察等方法。

横向流动试纸条(lateral flow dipstick，LFD)是一种新的检测方法，反应中FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。LFD检测无许特殊的设备，操作者只需将产物和试纸条浸入缓冲液，并且不需EB等有毒试剂，操作简便且更安全。LAMP-LFD结合技术的检测结果可以直接肉眼观察。LFD试纸条上具有控制带和检测带，两条带均显色表示检测结果为阳性，只有控制带显色检测带不显色表明检测结果为阴性。LAMP-LFD结合方法安全、快捷、高效、高灵敏度且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势。目前，该技术已被用于桃拉病毒(Taura syndrome virus，TSV)(Kiatpathomchai et al.，2008)，对虾白斑症病毒(White spot syndrome virus，WSSV)(Kiatpathomchai et al.，2008)，传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosis virus，IMNV)(Puthawibool et al.，2008)的检测，传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的检测未见报道。本发明第一次将LAMP技术和LFD技术结合并用于传染性脾肾坏死病毒的检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种应用环介导恒温扩增技术结合色谱横向流动试纸条检测传染性脾肾坏死病毒的方法，以实现对传染性脾肾坏死病毒进行快速、安全、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有用PCR检测传染性脾肾坏死病毒不能在生产中应用的问题。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案包括三个部分：1、提供3对用于检测传染性脾肾坏死病毒的LAMP引物序列，即长度分别为45bp、17bp、45bp、18bp、20bp和20bp的寡核苷酸序列，依次命名为DpoL-BIPNEW、Dpol-B3NEW、Dpol-FIPNEW、Dpol-F3NEW、DpolNew-LoopF和DpolNew-LoopB；2、配制LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对样品模板进行扩增，确定最佳的反应体系和反应条件；3、提供1条DNA探针序列FITC-Probe，长度为21bp，结合LFD技术对LAMP扩增结果进行分析。具体包括如下步骤：

1、DPOL基因克隆和测序：将ISKNV的DNA聚合酶(DPOL)基因克隆至pMD19-T得到重组质粒并进行测序分析，测得的ISKNV-DPOL基因的核苷酸序列如下：

