CN115074461A - 犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重pcr检测方法 - Google Patents

犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

一种犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR检测方法，包括：1)查找犬流感病毒CIV、犬冠状病毒CCOV和犬呼肠孤病毒CRV的保守区序列；2)根据GenBank上公布的CIV病毒的M基因、CCOV病毒的L1基因和CRV病毒的M基因序列信息，分别设计上下游引物对；3)进行三重PCR反应，反应体系中，引物为2.5‑5μmol/L，模板量为1‑5ng/μL，其中，3组引物的添加量符合扩增CIV病毒的引物：扩增CCOV病毒的引物：扩增CRV病毒的引物＝1：0.5‑1：1。利用本发明，可对单一样品同时进行三种不同病原的检测，具有灵敏性高、特异性强、省时省力等优点，以方便快速、准确地进行相关流行病学监测。

Description

犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR检测方法
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR检测方法。
背景技术
随着人民生活水平的提高及伴侣动物概念的植入，宠物数量剧增，宠物犬作为家庭的一员，在带来生活慰藉的同时，由于时刻与人类的近距离接触，为许多人兽共患病交叉传播提供了条件，极大地增加了公共卫生安全隐患。此外，流浪犬居无定所，生活环境恶劣，更没有开展定期的清洁、免疫、驱虫，携带病原的几率往往远高于家养犬。
世界上已发现的人畜共患病有200多种，其中与宠物有直接或间接关系的有七十多种。宠物源人畜共患病的病原体传染性和致病力较强，而且部分病原体的致死率很高，应该引起极大关注和重视。近年来，一些新发的宠物源人畜共患病不断地被发现，病种不断地增多。
犬流感(CI)是由犬流感病毒(CIV)引起的以呼吸道症状为主的犬类传染性疾病。2004年，在犬体内发现马源犬流感病毒后，人源、猪源、禽源等多种不同动物来源的犬流感病毒相继出现。这些病毒在犬体内复制、重配，甚至通过犬传播至其他宿主，对其他动物甚至人类健康造成威胁。2009年11月我国有2例犬感染甲流报道，人禽流感可能由犬等感染。
新型冠状病毒肺炎的流行已经给人类的健康和生命造成极大危害，引起了各国科学界的强烈关注，并正在进行广泛深入的研究。冠状病毒是畜、禽、犬猫和人，特别是幼畜呼吸道及消化道炎症的病原。这些问题也凸显了动物传染病和人类传染病之间的联系。冠状病毒引起的动物疾病有很多种，犬冠状病毒(CCoV)在犬群中普遍存在，尤其在犬舍和动物收容所更加流行。
呼肠孤病毒在自然界中广泛存在，几乎可以从所有的哺乳动物体内检测到呼肠孤病毒，且已证实与许多人畜共患病有关。呼肠孤病毒科(Reoviridae)病毒的感染可导致畜禽和人的发病及死亡，给公共卫生安全以及畜禽养殖业带来严重威胁。而针对犬的呼肠孤病毒(CRV)报道较少，其常规的检测方法有病原分离鉴定和血清学方法，但是，这些方法的敏感性和特异性较低，且费时费力。
CIV、CCOV和CRV三种病原均存在感染人的风险，并且前期的流行病学监测发现该三种病原在健康家养犬中依然表现出较高的阳性率，近年来，建立了对CIV、CCOV、RV病毒的单一检测方法，但这些检测方法耗时较长，多重PCR检测技术是在单一PCR的基础上建立的检测方法。
尽管目前已经报道过CDV、CPV和CCOV病毒的三重检测方法，但病毒种类不同，检测条件也不同，对于CIV、CCOV和CRV三种病原的三重检测方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR检测方法，可以对单一样品同时进行三种不同病原的检测，具有灵敏性高、特异性强、省时省力等优点，三重PCR在试验过程中也会降低因为污染而造成的假阳性率，以方便快速、准确地进行相关流行病学监测，为公共卫生安全提出预警，为潜在威胁人类健康的病原监测提供技术支持。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR检测方法，包括以下步骤：
1)查找犬流感病毒CIV、犬冠状病毒CCOV和犬呼肠孤病毒CRV的保守区序列；
2)根据GenBank上公布的CIV病毒的M基因、CCOV病毒的L1基因和CRV病毒的M基因序列信息，分别设计上下游引物对；
扩增CIV病毒的引物对序列如下：
CIV-F 5’-CTTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’；
CIV-R 5’-AGGGCATTTTGGACAAAGCGTCTA-3’；
扩增CCOV病毒的引物对序列如下：
CCOV-F 5’-GTGCTTCCTCTTGAAGGTACA-3’；
CCOV-R 5’-AGGGTAATGGGGTTGAAGAATGA-3’；
扩增CRV病毒的引物对序列如下：
