CN108676917A - 一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米PCR检测方法 - Google Patents
一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米PCR检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108676917A CN108676917A CN201810569666.7A CN201810569666A CN108676917A CN 108676917 A CN108676917 A CN 108676917A CN 201810569666 A CN201810569666 A CN 201810569666A CN 108676917 A CN108676917 A CN 108676917A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ccov
- pcr
- pcr detection
- nanort
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种鉴别CCoVⅠ和CCoVⅡ的nanoRT‑PCR检测方法。通过对nanoRT‑PCR反应体系的引物、退火温度和引物浓度进行优化,获得CCoVⅠ和CCoVⅡ各自的目的条带的高效扩增,同时避免引物间的非特异性扩增;本发明所述nanoRT‑PCR检测方法的最低核酸检测量比普通RT‑PCR高100倍,且通过nanoRT‑PCR扩增得到与预期片段大小一致且序列完全正确的产物。本发明提供的用于鉴别CCoVⅠ和CCoVⅡ的nanoRT‑PCR方法具有极高的灵敏度和特异性,是一种高效的检测手段,可应用于犬冠状病毒病的流行性调查,同时也为CCoV的鉴定和防控奠定基础,具有重大的实际意义和价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,具体涉及一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米RT-PCR检测方法及其应用。
背景技术
犬冠状病毒(Canine coronavirus,CCoV)是引起犬胃肠炎的主要病原之一,一般引起幼龄犬发生非致死性的轻度腹泻,呈现高发病率、低死亡率的特点,当与其他肠道病原混合感染时,能导致患病动物高死亡率。近年来,随着CCoV高致病性的变异毒株在欧洲国家陆续报道,该病再一次引起了广泛的关注[1-2]。
CCoV为单股正链RNA病毒,属套式病毒目、α冠状病毒科、α冠状病毒属[3]。近年来检测到CCoV有不同的基因型,分为CCoV I型(CCoVI)和CCoVⅡ型(CCoVII)[4]。CCoVⅡ是自1971年以来已知的最早的基因型[5],由于CCoVI尚未适应体外生长,不能通过细胞培养分离得到,依靠分子方法才在30年后被发现[6]。CCoV基因组序列包括10个开放阅读框,从5′到3′依次编码1a、1b、纤突蛋白、小膜蛋白、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白以及许多假定的非结构蛋白。对CCoV M基因的氨基酸序列进行比对分析,在CCoVⅡ跨膜区和羧基末端,只有少数分散的替换,而CCoV I的M蛋白中发生许多类似于猫冠状病毒典型残基的替换,基于此可以区分I型和Ⅱ型[7]。由于冠状病毒不仅在宿主中易突变,而且在病毒间也易发生基因重组,从而导致近年来新变异株不断出现。另外,CCoVI和CCoVⅡ的感染在临床诊断上是无法区分的,只能依靠生物技术对其进行序列分析后才能得到鉴别,所以建立一个简便有效、特异性高和灵敏性强的检测方法很有必要。
目前,检测CCoV的技术主要有普通RT-PCR、核酸探针、荧光定量RT-PCR及ELISA等:(1)RT-PCR是比较常见的技术,但其缺陷在于敏感性不显著;(2)核酸探针技术费用较高,不适用于大批量样本的检测;(3)荧光定量RT-PCR的敏感性和准确性高于普通RT-PCR,但其实施需要昂贵的实时荧光定量PCR仪,在二三线城市的动物诊所或实验室难以普及推广;(4)间接ELISA法对样品的要求比较高,且操作程序复杂,耗时长。以上这些缺点限制了上述方法在临床诊断中的应用。
纳米PCR是一种敏感、便捷的新型PCR技术,其原理是在纳米PCR缓冲液中添加了粒径为1nm~100nm的纳米金属颗粒,当反应时产生具有超强导电性的纳米流体,从而加快温度升高和下降的速度,减少在非目标温度的停留时间,因而减少了反应非特异性扩增,同时提高了扩增效率和敏感性。该方法目前仍未适用于犬科病毒,尤其是CCoVI和CCoVII的鉴定检测当中。
参考文献:
[1]Zicola A,Jolly S,Mathijs E,et al.Fatal outbreaks in dogsassociated with pantropic canine coronavirus in France and Belgium[J].SmallAnim.Pract,2012,53:297–300.18.