1   ATGGATAGTG TGTACATCTA TCAGTGGCTC TATGCTAACT ATGAGGTGCG

51  TGGCTACGGC ATAGCCCCAA ACAACACTGT AGTGTGTGTT CGTGTGCCCA

101 ACTTTAAGCA AGTGGTGTAT GTCGAATGCA CCGACCCACA ACAGCATGAC

151 CCACGTTCCA CATTCACCCA GCACGGGTTC AGGGTCTATG AGACGCCCCG

201 GGCGTGTAGC CTGTATGGCG CAAAGGGGGT GGGCACATAC TTTGCCGCAC

251 GCGTGCCCAA CTACAATGCC ATGCGCGATG TACAGGAGAC ACAGGGTGCA

301 TTTAAGATAC ATGAGTCGCG TGTTAGCAAG ACGATGGAGT TCACAGCACG

351 CGCCGGCCTG CCGACCGTTG GCTGGATACA GGTGTCGCAG CGATGTGTGG

401 TGACGCGCAC TGTAACAATG GCAGCCAAAG AGTACATGGT GCCTAACTGG

451 CGTACCGATG TCAGGCCGGC CCCGGACATG GAGGGCGTGC CGCCGGCAAA

501 GATTGTTTAC TTTGACATTG AGGTCAAGTC CGACCATGAA AACGTGTTCC

551 CCAGTGACAG GGACGACGAG GTGATATTTC AGATAGGCCT GGTGCTGTGT

601 AGTGGCAACA CGGTGCTGCG CACTGACCTT CTCTCCTTGC CCGGCCGCGA

651  TTACGACGAC TCTGTGTACC AGTACGCCAC AGAAGGCGAG CTGCTGCACG

701  CATTCATAGC CTACATCAGG GAACACGAGG TGGTGGCTGT GTGTGGCTAC

751  AACATCATGG GCTTTGACAT ACCGTACATT ATCAAGAGGT GCGCACGCAC

801  CTCCATGCTG GGCACCCTCA GGCGCATCGG CTTTGATAAC CGCAGGCTGG

851  CCATAGAGAA GACGGCCGGT GTCGGCTACG CAAAGATGAC ATACATACAA

901  TGGGAAGGCG TCTTGACAAT AGATCTGATG CCCATTATCA TGATGGATCA

951  CAAGCTCGAC TCGTACAGCC TGGACTATGT GGCCAACCAC TTTGTCAAGG

1001 CGGGCAAGGA CCCCATTCGC CCCAGGGACA TCTTTCACGC CTATAACACG

1051 GGCATGATGG CACGCGTGGG GCGCTACTGT GTGAAGGACA CGCAGCTGTG

1101 CAAGCAACTG GTCGACTACC TCAATACGTG GGTGGCGCTG TGCGAGATGG

1151 CCGGCGTGTG TAACACATCC ATTATGCAAC TGTTTACCCA GGGCCAGCAG

1201 GTCCGGGTGT TTGCGCAGAT CTATCGTGAC TGCACGCCAA TGGACGTGGT

1251 CGACAAGGTG TATGTCATTC CGGATGGTGG CTGTGACTCG GATGTGGTGT

1301 CCCCTTCGTC ATATACGGGC GCATATGTGT ATGAGCCGGT GCCCGGCGTG

1351 TACAAGAACG TGATACCCAT GGACTTCCAG AGCCTGTATC CGAGCATCAT

1401 CATATCCAAG AACATATGCT ACAGCACCTT GGTGGACCAG GGCGGCGAAG

1451 AGTATGCGTG GCAAGAGCAC GAAGGCTGCG AGCACGACCC GCAGTATGCA

1501 AAACAACACG CCCTTGGCAT CGAGATTGGT GTCTTGCAAT GCAACATGGC

1551 AGCGCTTCCG CGACGCGCCA CCCAAGAGCG GGCCAGGCTG CGTGAGCGCA

1601 TAGCAGACAT GAAGATCCAG TATGCTAGCA TGACACCTGC GGCAGTCAAG

1651 TGTAACGTCT TCAGCTTCAG GTTCACGCAT GCTCACGAAG GCGTGCTGCC

1701 ACGTGTGCTC CGTAACCTGC TGGAGAGCAG GGCCCGCATA CGGGCGCGCA

1751 TCAAGACCAC AGACGACCCC GACATTAGGG CAGTTCTGGA CAAGAGGCAG

1801 CTGGCGTACA AGATAAGCGC CAACTCGGTG TACGGCACCA TGGGCACGCA

1851 GAGGGGCTAC CTGCCGTTTA TGGCGGGGGC AATGACGACG ACGTACTGTG

1901 GCCGCAAGCT GATTGAGAAG GCCGCTCATC TCCTTAAGAC GGTGGTGGGC

1951 GCTACCATTG TGTACGGCGA CACCGACTCG TGCTACATAC AGCTGGGCCA

2001 CGACCGCGCA TCACTCGATG AACTGTGGCA GATGGCCGTG AACGCCAGCG

2051 ACACCGTGTC GGCCTTCTTT GAGCGCCCGG TGCGCCTCGA GTTTGAGCAG

2101 TGCATCTACA CCAAGTTTAT CATCTTCACC AAGAAACGTT ATGTGTACAG

2151 GGCATTCACA CGCGACGGCA AGCAGCGAAC AGGCAGCAAG GGTGTGATGC