CRV-F 5’-ATCGGGAATGCAGAATATGATCC-3’；
CRV-R 5’-GTTTCACTGTTCACCTTACCAGCA-3’。
3)进行三重PCR反应
以待测样品为模板，以上述三组引物对序列为引物，进行三重PCR反应，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测；反应体系中，引物为2.5-5μmol/L，模板量为1-5ng/μL，其中，三组引物的添加量符合扩增CIV病毒的引物：扩增CCOV病毒的引物：扩增CRV病毒的引物＝1：0.5-1：1。
优选地，步骤3)中的三重PCR反应过程为：94℃预变性3min，94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共30-35个循环，72℃延伸5min。
又，步骤3)中所述PCR反应体系总体积为25μL，包括：2×PCR Mix 12.5μL，浓度为10μmol/L的CIV-F和CIV-R各0.5μL；浓度为10μmol/L的CRV-F和CRV-R各0.5μL，浓度为10μmol/L的CCOV-F和CCOV-R各0.25μL，模板3μL，加双蒸水补足至25μL。
进一步，步骤3)中所述CIV病毒的扩增产物片段长度为244bp，CCOV病毒的扩增产物片段长度为333bp，CRV病毒的扩增产物片段长度为425bp。
又，步骤2)中所述CIV病毒的Gene Bank序列号为KM594565.1。
进一步，步骤2)中所述CRV病毒的Gene Bank序列号为AY007384。
又，步骤2)中所述CCOV病毒的Gene Bank序列号为KP849472。
一种检测犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR的试剂盒，包括上述三重PCR反应体系和阳性对照物，所述阳性对照物由分别含有CIV、CRV和CCOV基因组片段的阳性质粒pEASY－I、pEASY－R和pEASY－C等量混合制得。
本发明建立了对不同病原CIV、CRV和CCOV的三重PCR检测方法，引物设计及反应条件的优化是在多重PCR成功建立的关键技术，而多重PCR主要存在的问题是扩增效率不均衡。本发明在引物选择上尽量将片段大小的差距缩小，在引物筛选环节，设计了多对引物用于扩增CIV、CRV和CCOV，最后筛选出扩增片段大小相近的3对引物，从而有效减少了扩增效率不均衡的影响；电泳结果表明目的条带准确、清晰、区分度强。
本发明通过构建三种病原的阳性标准质粒，进一步对反应体系进行优化，提供了合适的反应体系，该方法可以对单一样品同时进行三种不同病原的检测，具有灵敏性高、特异性强、省时省力等优点，另外，三重PCR在试验过程中也会降低因为污染而造成的假阳性率。
在前期犬源人畜共患病的流行病学监测中发现，CIV、CRV和CCOV三种病原在表观正常且健康的家养犬中依然呈现相对较高的阳性率，因此，本研究建立的三重PCR体系可以很好地适用于临床检测，为CIV、CRV和CCOV感染的流行病学调查提供更多的参考依据，为公共卫生安全预警监测提供技术支持。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明设计了多对引物用于扩增CIV、CRV和CCOV，最后筛选出扩增片段大小相近的3对引物，从而有效减少了扩增效率不均衡的影响。
利用本发明，可以对单一样品同时进行三种不同病原的检测，目的条带准确、清晰、区分度强，具有灵敏性高、特异性强、省时省力等优点，也会降低因为污染而造成的假阳性率。
利用本发明，当多种疫病同时混合感染时，多重PCR检测方法使得混合感染的诊断变得方便可行，同时对病毒含量较低的病原也能够达到快速准确的检测。
附图说明
图1为本发明实施例中退火温度54℃时，三重PCR条件优化电泳图，其中，M：DL1000DNA Marker；1：CIV 244bp；2：CRV 333bp；3：CCOV 425bp；4：模板1ng/μL，引物CIV：CRV：CCOV＝2.5μmol/L：2.5μmol/L：2.5μmol/L；5：模板2.5ng/μL，引物CIV：CRV：CCOV＝5μmol/L:5μmol/L:2.5μmol/L；6：模板5ng/μL，引物CIV：CRV：CCOV＝5μmol/L：5μmol/L：5μmol/L。
图2为本发明实施例中特异性鉴定电泳图，其中，M：DL2000 DNA Marker；1：CIV、CCOV和CRV；2：CCOV；3：CIV；4：CRV；5：CPV；6：CDV；7：rabies virus；8：阴性对照。
图3为本发明实施例中的敏感性鉴定电泳图，其中，M：DL2000 DNA Marker；1：原倍模板扩增产物；2-5：分别为1×10-1～1×10-4倍比稀释的扩增产物；6：阴性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
