CN1186459C - 鳜鱼传染性脾肾坏死病毒基因诊断试剂盒及检测方法 - Google Patents

鳜鱼传染性脾肾坏死病毒基因诊断试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV，Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus)的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测方法是以根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒基因保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对传染性脾肾坏死病毒的特异性DNA核酸片段进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高。可运用于鳜鱼各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。

Description

鳜鱼传染性脾肾坏死病毒基因诊断试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及水生经济动物病害的诊断试剂盒及检测方法，主要是针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV，Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus)基因诊断的试剂盒及检测方法。
背景技术
鳜鱼是我国名优淡水养殖品种。随着鳜鱼人工繁殖和育苗技术的成功，鳜鱼养殖业得到较快发展，与此同时病害问题也日益严重。鳜鱼病害主要有病毒病、细菌病和寄生虫病。其中，病毒病流行快、发病率高，并且目前尚无有效控制措施，严重影响鳜鱼养殖业的发展。近年来，养殖鳜鱼发生大面积的暴发性流行病，导致鳜鱼大量死亡，造成严重的损失。目前对于鳜鱼病毒病还未有特效的治疗方法，推行鳜鱼的健康养殖是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速检测。目前对于鳜鱼病毒的检测方法主要包括传统组织学方法、电子显微技术、生物指示法、生化检测法、免疫学方法(主要有荧光抗体技术、酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫电镜技术、细胞培养方法、分子生物学方法(主要有分子杂交方法、聚合酶链式反应(PCR))等。这些检测方法有些对技术条件要求高，检测时间长，有些所需要的材料制备麻烦，费用高，有些方法灵敏度不高，特异性不强，因此广大养殖户掌握关键的技术难度很大，难以推广，限制了这些技术的应用和发展。
早期快速诊断鳜鱼传染性脾肾坏死病毒是目前鳜鱼养殖的主要预防措施和减少鳜鱼损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大水产养殖者急切盼望的。
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快被应用于实践中。
发明内容
本发明的目的是利用ISKNV基因保守区序列设计两对引物，建立ISKNV套式PCR反应体系，在此基础上优化和设计，提供鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒可批量生产，操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高。可运用于鳜鱼各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
本发明的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的基因诊断试剂盒由下列部件构成：
1).样品稀释液A液，2管，内装磷酸缓冲液(1×PBS)，pH7.4；
2).模板抽提液B液，1管，内装酚/氯仿/异戊醇，比例为25∶24∶1；
3).C液，1管，内装5M NaCL；
4).D液，1管，内装无水乙醇；
5).E液，1管，内装70％乙醇；
6).F液，1管，内装灭菌双蒸水；
7).PCR反应液G液，1管，内装PCR一扩反应液，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE；
8).PCR反应液H液，1管，内装PCR二扩反应液，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、内引物F2、内引物R2和TaqE；
9).阳性对照I液，1管，内装ISKNV阳性DNA；
10).盒子；
11).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。
上述ISKNV基因诊断试剂盒中所述的内外两对引物是根据ISKNV基因保守区序列设计的，其DNA序列分别如下：
F1：5’-AGA CCC ACT TGT ACG GCG
R1：5’-CCC ATG TCC AAC GTA TAG C
F2：5’-CGT GAG ACC GTG CGT AGT
R2：5’-AGG GTG ACG GTC GAT ATG
用本发明上述试剂盒检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的方法，按下列步骤进行：
1).取待测样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆；
2).4000～6000r/min离心10～15min；
3).取上清600μl用模板抽提液B液抽提，上下颠倒几次混匀；
4).10000～12000r/min离心10～15min；
5).取500ul上清加入20μl C液，再加入1mlD液，于-20℃沉淀1小时；
6).10000～12000r/min离心10～15min；
7).弃上清，加E液冲洗，10000～12000r/min离心5～10min，冲洗两次；
8).弃上清，自然干燥或在超净工作台上吹干；
9).加20～30μlF液重悬溶解作为模板；
10).分别取模板和I液2μl，加入到PCR反应液(G液)中，混匀后离心数秒，置于PCR上；
11).按下列条件扩增：
95℃2min预变性，→94℃30sec  30个循环→72℃10mm→4℃保存
                  55℃30sec
                  72℃1min
12).分别取一扩反应液，加入到PCR反应液H液中，混匀后离心数秒，置于PCR上。按上述条件扩增；