2201 TGTCCAGACG CGACAGCGCC ATGTGTGCCA GAAACACGTA TGCGGCAATC

2251 ATGAACACGA TCCTTGAGGG ATCTGCAGAT GTGCCGTTCA TTGCCGCGTG

2301 CATGATGCAC GACATGATGA TACCGGGAGC GCTTCAAGAC GACGACTTTG

2351 TGCTGACAAA GAGTGTGCAG GACATTGGCA ATGGGGACGA TAACAACCAG

2401 GGCTCGTACA AAGTCAGGAA TCCACAGAAG GCGCAGGCGG CGGCCACCCA

2451 AAGGGTAGCC CCGGACGATG CCGAAGGGTA CGCCATCGCG CTGCGGCAGG

2501 AAATGGTGAA GCAGATGCCT GCGCAGGCAC AATTGGCAGA GCGCATGAGA

2551 CTGCAGGGCC GCGCCGTGGT CAGTGGCGCT CGCATCGAGT ATGTCGTTCT

2601 TAAGCACCAA TATGGTGTGC CTGAGGGCGC CCTGGGGGCA AGGCTGTTGG

2651 ATTTTGAGCG GTGGCGCGAA ATGAAGGTGG CCTATCCACT GGATCGGCTG

2701 TACTACATGA AAAGTGTGGT CAACGCATGC GACCAGCTAC TTGTTACGGC

2751 CGGCTACGGG CCCGTGTGCA GCAAGGTATA TGCGGCGCAC TTACAGTTGG

2801 CGTACGTGCA CAAACAGTTA CTGAGACGCA CGACGCCTGC CGTATGA

2、设计LAMP的引物和探针：根据上述测序得到的ISKNV-DPOL基因的核苷酸序列设计下述LAMP的三对引物序列和一条探针序列：

BIP引物DpoL-BIPNEW：

5’-CATTGGCAAT GGGGACGATA ACTTTTGCCT TCTGTGGATT CCTGA-3’45

FIP引物Dpol-FIPNEW：

5’-CACGCGGCAA TGAACGGCAC ATTTTGCCAG AAACACGTAT GCGGC-3’45

B3引物Dpol-B3NEW：5’-GCTACCCTTT GGGTGGC-3’17

F3引物Dpol-F3NEW：5’-GACGCGACAG CGCCATGT-3’18

LF引物DpolNew-LoopF：5’-TCTGCAGATC CCTCAAGGAT-3’20

LB引物DpolNew-LoopB：5’-AACCAGGGCT CGTACAAAGT-3’20

探针FITC-Probe：5’-GATGCACGAC ATGATGATAC C-3’21

其中Dpol-FIPNEW为5’端BIPO生物素标记引物，FITC-Probe为5’端FITC标记探针；引物序列和探针序列分别与传染性脾肾坏死病毒的DNA聚合酶(DPOL)基因上相应位置核苷酸序列相同或者互补。

3、配制LAMP反应体系：反应体系的终浓度分别为：外引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6μmol/L，环引物LF和LB各0.4μmol/L，dNTPs 0.96mmol/L，Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO₄ 6.5mmol/L，(NH4)₂SO4 10mmol/L，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段(New EnglandBIPolabs)和1μL样品模板，加双蒸水使反应体系总体积为25μL。

4、LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为61-65℃，扩增反应时间为10-60min。

5、探针杂交和LFD检测：扩增后将20pmol的FITC-probe探针加入反应体系中，63℃温育5min，进行杂交，取8μL杂交液加入100μL buffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入取出的杂交液显色检测，判断横向流动试纸条检测LAMP的结果。

步骤4中所述的最适反应温度为65℃，最适反应时间为20min。

本发明所提供的传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法具有如下优点：

一、灵敏度高，对ISKNV的检测极限可低至＜10拷贝，对ISKNV的检测灵敏度比常规PCR高1000倍。

二、特异性强，所用的特异引物根据ISKNV的DNA聚合酶(DPOL)基因中的六个不同区域设计，又有DNA的特异性探针结合，特异性比常规PCR要强。

三、检测时间短，1h左右可获得检测结果，比常规PCR检测节省2-4h。

四、仪器设备要求低，不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个水浴锅就可以完成检测。

五、操作简单、结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作；检测结果清晰明显，直接用眼睛观察就可以判断。

六、对人和环境较安全，检测过程中不使用EB等有毒试剂，对人和环境非常安全。

综上所述，本发明具有比现有技术的PCR检测ISKNV的方法具有更高的特异性、灵敏度和便捷性，并且可以在于实际生产中现场应用检测，有利于控制鱼类养殖中传染性脾肾坏死病毒的传染和暴发。

附图说明

图1为传染性脾肾坏死病毒DPOL基因的LAMP引物和探针设计示意图；

图2为扩增反应温度对LAMP扩增的影响图；M：1kb DNA标准分子量(Fermentas公司)；1、2泳道为：61℃恒温条件下扩增结果；3、4泳道为：63℃恒温条件下扩增结果；5、6泳道为：65℃恒温条件下扩增结果；2、4、6泳道是以10^-3倍稀释的基因组DNA做模板；1、3、5泳道为无模板；