[2]Decaro N,Cordonnier N,Demeter Z,et al.European surveillance forpantropic canine coronavirus[J].Clin Microbiol,2013,51(1):83–88.
[3]King AMQ,Adams MJ,Carstens EB,et al.2012.Virustaxonomy:classification and nomenclature of viruses.Ninth report of theInternationalCommittee on Taxonomy of Viruses.Elsevier AcademicPress,San Diego,CA.
[4]Decaro N,Buonavoglia C.An update on canine coronaviruses:viralevolution and pathobiology[J].Vet Microbiol,2008,132:221–234
[5]Binn,L.N.,Lazar,E.C.,Keenan,K.P.,et al.Recovery andcharacterization of a coronavirus from military dogswithdiarrhea.Proc.Annu.Meet.U.S.Anim.Health Assoc,1974,78,359–366.
[6]Pratelli,A.,Martella,V.,Decaro,N.,et al.Genetic diversity of acanine coronavirus detected inpups with diarrhoea in Italy[J].J.Virol.Methods,2003,110,9–17.
[7]Pratelli,A.,V.Martella,M.Pistello,G.Elia,N,et al.Identification ofcoronaviruses in dogs that segregate separately from the canine coronavirusgenotype[J].J.Virol.Methods,2003,107:213–222.
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷和不足,本发明旨在建立一种快速、灵敏、特异的纳米PCR检测技术,用于犬冠状病毒病的早期检测与鉴定。
本发明目的通过以下技术方案来实现:
本发明提供了一种鉴别CCoVI和/或CCoVII的纳米PCR检测方法,所述方法使用引物CCoVⅠ-F(SEQ ID NO.1)和CCoVⅠ-R(SEQ ID NO.2)扩增CCoVI特异性片段,使用引物CCoVⅡ-F(SEQ ID NO.3)和CCoVⅡ-R(SEQ ID NO.4)扩增CCoVII特异性片段;扩增反应的退火温度为48℃;引物添加量分别为1.0μL/20μL反应体系,引物浓度为10μM。
进一步的,所述纳米PCR检测方法包括如下步骤:
1)抽提样品DNA或RNA,并将RNA反转录为cDNA,获得扩增模板;
2)配制反应体系如下:2×nano PCR Buffer,10μL;CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R各1.0μL,扩增模板各0.5-1μL;Taq DNA聚合酶2.5U;ddH2O加至20μL;
3)PCR反应条件为:95℃、3min;95℃、30s,48℃、30s,72℃、30s,35个循环;72℃10min。
进一步的,所述纳米PCR检测方法还包括琼脂糖凝胶检测步骤。
进一步的,所述纳米PCR检测方法,优选为双重纳米PCR检测方法。
本发明提供了一种上述纳米PCR检测方法在鉴别、诊断、和/或预防控制犬冠状病毒病中的应用。
本发明提供了一种上述纳米PCR检测方法在犬冠状病毒病的流行性调查中的应用。
本发明所述“应用”,即可表示治疗目的的应用,也可表示非治疗目的的应用,例如,科学研究等。
本发明的有益效果是:
1、本发明对nanoRT-PCR反应体系的引物、退火温度和引物浓度进行优化,以便CCoVⅠ和CCoVⅡ各自的目的条带都得到高效扩增,同时避免引物间的非特异性扩增。
2、本发明nanoRT-PCR检测方法的最低核酸检测量比普通RT-PCR最低核酸检测量高出100倍,具有良好的灵敏度。
3、本发明nanoRT-PCR扩增得到与预期的片段大小一致且特异的产物,克隆测序验证100%准确,本发明所述方法准确性极高。
4、本发明所述方法可用于CCoVⅠ和CCoVⅡ混合感染的鉴别检测,一步完成,操作简便快捷。
综上,本发明提供的用于鉴别CCoVⅠ和CCoVⅡ的nanoRT-PCR方法具有极高的灵敏度和特异性,是一种高效的检测手段,可应用于犬冠状病毒病的流行性调查,同时也为CCoV的鉴定和防控奠定基础。
附图说明
图1.CCoVⅠ和CCoVⅡRT-PCR扩增目的基因的琼脂糖凝胶电泳检测:M:Trans 2KPlus DNA Marker;1:CCoVⅠ目的基因;2:CCoVⅡ目的基因;3:CCoVⅠ+CCoVⅡ目的基因;4:阴性对照。
图2.CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR检测方法最佳退火温度优化:M:Trans 2K PlusDNA Marker;1:46℃;2:47℃;3:48℃;4:49℃;5:50℃;6:51℃;7:52℃;8:53℃;9:阴性对照。
图3.CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR检测方法最佳引物浓度优化:M:Trans 2K DNAMarker;1:0.2μL;2:0.4μL;3:0.6μL;4:0.8μL;5:1.0μL;6:1.2μL;7:阴性对照。