13).一扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在1080bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为ISKNV阳性，说明待测样品携带传染性脾肾坏死病毒，若无反应条带显示则进行PCR二扩反应。二扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在562bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为ISKNV阳性，说明待测样品携带传染性脾肾坏死病毒，否则为阴性。
本发明的有益效果：
本发明的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的基因诊断试剂盒及检测方法，是以根据ISKNV基因保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。利用该两对引物，可以特异性地扩增携带ISKNV病毒的待测样品的有关基因片段，所建立的优化的套式PCR反应体系保证检测结果的快速性、准确性和稳定性。因此使用本发明的试剂盒及检测方法，可以简便、快速、灵敏而特异地检测感染ISKNV的鳜鱼，大大高于传统和常规的生物学方法，可运用于鳜鱼各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
附图说明
图1是感染鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的鳜鱼样品的PCR一扩和二扩检测结果。其中M：DNA分子量标准；1：一扩反应阳性结果；2：一扩反应阴性结果；3：二扩反应阳性结果；4：二扩反应阴性结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的基因诊断试剂盒
该试剂盒由下列部件构成(10样份)；
1.释液(A液)，2管，5ml/管，内装磷酸缓冲液(1×PBS)，pH7.4。
2.模板抽提液(B液)，自备或配制，酚/氯仿/异戊醇，比例为25∶24∶1。
3.C液，1管，200μl/管，内装5M NaCL。
4.D液，自备，1ml/份×10份，10ml，主要为无水乙醇。
5.E液，自备，主要为70％乙醇。
6.F液，1管，30μl/份×10份，300μl/管，内装灭菌双蒸水。
7.PCR反应液(G液)，1管，25μl/份×10份，250μl/管，内装PCR一扩反应液(25μl体系)，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE。
8.PCR反应液(H液)，1管，25μl/份×10份，250μl/管，内装PCR二扩反应液(25μl体系)，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、内引物F2、内引物R2和TaqE。
9.阳性对照(I液)，1管，20μl/管，内装ISKNV阳性DNA。
10.长方体盒子，8.5×5.8×6.2cm3。
11.一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四个孔，孔径1.3cm，第二排五个孔，孔径1.0cm，第三、四排分别六个孔，孔径0.6cm。上述各小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于长方体盒子中。
该试剂盒中的内外两对引物的DNA序列如下：
F1：5’-AGA CCC ACT TGT ACG GCG
R1：5’-CCC ATG TCC AAC GTA TAG C
F2：5’-CGT GAG ACC GTG CGT AGT
R2：5’-AGG GTG ACG GTC GAT ATG
该试剂盒中的I液为阳性对照液，包含ISKNV病毒的DNA质粒标准。具体操作是在PCR反应后，用试剂盒回收相关片段，然后酶切，通过载体连接到质粒上，转入大肠杆菌E.coli，经氨苄培养基平板扩大培养，挑取阳性克隆，进一步酶切检查验证，测定质粒DNA的浓度，稀释到106比例即为阳性对照标准。
PCR一扩反应液体系(25μl体系)如下：
ddH2O                           20μl
10×Buffer(含mg2+)              2.5μl
dNTP                             0.4μl
外引物F1                         0.4μl
外引物R1                         0.4μl
TaqE                             0.3μl
PCR二扩反应液体系(25μl体系)如下：
ddH2O                           20μl
10×Buffer(含mg2+)              2.5μl
dNTP                             0.4μl
内引物F2                         0.4μl
内引物R2                         0.4μl
TaqE                             0.3μl
实施例2：鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的检测方法
使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行：
1.待测样品0.1g，加入样品稀释液(A液)1ml稀释10倍，于匀浆器中冰浴匀浆。
2.4000r/min离心10min。
3.取上清600μl/用模板抽提液(B液)抽提，上下颠倒几次混匀。
4.12000r/min离心10min。
5.取500ul上清加入20μl/C液，再加入1mlD液，于-20℃沉淀1小时。
6.12000r/min离心10min。
7.弃上清，加E液冲洗，12000r/min离心5min，冲洗两次。
8.弃上清，自然干燥或在超净工作台上吹干。
9.加20～30μlF液重悬溶解作为模板。
10.分别取模板和I液2μl，加入到PCR反应液(G液)中，混匀后离心数秒，置于PCR上。
11.按下列条件扩增：
95℃2min预变性，→94℃30sec  30个循环→72℃10min→4℃保存
                  55℃30sec
                  72℃1min
12.分别取一扩反应液2μl，加入到PCR反应液(H液)中，混匀后离心数秒，置于PCR上。按上述条件扩增。
13.一扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在1080bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为ISKNV阳性，说明待测样品携带传染性脾肾坏死病毒，若无反应条带显示则进行PCR二扩反应。二扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在562bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为ISKNV阳性，说明待测样品携带传染性脾肾坏死病毒，否则为阴性(见图1)。