图3为反应时间对LAMP扩增的影响图；M：1kb DNA标准分子量(Fermentas公司)；2、3泳道为10min扩增结果；4、5泳道为20min扩增结果；6、7泳道为30min扩增结果；8、9泳道为40min扩增结果；1、10、11泳道为60min扩增结果；2、4、6、8、10泳道以10^-7倍稀释的基因组DNA做模板；3、5、7、9、11泳道以10^-3倍稀释的基因组DNA做模板；1泳道为无模板；

图4为LAMP-LFD结合技术检测ISKNV结果示意图；

图5为LAMP-AGE(a)、LAMP-LFD(b)和常规PCR(c)方法检测ISKNV的灵敏度比较电泳图；其中：图5(a)为LAMP-AGE电泳图，图5(b)为LAMP-LFD检测图，图5(c)为PCR电泳图；(a)1kb DNA标准分子量(Fermentas公司)；(c)PUC19/MSP/23DNA标准分子量(Fermentas公司)；1：无模板；2～10管模板分别为10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10，10^-11倍稀释的基因组DNA；

图6为LAMP-LFD的特异性实验结果图；M为：1kb DNA标准分子量(Fermentas公司)；1：无模板；2：传染性脾肾坏死病毒；3：对虾白斑综合症病毒；4：淋巴囊肿病病毒；5：鲤鱼春季病毒血症病毒。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

1、ISKNV DPOL基因的克隆及序列分析

1.1材料与方法

1.1.1材料

患病将死大黄鱼采自浙江省象山港海湾水产苗种繁育中心，大肠杆菌菌株TG₁由本室保存，pMD19-T Vector、rTaq DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，plasmid Mini kit购自OMEGA公司，QIAquick Gel Extraction试剂盒购自QIAGEN公司。

1.1.2方法

1.1.2.1病鱼组织基因组DNA提取

取自然患病大黄鱼脾组织约100mg于1mL无菌水中冰浴匀浆，1500×g 4℃离心10min，取上清加入等体积的裂解液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM EDTA，20μg/mLRNase，0.5％(w/v)SDS)，同时加入蛋白酶K使终浓度为100μg/mL，然后于55℃温育3h后氛氯仿抽提两次。-20℃乙醇沉淀30min，100uL双蒸水溶解-20℃保存待用。

1.1.2.2ISKNV DPOL基因的扩增及克隆测序

根据GenBank中传染性脾肾坏死病毒病毒基因组序列(登录号：AF371960)设计DPOL基因全长的PCR特异扩增引物：

ISKNV-DPOL(+)：5’-ATGGATAGTGTGTACATCTATC-3’，

ISKNV-DPOL(-)：5’-TCATACGGCAGGCGTCGTG-3’，

上述PCR特异扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成；PCR扩增反应为25μL体系，包含10mmol/L Tris-HCL(PH 8.3)，50mmol/L KCL，1.5mmol/L MgCL₂，0.8mmol/L dNTPs，0.2μmol/L引物ISKNV-DPOL(+)，0.2μmol/L引物ISKNV-DPOL(-)，模板DNA 1.0μL，5U/μL rTaq DNA聚合酶；反应经94℃预变性2min后，循环扩增30次：94℃变性30s，58℃复性30s，72℃反应30s，循环结束后72℃延伸反应10min；扩增产物经1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳分离后，预期大小的扩增条带用QIAquick Gel Extraction纯化克隆至pMD19-T载体；DPOL基因序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。

2、LAMP技术检测传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的方法的建立

2.1材料与方法

2.1.1材料

Bst DNA聚合酶大片段(含10×缓冲液)购自New England BIPolabs公司，dNTPs购自TaKaRa公司，LFD检测试纸条购自Milenia BIPotec GmbH公司。

2.1.2方法

2.1.2.1LAMP引物的设计

根据如图1所示的ISKNV-DPOL基因测序结果(登录号为：*****)，设计和筛选出下述LAMP的3对引物和一条探针，引物和探针的序列如下所示：

BIP：5’-CATTGGCAATGGGGACGATAACTTTTGCCTTCTGTGGATTCCTGA-3’

FIP：5’-CACGCGGCAATGAACGGCACATTTTGCCAGAAACACGTATGCGGC-3’