RNA抽提试剂盒购自QIAGEN公司；PCR Mix购自东盛生物公司；核酸分子量标准物Marker(DL-2000、DL-15000及DL-15000)、M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit(Code D6130)购自TaKaRa公司；pEASY-Blunt Zero Cloning Kit购自全式金生物公司；DNA片段胶回收试剂盒和小量质粒抽提试剂盒购自Axygen公司；琼脂糖购自BIOWEST公司；无水乙醇、异丙醇及DEPC水购自生工生物公司；LB液体培养基及含氨苄的LB固体培养基由实验室按照本领域常规配比配制。
实施例建立犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR检测方法，包括以下步骤：
1.设计引物
根据GenBank上公布的CIV病毒的M基因，Gene BANK序列号为KM594565.1；CCOV病毒的L1基因，Gene BANK序列号为AY007384和CRV病毒的M基因，Gene BANK序列号为KP849472的序列信息，分别设计引物并合成，参见表1。
表1
Figure BDA0002970924070000051
2提取RNA、合成cDNA
2.1样品处理
上海宠物医院采集粪便样品，采集的粪便用PBS进行稀释，-80℃/室温反复冻融2次，漩涡震荡2min，吸取上清，-20℃保存备用。
2.2提取RNA
用QIAGEN RNA试剂盒提取上述样品中的病毒总RNA，参照试剂盒说明书，本实施例过程中均使用无RNA酶的EP管和枪头。具体操作为：
1)取样品300μL在生物安全柜内转移到无RNA酶的2.0mL EP管中，加入600μL的Buffer RLT，混匀后加入900μL 70％的乙醇混合液，混匀；
2)将上述混合液转移到Mini-spin column中，室温12,000rpm离心15s，弃滤液，反复直到所有混合液都通过Mini-spin column富集；
3)向上述Mini-spin column柱子中加700μL Buffer RW1，室温12,000rpm，离心15s，弃滤液；
4)继续加500μL的Buffer RPE于Mini-spin column上，室温12,000rpm，离心15s，弃滤液；
5)重复步骤4，然后室温12,000rpm空离1min，将Mini-spin column转移于新的EP管上，加30μL的RNase-free水到Mini-spin column上，静置2min后，室温12,000rpm离心1min；
6)得到的液体即为病毒RNA，置于冰上或保存于-80℃超低温冰箱。
2.3合成cDNA
利用2.2获得的病毒RNA进行反转录，合成cDNA，反应程序：42℃60min；75℃15min；4℃，∞，反转录产物-20℃保存。
表2反转录反应体系
试剂名称 剂量(μL)
5x M-MLV Buffer 4.0
primer mix 2
dNTP Mixture(10mM) 2
RNasin Ribonuclease Inhibitor(40U/μL) 1
RTase M-MLV(RNase H-) 1
总RNA 10
共计 20
反应程序：42℃60min；75℃15min；4℃，∞；
3.构建病毒阳性质粒标准品
以上述cDNA为模板，利用表1中的引物进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，将回收的目的片段克隆入pEASY-Blunt Zero载体，并转化DH5α感受态；挑取单个菌落进行菌液PCR鉴定，将疑似阳性质粒送公司测序；在NCBI数据库内进行序列比对，将测序正确的阳性质粒于-20℃保存备用。
其中，具体反应体系为2μL cDNA，2×PCR Mix 12.5μL，上、下游引物(10μM)各0.5μL，用水补至25μL；PCR反应程序：95℃，4min后，95℃，30s；55℃，30s；72℃，35s，35个循环；再72℃，7min；4℃，∞；
用核酸分析仪分别检测含有CIV、CRV和CCOV基因组片段的阳性质粒pEASY－I、pEASY－R和pEASY－C的浓度，根据浓度测定结果，将三种阳性质粒分别用ddH2O稀释至20ng/μL，再将其等量混合即为质粒标准品。
4.优化PCR反应体系
PCR反应体系为25μL，其中加入2×PCR Mix 12.5μL，pEASY－I、pEASY－R和pEASY－C阳性混合质粒模板3μL，引物的起始浓度均为10μmol/L，引物体积在0.5μL－1.5μL之间调整，以确定最适宜的引物体积；在最佳引物量确定的基础上，进一步优化反应的退火温度，退火温度选择在48℃－60℃范围内进行优化，以确定最适宜的退火温度。
退火温度54℃，引物在2.5-5μmol/L时，模板量大小在1-5ng/μl,均可以扩增到目的条带，且可以清晰区分三个目的条带，参见图1。
通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定的三重PCR反应体系为：2×PCR Mix12.5μL，CIV-F/CIV-R(10μmol/L)各0.5μL，CRV-F/CRV-R(10μmol/L)各0.5μL，CCOV-F1/CCOV-R(10μmol/L)各0.25μL，模板3μL，加双蒸水补足至25μL；