图4.CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR特异性检测结果:M:Trans 2K Plus DNA Marker;1:CCoVⅠ+CCoVⅡ;2:CDV;3:CAV-2;4:CPIV;5:CPV;6:阴性对照。
图5.CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR和普通RT-PCR敏感性试验检测结果:M:Trans 2KPlus DNA Marker;1-9:CCoVⅠ9.32×108拷贝/μL-9.32×100拷贝/μL;CCoVⅡ:9.16×108拷贝/μL-9.16×100拷贝/μL;10:阴性对照。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细描述,但应理解本发明并不受以下内容所限制。
实施例1:CCoVⅠ和CCoVⅡRT-PCR扩增目的基因
1、引物设计:
本发明引物CCoVⅠ-F和CCoVⅠ-R用于扩增CCoVⅠ的特异性序列,扩增片段大小为239bp;引物CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R用于扩增CCoVⅡ的特异性序列,扩增片段大小为105bp。引物由北京华大生物科技生物技术有限公司合成。引物序列详述如下:
CCoVⅠ-F:5'-GTGCTTCCTCTTGAAGGTACA-3'(SEQ ID NO.1);
CCoVⅠ-R:5'-TCTGTTGAGTAATCACCAGCT-3'(SEQ ID NO.2);
CCoVⅡ-F:5'-TAGTGCATTAGGAAGAAGCT-3'(SEQ ID NO.3);
CCoVⅡ-R:5’-GCAATTTTGAACCCTTC-3'(SEQ ID NO.4)。
扩增后获得的特异性目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5(CCoVⅠ)和SEQ IDNO.6(CCoVⅠI)所示。
2、CCoVⅠ和CCoVⅡ普通RT-PCR检测方法的建立:
以重组质粒pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ(由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所保存)为模板对引物加量进行优化,配制反应体系如下:CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R各1.0μL;pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ各1.0μL;1.0μL dNTPs(2.5mM);0.5μL LA Taq(5U/μL)(TAKARA,Dalian,China);2.0μL 10×LA Taq BufferⅡ(Mg2+Plus)(TAKARA,Dalian,China);ddH2O补充至20μL。反应条件如下:95℃,3min;35个循环:95℃,30s、49℃,30s、72℃,30s;72℃,10min。反应结束后,采用1.0-1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
分别以重组质粒pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ为模板,通过RT-PCR方法进行目的基因的扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测,可分别获得239bp和105bp的目的片段,与预期的大小相符(图1)。
实施例2:CCoVⅠ和CCoVⅡ纳米RT-PCR(nanoRT-PCR)检测方法的建立
1、CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR退火温度的优化:
分别以重组质粒pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ为模板,利用温度梯度PCR仪设置退火温度为46℃~53℃,依次递增1℃,进行退火温度优化。反应体系如下:Taq DNA polymerase(5U/μL)(GRED,Shandong,China),0.5μL;2×nano PCR Buffer(GRED,Shandong,China),10μL;CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R各1μL;pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ各1.0μL;ddH2O补充至20μL。反应条件如下:95℃,3min;35个循环:95℃,30s、46℃~53℃(依次递增1℃),30s、72℃,30s;72℃,10min。
CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR经退火温度(46℃~53℃)优化,琼脂糖凝胶电泳结果见图2。从结果可知,46℃~53℃下nanoRT-PCR均可扩增得到目的条带,最终选择48℃为nanoRT-PCR检测方法的最佳退火温度。
2、CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR引物添加量的优化:
以重组质粒pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ为模板对引物添加量进行优化,配制反应体系如下:Taq DNA polymerase,0.5μL;2×nano PCR Buffer,10μL;CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R设置在0.2~1.2μL(依次递增0.2μL);pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ各1.0μL;ddH2O补充至20μL,以优化的最佳退火温度进行反应。