B3：5’-GCTACCCTTTGGGTGGC-3’

F3：5’-GACGCGACAGCGCCATGT-3’

LF：5’-TCTGCAGATCCCTCAAGGAT-3’

LB：5’-AACCAGGGCTCGTACAAAGT-3’

FITC-Probe：5’-GATGCACGAC ATGATGATAC C-3’

在引物FIP的5’端标记上生物素BIPO，在FITC-Probe的5’端标记上FITC，ISKNV的DPOL基因的LAMP扩增引物序列位置如图1所示。按照上述引物序列进行LAMP引物的合成(可由商业的DNA合成公司合成，如上海生工生物工程技术服务有限公司)。

2.1.2.2LAMP扩增条件的优化

LAMP检测反应所用的DNA模板可以用常规的组织核酸提取方法制备，也可以用商品化的组织DNA提取试剂盒制备。首先要配制具有最佳扩增效率和检测特异性的反应体系，本发明中的LAMP的反应体系为：20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，6.5mmol/L MgSO₄，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，0.96mmol/LdNTPs，1.6μmol/L Dpol-FIPNEW，1.6μmol/L DpoL-BIPNEW，0.2μmol/LDpol-F3NEW，0.2μmol/L Dpol-B3NEW，0.4μmol/L DpolNew-LoopF，0.4μmol/LDpolNew-LoopB，8U Bst DNA聚合酶(New England BIPoLabs公司)，基因组DNA模板1μL。按照上述体系要求配制反应混合物，混匀后分装到无菌Eppendorf管中(规格为200μL)，反应总体积为25μL。

在反应程序中，扩增温度过高或者过低均不利于LAMP反应获得最佳结果。本发明提供的引物和采用本发明确定的反应体系时，其扩增温度为61-65℃，扩增效率相当(如图2)，但由于温度高反应特异性好，较佳反应温度选为65℃。另外反应时间对反应产物的量也有较大的影响，在反应10min即可检测到反应产物(见图3)，但灵敏度较低，为保证LAMP反应的灵敏度，本发明中的较佳反应时间确定为20min。LAMP检测时，需将上述含有反应体系的Eppendorf管放入水浴锅中65℃温育20min。

2.1.2.3LAMP-LFD结合技术检测ISKNV方法的建立

生物素标记的LAMP扩增在本发明确定的反应体系和最佳反应条件下进行。反应体系终浓度分别为：引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物(5’BIPotin-labeled FIP和BIP)各1.6μmol/L，环引物LF和LB各0.4μmol/L，dNTPs 0.96mmol/L，Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO₄ 6.5mmol/L，(NH4)₂SO4 10mmol/L，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶(New England BIPolabs)，基因组DNA模板1μL，加双蒸水使反应体系总体积为25μL。将上述含有反应体系的Eppendorf管放入水浴锅中65℃温育20min，不终止反应。

2.1.2.4探针杂交和LFD检测

生物素标记的LAMP扩增结束后，不经过终止反应，将20pmol的FITC-probe探针序列加入反应体系中63℃温育5min杂交，取8μL杂交液加入100μL Buffer混匀，将LFD试纸条浸入其中，观察检测带是否显色。如果检测带显色表示该样品的传染性脾肾坏死病毒的检测结果为阳性，如果不显色表示该样品的传染性脾肾坏死病毒的检测结果为阴性(如图4所示)。

实施例2

用本发明的LAMP-LFD技术检测ISKNV的灵敏度测定

1、参照1.1.2.1的方法提取病鱼组织基因组DNA，参照文献Wang et al.(2005)测定其中病毒ISKNV的量并作10倍梯度稀释(10^-3相当于10⁸copies/μL)。

2、用LAMP-AGE方法、LAMP-LFD方法和PCR方法进行ISKNV检测比较灵敏度

2.1按照本发明提供的LAMP的三对引物和条探针结合LFD技术将上述梯度稀释后的基因组DNA(10^-3-10^-11倍)用作LAMP反应的模板进行扩增，用本发明提供的LFD方法分析LAMP的反应，结果见图5(b)。

