CN108676917B

CN108676917B - 一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米PCR检测方法

Info

Publication number: CN108676917B
Application number: CN201810569666.7A
Authority: CN
Inventors: 崔尚金; 秦彤
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2018-06-05
Filing date: 2018-06-05
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2038-06-05
Also published as: CN108676917A

Abstract

本发明公开了一种鉴别CCoVⅠ和CCoVⅡ的nanoRT‑PCR检测方法。通过对nanoRT‑PCR反应体系的引物、退火温度和引物浓度进行优化，获得CCoVⅠ和CCoVⅡ各自的目的条带的高效扩增，同时避免引物间的非特异性扩增；本发明所述nanoRT‑PCR检测方法的最低核酸检测量比普通RT‑PCR高100倍，且通过nanoRT‑PCR扩增得到与预期片段大小一致且序列完全正确的产物。本发明提供的用于鉴别CCoVⅠ和CCoVⅡ的nanoRT‑PCR方法具有极高的灵敏度和特异性，是一种高效的检测手段，可应用于犬冠状病毒病的流行性调查，同时也为CCoV的鉴定和防控奠定基础，具有重大的实际意义和价值。

Description

一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米PCR检测方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米RT-PCR检测方法及其应用。

背景技术

犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCoV)是引起犬胃肠炎的主要病原之一，一般引起幼龄犬发生非致死性的轻度腹泻，呈现高发病率、低死亡率的特点，当与其他肠道病原混合感染时，能导致患病动物高死亡率。近年来，随着CCoV高致病性的变异毒株在欧洲国家陆续报道，该病再一次引起了广泛的关注[1-2]。

CCoV为单股正链RNA病毒，属套式病毒目、α冠状病毒科、α冠状病毒属[3]。近年来检测到CCoV有不同的基因型，分为CCoV I型(CCoVI)和CCoVⅡ型(CCoVII)[4]。CCoVⅡ是自1971年以来已知的最早的基因型[5]，由于CCoVI尚未适应体外生长，不能通过细胞培养分离得到，依靠分子方法才在30年后被发现[6]。CCoV基因组序列包括10个开放阅读框，从5′到3′依次编码1a、1b、纤突蛋白、小膜蛋白、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白以及许多假定的非结构蛋白。对CCoV M基因的氨基酸序列进行比对分析，在CCoVⅡ跨膜区和羧基末端，只有少数分散的替换，而CCoV I的M蛋白中发生许多类似于猫冠状病毒典型残基的替换，基于此可以区分I型和Ⅱ型[7]。由于冠状病毒不仅在宿主中易突变，而且在病毒间也易发生基因重组，从而导致近年来新变异株不断出现。另外，CCoVI和CCoVⅡ的感染在临床诊断上是无法区分的，只能依靠生物技术对其进行序列分析后才能得到鉴别，所以建立一个简便有效、特异性高和灵敏性强的检测方法很有必要。

目前，检测CCoV的技术主要有普通RT-PCR、核酸探针、荧光定量RT-PCR及ELISA等：(1)RT-PCR是比较常见的技术，但其缺陷在于敏感性不显著；(2)核酸探针技术费用较高，不适用于大批量样本的检测；(3)荧光定量RT-PCR的敏感性和准确性高于普通RT-PCR，但其实施需要昂贵的实时荧光定量PCR仪，在二三线城市的动物诊所或实验室难以普及推广；(4)间接ELISA法对样品的要求比较高，且操作程序复杂，耗时长。以上这些缺点限制了上述方法在临床诊断中的应用。

纳米PCR是一种敏感、便捷的新型PCR技术，其原理是在纳米PCR缓冲液中添加了粒径为1nm～100nm的纳米金属颗粒，当反应时产生具有超强导电性的纳米流体，从而加快温度升高和下降的速度，减少在非目标温度的停留时间，因而减少了反应非特异性扩增，同时提高了扩增效率和敏感性。该方法目前仍未适用于犬科病毒，尤其是CCoVI和CCoVII的鉴定检测当中。

参考文献：

[1]Zicola A，Jolly S，Mathijs E，et al.Fatal outbreaks in dogsassociated with pantropic canine coronavirus in France and Belgium[J].SmallAnim.Pract，2012，53:297–300.18.

[2]Decaro N，Cordonnier N，Demeter Z，et al.European surveillance forpantropic canine coronavirus[J].Clin Microbiol，2013，51(1):83–88.

[3]King AMQ，Adams MJ，Carstens EB，et al.2012.Virustaxonomy:classification and nomenclature of viruses.Ninth report of theInternationalCommittee on Taxonomy of Viruses.Elsevier AcademicPress，San Diego，CA.