在其他条件相同,最佳退火温度下,将引物的添加量分别设置为0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL、1.0μL和1.2μL(10μM)进行引物浓度优化。结果表明引物终浓度在1.0μL时,扩增效果最佳,见图3。
3、CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR体系的优化结果:
CCoVⅠ和CCoVⅡnanoRT-PCR反应体系最终确定为:2×nano PCR Buffer,10μL;CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R各1.0μL,重组质粒pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ各0.5μL;Taq DNA聚合酶(5U/μL),0.5μL;ddH2O加至20μL。PCR反应条件为:95℃、3min;(95℃、30s,48℃、30s,72℃、30s),35个循环;72℃、10min。
4、特异性检测试验:
应用本发明所建立的nanoRT-PCR分别对CCoVⅠ、CCoVⅡ、CDV、CAV-2、CPIV和CPV的DNA或cDNA进行特异性检测,并设置阴性对照,以确定该方法的特异性。
采用引物(CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R)分别对CDV、CAV-2、CPIV、CPV的DNA或cDNA进行nanoRT-PCR检测,结果只有在同一体系中含有CCoVⅠ,CCoVⅡ才能扩增出目的片段,其他病毒均未扩增出条带(图4),试验结果证明nanoRT-PCR检测方法具有良好的特异性。
5、灵敏性检测试验:
用紫外分光光度测定仪测定重组质粒pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ的浓度,并将其换算成拷贝数。将pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ浓度分别为9.32×108copies/μL和9.16×108copies/μL的重组质粒进行10倍倍比稀释,即得到浓度梯度标准品,利用nanoRT-PCR进行灵敏性检测,并用普通RT-PCR检测方法同步验证及比较。
以初始浓度分别为9.32×108copies/μL和9.16×108copies/μL的pMD-CCoVⅠ和pMD-CCoVⅡ,经过双蒸水10倍系列稀释,取每个稀释度的重组质粒模板进行nanoRT-PCR和RT-PCR检测。敏感性试验结果表明:使用实施例1所述常规RT-PCR方法检测的最低拷贝数分别为9.32×103拷贝/μL和9.16×104拷贝/μL(图5A);使用实施例2所述nanoRT-PCR检测方法可以检测CCoVⅠ和CCoVⅡ的最低拷贝数分别为9.32×101拷贝/μL和9.16×102拷贝/μL(图5B),nanoRT-PCR检测方法的灵敏度比普通RT-PCR检测方法高出100倍。
实施例3:临床样本的检测验证
1、临床样本收集与处理:
从北京某动物医院获得共计60份犬粪便样品,取犬的粪便少许,以0.01mol/LPH7.6PBS作1:4稀释,经12000r/min离心5min后,取上清液,应用Axyprep Body FluidViral DNA/RNA Miniprep kit试剂盒提取基因组RNA。以此RNA为模板依据M-MLV反转录试剂盒说明进行cDNA的合成,将所获得样品的cDNA于-20℃保存,待检。
2、检测验证:
应用本发明所建立的nanoRT-PCR对60份临床样本cDNA进行CCoVⅠ和CCoVⅡ检测。检测结果显示,CCoVⅠ阳性率为11.67%,CCoVⅡ的阳性率为48.33%,二者混合感染率为8.33%(见表1)。所有样品经普通RT-PCR方法进行检测,其结果与nanoRT-PCR方法的检测结果相一致。为进一步确定所建立方法检测的准确性,将nanoRT-PCR获得的产物送华大基因测序分析。测序结果显示,nanoRT-PCR获得的239bp是CCoVⅠ来源的特异性片段,105bp是CCoVⅡ来源的特异片段。
表1.普通RT-PCR及nanoRT-PCR对60份样品的检测结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米PCR检测方法
<130> CP11802149C
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgcttcctc ttgaaggtac a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctgttgagt aatcaccagc t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tagtgcatta ggaagaagct 20
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcaattttga acccttc 17
<210> 5
<211> 239
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgcttcctc ttgaaggtac accaactggt gttactctta ctttattatc aggaaacctt 60
tatgctgaag gattcaaaat ggctggtgga atgaacatcg agcatttacc taaatacgta 120
atggtcgcat tacctagtag aactattgtc tacacacttg ttggaaagca attgaaagca 180
agtagtgcaa caggatgggc ttactatgta aaatctaaag ctggtgatta ctcaacaga 239
<210> 6