2.2将上述梯度稀释的基因组DNA(10^-3-10^-11倍)用作LAMP-AGE的模板进行琼脂糖凝胶电泳试验，结果见图5(a)。

2.3将上述梯度稀释的基因组DNA(10^-3-10^-11倍)用作PCR反应的模板，利用上述DPOL基因的特异引物F3和B3进行扩增；反应体系为25μL：10mmol/LTris-HCL(PH 8.3)，50mmol/L KCL，1.5mmol/L MgCL₂，0.8mmol/L dNTPs，上下游引物各0.2μmol/L，5U/μL r Taq DNA聚合酶(Takara公司)1μL模板。94℃预变性2min后，循环扩增30次：94℃变性30s，58℃复性30s，72℃反应30s。循环结束后72℃延伸反应10min，2％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5(c)。

从图5(b)与图5(a)比较可以看出本发明提供的LAMP-LFD检测方法对ISKNV的检测极限可达10^-10，即相当于＜10个拷贝的病毒粒子，比LAMP扩增琼脂糖凝胶电泳(LAMP-AGE)灵敏度高10倍。

从图5(b)与图5(c)比较可以看出本发明提供的LAMP-LFD检测方法对ISKNV的检测极限可达10^-10，而PCR方法对ISKNV的检测极限为10^-7；可见本发明提供的传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法比PCR方法灵敏度高1000倍。

实施例3

用本发明的LAMP-LFD技术检测ISKNV的特异性测定

收集了不同相关度的DNA病毒4种：传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen andkidney necrosis virus)，对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus)，淋巴囊肿病病毒(Lymphocystis disease virus)，鲤鱼春季病毒血症病毒(spring viremia of carp virus)，提取基因组DNA，用本发明的LAMP-LFD检测方法对上述4种病毒进行检测，其中双蒸水作为阴性对照。结果显示见图6，说明本发明提供的ISKNV检测方法能保证对ISKNV的特异性检测，并不发生交叉反应。

实施例4

用本发明LAMP-LFD技术具体检测鱼体内的ISKNV

于浙江省象山港海湾水产苗种繁育中心收集大黄鱼样品15份，花鲈样品15份，根据以下步骤进行ISKNV病毒的检测。

1、制备待检样品的LAMP反应模板：

取待检鱼的脾脏组织0.5g，采用BIPospin Tissue Genomic DNA Extraction Kit(BIPoFlux公司)进行组织DNA的提取纯化，制备成用于LAMP反应的DNA样品模板。

2、配制LAMP反应体系

取上述制备的DNA样品模板1μL，加入如下反应体系中：引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物5’BIPotin-labeled FIP和BIP各1.6μmol/L，环引物LF和LB各0.4μmol/L，dNTPs 0.96mmol/L，Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO₄6.5mmol/L，(NH4)₂SO4 10mmol/L，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段，加入双蒸水使反应总体积达25μL。其中质粒pT-DPOL作为阳性对照，双蒸水作为阴性对照。

3、按照反应程序进行LAMP扩增反应，扩增反应温度为65℃扩增反应温育时间为20min。

4、判断LAMP检测结果：

LAMP扩增结束后，将20pmol的FITC-probe加入反应体系中63℃温育5min杂交，取8μL杂交液加入100μL Buffer混匀，将LFD试纸条浸入其中，观察检测带是否显色。如果检测带显色表示该样品的传染性脾肾坏死病毒的检测结果为阳性，如果不显色表示该样品的传染性脾肾坏死病毒的检测结果为阴性。

同时，上述检测结果PCR的检测结果进行比较，结果显示，经ISKNV的PCR检测方法确定为阳性的样品，LAMP检测方法均能检测到ISKNV的存在。

根据以上试验结果表明，LAMP-LFD结合技术能够为ISKNV提供简便、快速、灵敏的现场检测。

Claims (2)

1、传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)DPOL基因纯化克隆和测序：用母本质粒将ISKNV-的DNA聚合酶基因纯化克隆至重组质粒并进行ISKNV-DPOL基因测序分析，测得的ISKNV-DPOL基因的核苷酸序列如下：