[4]Decaro N，Buonavoglia C.An update on canine coronaviruses:viralevolution and pathobiology[J].Vet Microbiol，2008，132:221–234

[5]Binn，L.N.，Lazar，E.C.，Keenan，K.P.，et al.Recovery andcharacterization of a coronavirus from military dogs withdiarrhea.Proc.Annu.Meet.U.S.Anim.Health Assoc，1974，78，359–366.

[6]Pratelli，A.，Martella，V.，Decaro，N.，et al.Genetic diversity of acanine coronavirus detected inpups with diarrhoea in Italy[J].J.Virol.Methods，2003，110，9–17.

[7]Pratelli，A.，V.Martella，M.Pistello，G.Elia，N，et al.Identification ofcoronaviruses in dogs that segregate separately from the canine coronavirusgenotype[J].J.Virol.Methods，2003，107:213–222.

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷和不足，本发明旨在建立一种快速、灵敏、特异的纳米PCR检测技术，用于犬冠状病毒病的早期检测与鉴定。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

本发明提供了一种鉴别CCoVI和/或CCoVII的纳米PCR检测方法，所述方法使用引物CCoVⅠ-F(SEQ ID NO.1)和CCoVⅠ-R(SEQ ID NO.2)扩增CCoVI特异性片段，使用引物CCoVⅡ-F(SEQ ID NO.3)和CCoVⅡ-R(SEQ ID NO.4)扩增CCoVII特异性片段；扩增反应的退火温度为48℃；引物添加量分别为1.0μL/20μL反应体系，引物浓度为10μM。

进一步的，所述纳米PCR检测方法包括如下步骤：

1)抽提样品DNA或RNA，并将RNA反转录为cDNA，获得扩增模板；

2)配制反应体系如下：2×nano PCR Buffer，10μL；CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R各1.0μL，扩增模板各0.5-1μL；Taq DNA聚合酶2.5U；ddH₂O加至20μL；

3)PCR反应条件为：95℃、3min；95℃、30s，48℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃10min。

进一步的，所述纳米PCR检测方法还包括琼脂糖凝胶检测步骤。

进一步的，所述纳米PCR检测方法，优选为双重纳米PCR检测方法。

本发明提供了一种上述纳米PCR检测方法在鉴别、诊断、和/或预防控制犬冠状病毒病中的应用。

本发明提供了一种上述纳米PCR检测方法在犬冠状病毒病的流行性调查中的应用。

本发明所述“应用”，即可表示治疗目的的应用，也可表示非治疗目的的应用，例如，科学研究等。

本发明的有益效果是：

1、本发明对nanoRT-PCR反应体系的引物、退火温度和引物浓度进行优化，以便CCoVⅠ和CCoVⅡ各自的目的条带都得到高效扩增，同时避免引物间的非特异性扩增。

2、本发明nanoRT-PCR检测方法的最低核酸检测量比普通RT-PCR最低核酸检测量高出100倍，具有良好的灵敏度。

3、本发明nanoRT-PCR扩增得到与预期的片段大小一致且特异的产物，克隆测序验证100％准确，本发明所述方法准确性极高。

4、本发明所述方法可用于CCoVⅠ和CCoVⅡ混合感染的鉴别检测，一步完成，操作简便快捷。

综上，本发明提供的用于鉴别CCoVⅠ和CCoVⅡ的nanoRT-PCR方法具有极高的灵敏度和特异性，是一种高效的检测手段，可应用于犬冠状病毒病的流行性调查，同时也为CCoV的鉴定和防控奠定基础。

附图说明

图1.CCoVⅠ和CCoVⅡRT-PCR扩增目的基因的琼脂糖凝胶电泳检测：M:Trans 2KPlus DNA Marker；1:CCoVⅠ目的基因；2:CCoVⅡ目的基因；3:CCoVⅠ+CCoVⅡ目的基因；4:阴性对照。

图2.CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR检测方法最佳退火温度优化：M:Trans 2K PlusDNA Marker；1:46℃；2:47℃；3:48℃；4:49℃；5:50℃；6:51℃；7:52℃；8:53℃；9:阴性对照。

图3.CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR检测方法最佳引物浓度优化：M:Trans 2K DNAMarker；1:0.2μL；2:0.4μL；3:0.6μL；4:0.8μL；5:1.0μL；6:1.2μL；7:阴性对照。

图4.CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR特异性检测结果：M:Trans 2K Plus DNA Marker；1:CCoVⅠ+CCoVⅡ；2:CDV；3:CAV-2；4:CPIV；5:CPV；6:阴性对照。