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tagtgcatta ggaagaagct atgtgcttcc tctagaaggt gtgccaactg gtgtcacttt 60
acattgcttt cagggaattt gtatgctgaa gggttcaaaa ttgct 105
Claims (6)
1.一种鉴别CCoVI和/或CCoVII的纳米PCR检测方法,其特征在于,所述方法使用引物CCoVⅠ-F(SEQ ID NO.1)和CCoVⅠ-R(SEQ ID NO.2)扩增CCoVI特异性片段,使用引物CCoVⅡ-F(SEQ ID NO.3)和CCoVⅡ-R(SEQ ID NO.4)扩增CCoVII特异性片段;扩增反应的退火温度为48℃;引物添加量分别为1.0μL/20μL反应体系,引物浓度为10μM。
2.根据权利要求1所述纳米PCR检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)抽提样品DNA或RNA,并将RNA反转录为cDNA,获得扩增模板;
2)配制反应体系如下:2×nano PCR Buffer,10μL;CCoVⅠ-F、CCoVⅠ-R、CCoVⅡ-F和CCoVⅡ-R各1.0μL,扩增模板0.5-1μL;Taq DNA聚合酶2.5U;ddH2O加至20μL;
3)PCR反应条件为:95℃、3min;
95℃、30s,48℃、30s,72℃、30s,35个循环;
72℃、10min。
3.根据权利要求2所述纳米PCR检测方法,其特征在于,还包括琼脂糖凝胶检测步骤。
4.根据权利要求1-3任一项所述纳米PCR检测方法,其特征在于,所述方法为双重纳米PCR检测方法。
5.权利要求1-4任一项所述纳米PCR检测方法在鉴别、诊断、和/或预防控制犬冠状病毒病中的应用。
6.权利要求1-4任一项所述纳米PCR检测方法在犬冠状病毒病的流行性调查中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810569666.7A CN108676917B (zh) | 2018-06-05 | 2018-06-05 | 一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米PCR检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810569666.7A CN108676917B (zh) | 2018-06-05 | 2018-06-05 | 一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米PCR检测方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108676917A true CN108676917A (zh) | 2018-10-19 |
CN108676917B CN108676917B (zh) | 2022-04-12 |
Family
ID=63809828
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810569666.7A Active CN108676917B (zh) | 2018-06-05 | 2018-06-05 | 一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米PCR检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108676917B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111471797A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-07-31 | 广东省实验动物监测所 | 用于检测猫冠状病毒的rt-rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法 |
CN113718056A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-11-30 | 龙岩学院 | 用于检测犬粪便中冠状病毒的通用引物及试剂盒 |
CN115074461A (zh) * | 2021-03-11 | 2022-09-20 | 上海市农业科学院 | 犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重pcr检测方法 |
-
2018
- 2018-06-05 CN CN201810569666.7A patent/CN108676917B/zh active Active
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
ANNAMARIA PRATELLI等: "Two Genotypes of Canine Coronavirus Simultaneously Detected in the Fecal Samples of Dogs with Diarrhea", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 * |
GENBANK: "Canine coronavirus genomic RNA, 3" end side sequence", 《GENBANK》 * |
王静: "犬冠状病毒的分离鉴定及两种检测方法的建立", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 * |