最佳反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸5min。
5.特异性试验
利用步骤4)三重PCR体系，检测pEASY－I、pEASY－R和pEASY－C阳性质粒模板和犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬狂犬病病毒疫苗株(rabies virus)的核酸样品，以检测所建立的三重PCR体系的特异性，结果参见图2。
由图2可见，检测pEASY－I、pEASY－R和pEASY－C阳性混合质粒和单个质粒，均能得到预期的条带；而对犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬狂犬病病毒疫苗株(rabiesvirus)的核酸样品检测则没有条带出现，说明该方法具有较好的特异性。
6.敏感性试验
将步骤3)中稀释后等量混合的质粒标准品pEASY－I、pEASY－R和pEASY－C阳性质粒模板用双蒸水10倍梯度稀释后，加入到步骤4)的三重PCR体系，利用最佳引物体积和最适宜反应温度进行扩增，以检测三重PCR体系的敏感性，结果参见图3。
从图3中可以看出，利用该三重PCR扩增体系，阳性模板稀释104后，仍能扩增出相应的目的条带，表明具有较好的敏感性。

Claims (8)

1.一种犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR检测方法，包括以下步骤：
1)查找犬流感病毒CIV、犬冠状病毒CCOV和犬呼肠孤病毒CRV的保守区序列；
2)根据GenBank上公布的CIV病毒的M基因、CCOV病毒的L1基因和CRV病毒的M基因序列信息，分别设计上下游引物对；
扩增CIV病毒的引物对序列如下：
CIV-F 5’-CTTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’；
CIV-R 5’-AGGGCATTTTGGACAAAGCGTCTA-3’；
扩增CCOV病毒的引物对序列如下：
CCOV-F 5’-GTGCTTCCTCTTGAAGGTACA-3’；
CCOV-R 5’-AGGGTAATGGGGTTGAAGAATGA-3’；
扩增CRV病毒的引物对序列如下：
CRV-F 5’-ATCGGGAATGCAGAATATGATCC-3’；
CRV-R 5’-GTTTCACTGTTCACCTTACCAGCA-3’；
3)进行三重PCR反应
以待测样品为模板，以上述三组引物对序列为引物，进行三重PCR反应，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测；反应体系中，引物为2.5-5μmol/L，模板量为1-5ng/μL，其中，三组引物的添加量符合扩增CIV病毒的引物：扩增CCOV病毒的引物：扩增CRV病毒的引物＝1：0.5-1：1。
2.根据权利要求1所述的三重PCR检测方法，其特征在于，步骤3)中的三重PCR反应过程为：94℃预变性3min，94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共30-35个循环，72℃延伸5min。
3.根据权利要求1所述的三重PCR检测方法，其特征在于，步骤3)中所述PCR反应体系总体积为25μL，包括：2×PCR Mix 12.5μL，浓度为10μmol/L的CIV-F和CIV-R各0.5μL；浓度为10μmol/L的CRV-F和CRV-R各0.5μL，浓度为10μmol/L的CCOV-F和CCOV-R各0.25μL，模板3μL，加双蒸水补足至25μL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的三重PCR检测方法，其特征在于，步骤3)中所述CIV病毒的扩增产物片段长度为244bp，CCOV病毒的扩增产物片段长度为333bp，CRV病毒的扩增产物片段长度为425bp。
5.根据权利要求1所述的三重PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中所述CIV病毒的GeneBank序列号为KM594565.1。
6.根据权利要求1所述的三重PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中所述CRV病毒的GeneBank序列号为AY007384。
7.根据权利要求1所述的三重PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中所述CCOV病毒的Gene Bank序列号为KP849472。
8.一种检测犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR的试剂盒，包括权利要求1的三重PCR反应体系和阳性对照物，所述阳性对照物由分别含有CIV、CRV和CCOV基因组片段的阳性质粒pEASY－I、pEASY－R和pEASY－C等量混合制得。
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