图5.CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR和普通RT-PCR敏感性试验检测结果：M:Trans 2KPlus DNA Marker；1-9:CCoVⅠ9.32×10⁸拷贝/μL-9.32×100拷贝/μL；CCoVⅡ:9.16×10⁸拷贝/μL-9.16×10⁰拷贝/μL；10:阴性对照。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细描述，但应理解本发明并不受以下内容所限制。

实施例1：CCoVⅠ和CCoVⅡRT-PCR扩增目的基因

1、引物设计：

本发明引物CCoVⅠ-F和CCoVⅠ-R用于扩增CCoVⅠ的特异性序列，扩增片段大小为239bp；引物CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R用于扩增CCoVⅡ的特异性序列，扩增片段大小为105bp。引物由北京华大生物科技生物技术有限公司合成。引物序列详述如下：

CCoVⅠ-F：5'-GTGCTTCCTCTTGAAGGTACA-3'(SEQ ID NO.1)；

CCoVⅠ-R：5'-TCTGTTGAGTAATCACCAGCT-3'(SEQ ID NO.2)；

CCoVⅡ-F：5'-TAGTGCATTAGGAAGAAGCT-3'(SEQ ID NO.3)；

CCoVⅡ-R：5’-GCAATTTTGAACCCTTC-3'(SEQ ID NO.4)。

扩增后获得的特异性目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5(CCoVⅠ)和SEQ IDNO.6(CCoVⅠI)所示。

2、CCoVⅠ和CCoVⅡ普通RT-PCR检测方法的建立：

以重组质粒pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ(由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所保存)为模板对引物加量进行优化，配制反应体系如下：CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R各1.0μL；pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ各1.0μL；1.0μL dNTPs(2.5mM)；0.5μL LA Taq(5U/μL)(TAKARA,Dalian,China)；2.0μL 10×LA Taq BufferⅡ(Mg²⁺Plus)(TAKARA,Dalian,China)；ddH₂O补充至20μL。反应条件如下：95℃，3min；35个循环：95℃，30s、49℃，30s、72℃，30s；72℃，10min。反应结束后，采用1.0-1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

分别以重组质粒pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ为模板，通过RT-PCR方法进行目的基因的扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，可分别获得239bp和105bp的目的片段，与预期的大小相符(图1)。

实施例2：CCoVⅠ和CCoVⅡ纳米RT-PCR(nanoRT-PCR)检测方法的建立

1、CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR退火温度的优化：

分别以重组质粒pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ为模板，利用温度梯度PCR仪设置退火温度为46℃～53℃，依次递增1℃，进行退火温度优化。反应体系如下：Taq DNA polymerase(5U/μL)(GRED,Shandong,China)，0.5μL；2×nano PCR Buffer(GRED,Shandong,China)，10μL；CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R各1μL；pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ各1.0μL；ddH2O补充至20μL。反应条件如下：95℃，3min；35个循环：95℃，30s、46℃～53℃(依次递增1℃)，30s、72℃，30s；72℃，10min。

CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR经退火温度(46℃～53℃)优化，琼脂糖凝胶电泳结果见图2。从结果可知，46℃～53℃下nanoRT-PCR均可扩增得到目的条带，最终选择48℃为nanoRT-PCR检测方法的最佳退火温度。

2、CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR引物添加量的优化：

以重组质粒pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ为模板对引物添加量进行优化，配制反应体系如下：Taq DNA polymerase，0.5μL；2×nano PCR Buffer，10μL；CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R设置在0.2～1.2μL(依次递增0.2μL)；pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ各1.0μL；ddH₂O补充至20μL，以优化的最佳退火温度进行反应。

在其他条件相同，最佳退火温度下，将引物的添加量分别设置为0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL、1.0μL和1.2μL(10μM)进行引物浓度优化。结果表明引物终浓度在1.0μL时，扩增效果最佳，见图3。

3、CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR体系的优化结果：

CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR反应体系最终确定为：2×nano PCR Buffer，10μL；CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R各1.0μL，重组质粒pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ各0.5μL；Taq DNA聚合酶(5U/μL)，0.5μL；ddH₂O加至20μL。PCR反应条件为：95℃、3min；(95℃、30s，48℃、30s，72℃、30s)，35个循环；72℃、10min。

4、特异性检测试验：

应用本发明所建立的nanoRT-PCR分别对CCoVⅠ、CCoVⅡ、CDV、CAV-2、CPIV和CPV的DNA或cDNA进行特异性检测，并设置阴性对照，以确定该方法的特异性。