Claims (2)

1.一种鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的基因诊断试剂盒，其特征是该试剂盒包括下列部件：
1).样品稀释液A液，2管，内装磷酸缓冲液，pH7.4；
2).模板抽提液B液，1管，内装酚/氯仿/异戊醇，比例为25∶24∶1；
3).C液，1管，内装5M NaCL；
4).D液，1管，内装无水乙醇；
5).E液，1管，内装70％乙醇；
6).F液，1管，内装灭菌双蒸水；
7).PCR反应液G液，1管，内装PCR一扩反应液，包括ddH2O、含mg2+的10×Buffer、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE；F1为：5’-AGA CCC ACT TGT ACG GCG，R1为：5’-CCC ATGTCC AAC GTA TAG C；
8).PCR反应液H液，1管，内装PCR二扩反应液，包括ddH2O、含mg2+的10×Buffer、dNTP、内引物F2、内引物R2和TaqE；F2为：5’-CGT GAGACC GTG CGT AGT，R2：5’-AGG GTGACG GTC GAT ATG；
9).阳性对照I液，1管，内装ISKNV阳性DNA；
10).盒子；
11).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。
2.一种检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的方法，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行：
1).取待测样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆；
2).4000～6000r/min离心10～15min；
3).取上清600μl用模板抽提液B液抽提，上下颠倒几次混匀；
4).10000～12000r/min离心10～15min；
5).取500ul上清加入20μl C液，再加入1ml D液，于-20℃沉淀1小时；
6).10000～12000r/min离心10～15min；
7).弃上清，加E液冲洗，10000～12000r/min离心5～10min，冲洗两次；
8).弃上清，自然干燥或在超净工作台上吹干；
9).加20～30μl F液重悬溶解作为模板；
10).分别取模板和I液，加入到PCR反应液G液中，混匀后离心数秒，置于PCR上；
11).按下列条件扩增：
95℃ 2min预变性，→94℃ 30sec  30个循环→72℃ 10min→4℃保存
                   55℃ 30sec
               72℃ 1mm
12).分别取一扩反应液，加入到PCR反应液H液中，混匀后离心数秒，置于PCR上，按上述条件扩增；
13).一扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在1080bp处出现明亮的反应条带，则为ISKNV阳性，说明待测样品携带传染性脾肾坏死病毒，若无反应条带显示则进行PCR二扩反应；二扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在562bp处出现明亮的反应条带，则为ISKNV阳性，说明待测样品携带传染性脾肾坏死病毒，否则为阴性。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101906488A (zh) * 2010-08-09 2010-12-08 宁波大学 传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100365131C (zh) * 2005-04-12 2008-01-30 中华人民共和国连云港出入境检验检疫局 一种同步检测三种鱼病病毒的试剂盒及其检测方法
CN101530613B (zh) * 2009-04-17 2012-02-01 中山大学 传染性脾肾坏病毒疫苗及其制备方法和应用
CN101624636B (zh) * 2009-06-12 2012-06-20 宁波大学 传染性脾肾坏死病毒的lamp-lfd检测方法
CN101956022B (zh) * 2010-08-17 2011-12-28 中国检验检疫科学研究院 传染性脾肾坏死病毒Nest-PCR的检测方法及其试剂盒
CN102240399B (zh) * 2011-07-09 2013-06-19 中国水产科学研究院珠江水产研究所 鳜传染性脾肾坏死病毒（isknv）orf093蛋白的应用
CN104694483B (zh) * 2015-02-11 2018-05-04 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种鳜传染性脾肾坏死病毒isknv的增殖方法
CN109762940A (zh) * 2019-02-02 2019-05-17 中国水产科学研究院珠江水产研究所 用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的引物组及试剂盒
CN111518957A (zh) * 2020-05-27 2020-08-11 电子科技大学中山学院 一种鳜鱼传染性脾肾坏死病pcr快速检测试剂盒及方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101906488A (zh) * 2010-08-09 2010-12-08 宁波大学 传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法
CN101906488B (zh) * 2010-08-09 2012-10-24 宁波大学 传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法

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