1    ATGGATAGTG TGTACATCTA TCAGTGGCTC TATGCTAACT ATGAGGTGCG

51   TGGCTACGGC ATAGCCCCAA ACAACACTGT AGTGTGTGTT CGTGTGCCCA

101  ACTTTAAGCA AGTGGTGTAT GTCGAATGCA CCGACCCACA ACAGCATGAC

151  CCACGTTCCA CATTCACCCA GCACGGGTTC AGGGTCTATG AGACGCCCCG

201  GGCGTGTAGC CTGTATGGCG CAAAGGGGGT GGGCACATAC TTTGCCGCAC

251  GCGTGCCCAA CTACAATGCC ATGCGCGATG TACAGGAGAC ACAGGGTGCA

301  TTTAAGATAC ATGAGTCGCG TGTTAGCAAG ACGATGGAGT TCACAGCACG

351  CGCCGGCCTG CCGACCGTTG GCTGGATACA GGTGTCGCAG CGATGTGTGG

401  TGACGCGCAC TGTAACAATG GCAGCCAAAG AGTACATGGT GCCTAACTGG

451  CGTACCGATG TCAGGCCGGC CCCGGACATG GAGGGCGTGC CGCCGGCAAA

501  GATTGTTTAC TTTGACATTG AGGTCAAGTC CGACCATGAA AACGTGTTCC

551  CCAGTGACAG GGACGACGAG GTGATATTTC AGATAGGCCT GGTGCTGTGT

601  AGTGGCAACA CGGTGCTGCG CACTGACCTT CTCTCCTTGC CCGGCCGCGA

651  TTACGACGAC TCTGTGTACC AGTACGCCAC AGAAGGCGAG CTGCTGCACG

701  CATTCATAGC CTACATCAGG GAACACGAGG TGGTGGCTGT GTGTGGCTAC

751  AACATCATGG GCTTTGACAT ACCGTACATT ATCAAGAGGT GCGCACGCAC

801  CTCCATGCTG GGCACCCTCA GGCGCATCGG CTTTGATAAC CGCAGGCTGG

851  CCATAGAGAA GACGGCCGGT GTCGGCTACG CAAAGATGAC ATACATACAA

901  TGGGAAGGCG TCTTGACAAT AGATCTGATG CCCATTATCA TGATGGATCA

951  CAAGCTCGAC TCGTACAGCC TGGACTATGT GGCCAACCAC TTTGTCAAGG

1001 CGGGCAAGGA CCCCATTCGC CCCAGGGACA TCTTTCACGC CTATAACACG

1051 GGCATGATGG CACGCGTGGG GCGCTACTGT GTGAAGGACA CGCAGCTGTG

1101 CAAGCAACTG GTCGACTACC TCAATACGTG GGTGGCGCTG TGCGAGATGG

1151 CCGGCGTGTG TAACACATCC ATTATGCAAC TGTTTACCCA GGGCCAGCAG

1201 GTCCGGGTGT TTGCGCAGAT CTATCGTGAC TGCACGCCAA TGGACGTGGT

1251 CGACAAGGTG TATGTCATTC CGGATGGTGG CTGTGACTCG GATGTGGTGT

1301 CCCCTTCGTC ATATACGGGC GCATATGTGT ATGAGCCGGT GCCCGGCGTG

1351 TACAAGAACG TGATACCCAT GGACTTCCAG AGCCTGTATC CGAGCATCAT

1401 CATATCCAAG AACATATGCT ACAGCACCTT GGTGGACCAG GGCGGCGAAG

1451 AGTATGCGTG GCAAGAGCAC GAAGGCTGCG AGCACGACCC GCAGTATGCA

1501 AAACAACACG CCCTTGGCAT CGAGATTGGT GTCTTGCAAT GCAACATGGC

1551 AGCGCTTCCG CGACGCGCCA CCCAAGAGCG GGCCAGGCTG CGTGAGCGCA

1601 TAGCAGACAT GAAGATCCAG TATGCTAGCA TGACACCTGC GGCAGTCAAG

1651 TGTAACGTCT TCAGCTTCAG GTTCACGCAT GCTCACGAAG GCGTGCTGCC

1701 ACGTGTGCTC CGTAACCTGC TGGAGAGCAG GGCCCGCATA CGGGCGCGCA

1751 TCAAGACCAC AGACGACCCC GACATTAGGG CAGTTCTGGA CAAGAGGCAG

1801 CTGGCGTACA AGATAAGCGC CAACTCGGTG TACGGCACCA TGGGCACGCA

1851 GAGGGGCTAC CTGCCGTTTA TGGCGGGGGC AATGACGACG ACGTACTGTG

1901 GCCGCAAGCT GATTGAGAAG GCCGCTCATC TCCTTAAGAC GGTGGTGGGC

1951 GCTACCATTG TGTACGGCGA CACCGACTCG TGCTACATAC AGCTGGGCCA

2001 CGACCGCGCA TCACTCGATG AACTGTGGCA GATGGCCGTG AACGCCAGCG

2051 ACACCGTGTC GGCCTTCTTT GAGCGCCCGG TGCGCCTCGA GTTTGAGCAG

2101 TGCATCTACA CCAAGTTTAT CATCTTCACC AAGAAACGTT ATGTGTACAG

2151 GGCATTCACA CGCGACGGCA AGCAGCGAAC AGGCAGCAAG GGTGTGATGC

2201 TGTCCAGACG CGACAGCGCC ATGTGTGCCA GAAACACGTA TGCGGCAATC

2251 ATGAACACGA TCCTTGAGGG ATCTGCAGAT GTGCCGTTCA TTGCCGCGTG

2301 CATGATGCAC GACATGATGA TACCGGGAGC GCTTCAAGAC GACGACTTTG

2351 TGCTGACAAA GAGTGTGCAG GACATTGGCA ATGGGGACGA TAACAACCAG

2401 GGCTCGTACA AAGTCAGGAA TCCACAGAAG GCGCAGGCGG CGGCCACCCA

2451 AAGGGTAGCC CCGGACGATG CCGAAGGGTA CGCCATCGCG CTGCGGCAGG

2501 AAATGGTGAA GCAGATGCCT GCGCAGGCAC AATTGGCAGA GCGCATGAGA

2551 CTGCAGGGCC GCGCCGTGGT CAGTGGCGCT CGCATCGAGT ATGTCGTTCT

2601 TAAGCACCAA TATGGTGTGC CTGAGGGCGC CCTGGGGGCA AGGCTGTTGG

2651 ATTTTGAGCG GTGGCGCGAA ATGAAGGTGG CCTATCCACT GGATCGGCTG

2701 TACTACATGA AAAGTGTGGT CAACGCATGC GACCAGCTAC TTGTTACGGC

2751 CGGCTACGGG CCCGTGTGCA GCAAGGTATA TGCGGCGCAC TTACAGTTGG

2801 CGTACGTGCA CAAACAGTTA CTGAGACGCA CGACGCCTGC CGTATGA

(2)设计LAMP的引物和探针：根据上述测序得到的ISKNV-DPOL基因的核苷酸序列进行设计下述LAMP的三对引物序列和一条探针序列：

BIP引物：5’-CATTGGCAAT GGGGACGATA ACTTTTGCCT TCTGTGGATT CCTGA-3’45

FIP引物：5’-CACGCGGCAA TGAACGGCAC ATTTTGCCAG AAACACGTAT GCGGC-3’45

B3引物：5’-GCTACCCTTT GGGTGGC-3’17

F3引物：5’-GACGCGACAG CGCCATGT-3’18

LF引物：5’-TCTGCAGATC CCTCAAGGAT-3’20

LB引物：5’-AACCAGGGCT CGTACAAAGT-3’20

FITC-Probe探针：5’-GATGCACGAC ATGATGATAC C-3’21

其中FIP为5’端BIPO生物素标记引物，FITC-Probe为5’端FITC标记探针；

(3)配制LAMP反应体系：反应体系的终浓度分别为：外引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6μmol/L，环引物LF和LB各0.4μmol/L，dNTPs0.96mmol/L，Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO₄ 6.5mmol/L，(NH4)₂SO4 10mmol/L，0.1％ Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段(NeW EnglandBIPolabs)和1μL样品模板，加双蒸水使反应体系总体积为25μL；

(4)LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为61-65℃，扩增反应时间为10-60min。

(5)探针杂交和LFD检测：扩增后将20pmol的FITC-probe探针加入反应体系中，63℃温育5min，进行杂交，取8μL杂交液加入100μL buffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入取出的杂交液显色检测，判断横向流动试纸条检测LAMP的结果。

2、如权利要求1所述的传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法，其特征在于步骤4中所述的最适反应温度为65℃，最适反应时间为20min。

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