采用引物(CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R)分别对CDV、CAV-2、CPIV、CPV的DNA或cDNA进行nanoRT-PCR检测，结果只有在同一体系中含有CCoVⅠ，CCoVⅡ才能扩增出目的片段，其他病毒均未扩增出条带(图4)，试验结果证明nanoRT-PCR检测方法具有良好的特异性。

5、灵敏性检测试验：

用紫外分光光度测定仪测定重组质粒pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ的浓度，并将其换算成拷贝数。将pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ浓度分别为9.32×10⁸copies/μL和9.16×10⁸copies/μL的重组质粒进行10倍倍比稀释，即得到浓度梯度标准品，利用nanoRT-PCR进行灵敏性检测，并用普通RT-PCR检测方法同步验证及比较。

以初始浓度分别为9.32×10⁸copies/μL和9.16×10⁸copies/μL的pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ，经过双蒸水10倍系列稀释，取每个稀释度的重组质粒模板进行nanoRT-PCR和RT-PCR检测。敏感性试验结果表明：使用实施例1所述常规RT-PCR方法检测的最低拷贝数分别为9.32×10³拷贝/μL和9.16×10⁴拷贝/μL(图5A)；使用实施例2所述nanoRT-PCR检测方法可以检测CCoVⅠ和CCoVⅡ的最低拷贝数分别为9.32×10¹拷贝/μL和9.16×10²拷贝/μL(图5B)，nanoRT-PCR检测方法的灵敏度比普通RT-PCR检测方法高出100倍。

实施例3：临床样本的检测验证

1、临床样本收集与处理：

从北京某动物医院获得共计60份犬粪便样品，取犬的粪便少许，以0.01mol/LPH7.6PBS作1：4稀释，经12000r/min离心5min后，取上清液，应用Axyprep Body FluidViral DNA/RNA Miniprep kit试剂盒提取基因组RNA。以此RNA为模板依据M-MLV反转录试剂盒说明进行cDNA的合成，将所获得样品的cDNA于-20℃保存，待检。

2、检测验证：

应用本发明所建立的nanoRT-PCR对60份临床样本cDNA进行CCoVⅠ和CCoVⅡ检测。检测结果显示，CCoVⅠ阳性率为11.67％，CCoVⅡ的阳性率为48.33％，二者混合感染率为8.33％(见表1)。所有样品经普通RT-PCR方法进行检测，其结果与nanoRT-PCR方法的检测结果相一致。为进一步确定所建立方法检测的准确性，将nanoRT-PCR获得的产物送华大基因测序分析。测序结果显示，nanoRT-PCR获得的239bp是CCoVⅠ来源的特异性片段，105bp是CCoVⅡ来源的特异片段。

表1.普通RT-PCR及nanoRT-PCR对60份样品的检测结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米PCR检测方法

<130> CP11802149C

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgcttcctc ttgaaggtac a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctgttgagt aatcaccagc t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagtgcatta ggaagaagct 20

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcaattttga acccttc 17

<210> 5

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtgcttcctc ttgaaggtac accaactggt gttactctta ctttattatc aggaaacctt 60

tatgctgaag gattcaaaat ggctggtgga atgaacatcg agcatttacc taaatacgta 120

atggtcgcat tacctagtag aactattgtc tacacacttg ttggaaagca attgaaagca 180

agtagtgcaa caggatgggc ttactatgta aaatctaaag ctggtgatta ctcaacaga 239

<210> 6

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tagtgcatta ggaagaagct atgtgcttcc tctagaaggt gtgccaactg gtgtcacttt 60

acattgcttt cagggaattt gtatgctgaa gggttcaaaa ttgct 105

Claims

1.一种非诊断目的的同时鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米PCR检测方法，其特征在于，

1)抽提样品RNA，并将RNA反转录为cDNA，获得扩增模板；

2)配制反应体系如下：2×nano PCR Buffer，10μL；纳米PCR引物CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R各1.0μL，引物浓度为10μM，扩增模板0.5-1μL；Taq DNA聚合酶2.5U；ddH₂O加至20μL；

3)PCR反应条件为：95℃、3min；

95℃、30s，48℃、30s，72℃、30s，35个循环；

72℃、10min；

所述纳米PCR引物由以下引物组成：

扩增CCoVI特异性片段的如SEQ ID NO.1所示引物CCoVⅠ-F和如SEQ ID NO.2所示引物CCoVⅠ-R；和，

扩增CCoVII特异性片段的如SEQ ID NO.3所示引物CCoVⅡ-F和如SEQ ID NO.4所示引物CCoVⅡ-R。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还包括琼脂糖凝胶检测步骤。