罗亚坤等: "CDV和CPV及CCV多重纳米PCR检测方法的建立与应用", 《中国兽医科学》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111471797A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-07-31 | 广东省实验动物监测所 | 用于检测猫冠状病毒的rt-rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法 |
CN115074461A (zh) * | 2021-03-11 | 2022-09-20 | 上海市农业科学院 | 犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重pcr检测方法 |
CN115074461B (zh) * | 2021-03-11 | 2023-08-25 | 上海市农业科学院 | 犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重pcr检测方法 |
CN113718056A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-11-30 | 龙岩学院 | 用于检测犬粪便中冠状病毒的通用引物及试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108676917B (zh) | 2022-04-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107299155A (zh) | 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针 | |
CN108676920B (zh) | 一种快速检测小鼠诺如病毒引物、试剂盒及其rt-rpa方法 | |
CN106957927A (zh) | 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用 | |
Jóźwik et al. | Comparison of the immunofluorescence assay with RT-PCR and nested PCR in the diagnosis of canine distemper | |
Alfaro-Núñez et al. | Further evidence of Chelonid herpesvirus 5 (ChHV5) latency: high levels of ChHV5 DNA detected in clinically healthy marine turtles | |
Deb et al. | Trends in veterinary diagnostics | |
CN114134252B (zh) | 用于检测冠状病毒的引物和试剂盒 | |
CN108676917A (zh) | 一种鉴别CCoVI和CCoVII的双重纳米PCR检测方法 | |
CN107988427A (zh) | 对虾肝胰腺细小病毒(hpv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
KR102231338B1 (ko) | 조류인플루엔자, 뉴캐슬병 및 닭전염성 기관지염 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 조류인플루엔자, 뉴캐슬병 및 닭전염성 기관지염 바이러스의 검출 방법 | |
Aydin et al. | A pilot study on feline astrovirus and feline panleukopenia virus in shelter cats in Erzurum, Turkey | |
Tong et al. | Rapid detection of Decapod iridescent virus 1 (DIV1) by recombinase polymerase amplification | |
CN103276099A (zh) | 用于荧光定量pcr检测幽门螺杆菌的引物和试剂盒 | |
CN111518954A (zh) | H5和n8亚型禽流感病毒双重纳米pcr检测的引物组、试剂盒及方法 | |
WO2019240073A1 (ja) | 定量pcrプローブ | |
CN117025846A (zh) | 一种多重ddPCR检测新型冠状病毒的引物组及其应用 | |
CN110819629A (zh) | 检测蓝舌8型和/或蓝舌16型病毒的引物组合及检测方法 | |
CN107937606B (zh) | 一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂以及方法 | |
CN112941240B (zh) | 检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法 | |
CN106978496B (zh) | 一种黄颡四锚虫的pcr检测引物及荧光定量pcr检测试剂盒 | |
US20230167511A1 (en) | An ultrasensitive rapid and portable case13d-based diagnostic assay | |
KR101236197B1 (ko) | 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단 | |
CN113215154B (zh) | TGEV、PEDV、PDCoV三重PCR检测的引物组合、试剂盒及其应用 | |
CN107988429B (zh) | 一种检测狂犬病毒的试剂及其应用 | |
CN104611470A (zh) | 用于检测蓝舌病病毒的基因芯片及其检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |