CN102803515A - 用于流感病毒检测的通用测试 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及流感病毒检测与定量分析的通用方法。这些方法可使用逆转录(RT-PCR)实时(q-PCR)测试，所述测试扩增A型或B型流感毒株内的保守区。所述测试能定量分析流感病毒RNA分子或全病毒颗粒，而不论具体的病毒株(例如，人、禽、猪流感)。所述方法特别适合作为诊断测试或用于监测疫苗生产过程。

Description

用于流感病毒检测的通用测试
本申请要求2009年5月8日提交的美国临时专利申请号61/215,704，2009年5月26日提交的美国临时专利申请号61/217,045的优先权，上述两者的全部内容通过引用纳入本文。
技术领域
本发明涉及流感病毒检测与定量分析的新型通用方法。本发明优选使用逆转录(RT-PCR)实时(q-PCR)测试，所述测试扩增A型或B型流感毒株内的保守区。本发明的测试能定量分析流感病毒RNA分子或全病毒颗粒，而不论具体的病毒株(例如，人、禽、猪流感)。本发明的方法特别适合作为诊断测试或用于监测疫苗生产过程。
发明背景
目前有多种形式的流感疫苗。疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于全病毒颗粒、裂解病毒颗粒或基于纯化的表面抗原(详见明确引用的WO 2008/068631)。流感疫苗通常为三价，含有两种A型流感毒株和一种B型流感毒株。除了传统上基于鸡蛋的流感疫苗生产方法外，近来描述了基于细胞培养的不同生产方法(参见Vaccines(《疫苗》)中第17和18章，Plotkin和Orenstein编，第4版，2004，ISBN：0-7216-9688-0；Wilschut；Mc Elhaney、Palache，“Influenza(流感)”；第2版，埃尔斯威尔公司(Elsevier)2006；ISBN 0-7234-3433-6中第9章)。
目前很少有基于核酸的检测方法应用于流感疫苗生产过程中(例如，用于质量控制过程)。这是由于用于疫苗生产的流感毒株每季都有变化，因此每季都需要开发新的毒株特异性检测试验。本发明提供新型核酸测试，分析A型流感或B型流感毒株基因组内保守区(不考虑来源，如人、禽、猪流感)。因此，这些测试适于分析多种流感毒株。
发明内容
本发明描述了检测流感病毒RNA的新型方法。本发明的方法分析A型流感或B型流感基因组内的保守区，优选编码基质(M)蛋白的区域。表3和表4分别显示来自GenBank的M基因核苷酸序列，其用于比对A型流感M基因和B型流感M基因。
为作分析，进行核酸测试。优选测试为逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)。但是，本领域技术人员已知的等效的RNA扩增方法也适用(US-5409818中基于核酸序列的扩增或NASBATM；3SRTM；US-5399491中转录介导的扩增或TMATM等)。优选以实时测试运行核酸测试(例如，“qPCR”；TaqmanTM，LightcyclerTM；ScorpionTM等)。
优选的“一步RT-实时PCR”的详述
在特别优选的实施方式中，采用一步RT-实时PCR测试(“一步RT-qPCR”)。本领域技术人员熟悉此类“一步RT qPCR”测试的进行。技术人员了解如何发现此类扩增的具体反应条件。因此，逆转录反应(RT)和扩增反应(qPCR)可在同一容器内(例如，在单一管或小瓶中)而不用在不同容器内进行。
优选使用市售RT-PCR试剂盒，例如凯杰公司(Qiagen)QuantiTectTM病毒试剂盒或英杰公司(Invitrogen)Super ScriptTM III PlatinumTM试剂盒。可用本领域已知的相应实时循环仪软件分析所得荧光信号。
本发明的核酸测试可通过比较所得荧光信号与本领域已知标准核酸的相应信号来进行定量分析。此类标准品优选采用相应病毒区体外转录物(IVT)的稀释系列。合适的IVT可按要求产生或可购得，例如PanomicsTM提供10ng/ml的“Ifn-A”(282种核苷酸)和“Ifn-B”(276种核苷酸)单链RNA分子。
优选用下表1所示引物和探针序列进行RT-q PCR。但是，本领域技术人员知晓如何针对M蛋白编码基因组或流感基因组内其他保守区设计其他等效引物和探针。本领域技术人员已知下表所示Taqman探针可用等效的Lightcycler探针或其他实时探针系统替换。
在特别优选的实施方式中，SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 7所示引物与SEQ ID NO 3所示探针联用于检测A型流感病毒。在另一优选实施方式中，SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 1所示引物与SEQ ID NO 9所示探针联用于检测B型流感病毒。
实施例(见下文)显示本发明的一步RT qPCR测试能检测不同来源的流感病毒。
优选实施方式：完整病毒的检测
在特别优选的实施方式中，本发明的测试用于测定样品内完整病毒颗粒的含量。这对于监测疫苗生产过程特别有用(详见下文)。可通过在扩增前去除样品内的游离RNA来区分游离病毒RNA或核蛋白相关RNA与病毒颗粒内的RNA。例如，如本领域所知，这可通过RNA酶处理实现。优选的方法如下：
(a)取病毒颗粒、病毒RNA和核蛋白的样品(例如，体积为21μl)。
(b)与RNA酶一起孵育。例如，用RNA酶A/T1(15U/7.5U)的混合物孵育1小时)。
(c)稀释所述样品。例如，用移液机器人进行样品的预稀释(1∶100-1∶10000以在qPCR的线性范围(Ct 15-33)内获得可靠的定量结果；
(d)提取核酸。例如通过使用磁珠进行全自动vRNA提取；
(e)qPCR。qPCR可由移液机器人设定。样品中每毫升拷贝数的计算与体外转录RNA(IVT)的UV定量所得标准曲线相关。
因此，本发明提供方法定量分析样品中完整病毒颗粒的含量，其包括以下步骤：(a)去除样品中非病毒颗粒包封的RNA(例如，通过RNA酶消化)；(b)扩增并定量分析样品中剩余的RNA(例如，如本文所述)；(c)用步骤(b)的结果计算样品内完整病毒颗粒的含量。此方法对A型和B型流感病毒特别有用，尤其是在疫苗制备中。
步骤(b)可包括定量PCR(例如RT-PCR)。步骤(b)的结果可以与标准RNA所产生的信号比较，以作为步骤(c)计算的一部分。步骤(a)与(b)之间，可处理病毒颗粒以释放其RNA，或者这一释放可在进行PCR过程中自然发生。
本发明在流感疫苗生产中的优选应用
本发明的测试特别有助于基于鸡蛋或细胞培养的流感疫苗生产(综述参见：Wilschut，Mc Elhaney，Palache，“Influenza(流感)”；第2版；埃尔斯威尔出版社，2006；ISBN 0-7234-3433-6中第9章)。所述发明可用于疫苗生产中的不同步骤，特别用于监测并定量分析早期步骤中的病毒得率。本发明的方法原则上适于多种流感疫苗的生产(例如，活病毒、灭活全病毒颗粒、′裂解′病毒颗粒、纯化表面抗原；详见申请人明确引用的WO2008/068631)。这些生产方法中，病毒颗粒在含病毒液体如尿囊液或细胞培养上清液中生长并从中收集。为纯化病毒颗粒，可用不同方法，例如使用含去污剂以破坏病毒颗粒的线性蔗糖梯度溶液进行的区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、曲通X-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、特吉托NP9等)处理纯化的病毒颗粒以获得裂解病毒颗粒，从而产生亚病毒颗粒制剂，包括′吐温-醚′裂解方法。例如，裂解流感病毒的方法是本领域熟知的(综述参见WO 2008/068631)。裂解流感疫苗的示例有BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONETM和FLUSHIELDTM产品。本发明的方法也可用于活疫苗的生产。这些疫苗中的病毒可被减毒。活病毒疫苗包括医学免疫公司(MedImmune)的FLUMISTTM产品(三价活病毒疫苗)。纯化的流感病毒表面抗原疫苗包含表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。以纯化形式制备这些蛋白质的方法是本领域熟知的。FLUVIRINTM、AGRIPPALTM和INFLUVACTM产品是流感亚基疫苗。另一种形式的灭活抗原是病毒体(不含核酸的病毒样脂质体颗粒)。病毒体可通过用去污剂溶解病毒，然后去除核衣壳和重建含病毒糖蛋白的膜来制备。另一种制备病毒体的方法包括将病毒膜糖蛋白加入至过量磷脂，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。
本发明在基于细胞培养的流感疫苗生产中的特别优选应用
在特别优选的实施方式中，本发明用于基于细胞培养的流感疫苗生产。例如在WO 2008/068631中描述了合适的细胞系。用于培养流感病毒的最优选的细胞系是MDCK细胞系。原始MDCK细胞系可获自ATCC(CCL-34)，但也可利用该细胞系的衍生细胞系和其他MDCK细胞系。例如，WO97/37000中公开了适合悬浮培养的MDCK细胞系(′MDCK 33016′，保藏号DSM ACC 2219)。类似地，WO01/64846公开了在无血清培养基中悬浮培养的MDCK衍生细胞系(′B-702′，保藏号FERM BP-7449)。WO2006/071563公开了非致瘤性MDCK细胞，包括′MDCK-S′(ATCCPTA-6500)、′MDCK-SF101′(ATCC PTA-6501)、′MDCK-SF102′(ATCCPTA-6502)和′MDCK-SF103′(PTA-6503)。WO2005/113758公开了非常容易感染的MDCK细胞系，包括‘MDCK.5F1’细胞(ATCC CRL 12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。
基于细胞培养的疫苗生产方法通常包括以下步骤：各单价部分的起始材料是单管MDCK工作细胞库(WCB)。所述细胞在化学限定的培养基中增殖以优化生产中的细胞生长。通过转瓶中的顺序传代然后放大至更大体积的发酵容器中来扩增WCB。添加种病毒，病毒增殖在发酵罐中进行2-4周。感染周期结束时，离心并过滤病毒悬液以除去培养收集物中残留的完整细胞。离心、过滤后的部分称为澄清病毒收获物，这是发酵过程的终点。澄清病毒收获物可在不锈钢保存容器中室温保存(16-25℃)最多24小时。通过层析和超滤/渗滤步骤纯化流感病毒，用β-丙内酯(BPL)灭活并用溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)破坏使病毒表面抗原HA和NA溶解。药物物质生产方法的最后是将浓缩物过滤入最终的散料容器以获得单价单价散料。最后，单价散料可混入多价散料(通常为三价散料)并装入最终容器，如注射器中。这是使最终疫苗中残留细胞系DNA量最少从而使DNA的致癌活性最小化的标准操作(详见WO 2008/068631)。
本发明可用于这一过程中的不同时间点。但特别优选本发明的方法用于监测和/或定量分析过程早期阶段(发酵、收获、直至灭活)的病毒得率。本发明的测试可用作本领域现有方法(单径向扩散(SRD))的补充或替代方法。本发明的方法快速(～4小时内得到结果；SRD需～3天)并能以高样品通量应用。所述方法独立于特异性试剂(例如，毒株特异性抗体)。本发明的测试特别适用于SRD灵敏度过低(纯化/浓缩前)或SRD结果不可靠(收获/测得无病毒颗粒相关HA时)的情况。
在特别优选的实施方式中，本发明用于定量分析发酵过程中的病毒载量，以确定收获病毒的最优时间。
在进一步特别优选的实施方式中，所述核酸分析前进行病毒样品的RNA酶消化。这样能区分游离病毒RNA和完整病毒颗粒，从而能定量完整病毒颗粒。
疫苗组合物和疫苗给予
本发明还提供上述本发明制备方法生产的疫苗。这类疫苗通常含有HA作为主免疫原，参照一般由SRD测定的HA水平来标准化疫苗剂量。现有的疫苗一般含有约15μg HA/毒株，但也可使用更低的剂量，例如在儿科应用或大流行情况下，或者是使用佐剂时。分数剂量如1/2(即7.5μg HA/毒株)、1/4和1/8以及较高剂量(如3x或9x剂量)已有应用。因此，疫苗可包含0.1-150μg HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括例如，约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约3.75、约1.9、约1.5μg等/毒株。就活疫苗而言，利用组织培养感染剂量中值(TCID50)而非HA含量来测量剂量，TCID50一般为106-108(优选为106.5-107.5)/毒株。
本发明所得流感毒株可以具有野生型病毒中的天然HA，或具有修饰HA。例如，已知修饰HA去除决定簇(如HA1/HA2切割位点周围的超碱性区域(hyper-basic region))使病毒在禽类动物中具有高致病性。称为“反向遗传学”的所述应用促进这类修饰。
用于疫苗的流感病毒株随季节而变。在大流行间期，疫苗一般包括两种A型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种B型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明也用于生产疫苗抵御大流行病毒株(即疫苗接受者和普通人群没有与其发生过免疫接触的毒株，特别是A型流感毒株)，如H2、H5、H7或H9亚型毒株以及H1亚型毒株，大流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗，或者可以基于补充有大流行毒株的正常三价疫苗。然而，根据季节和疫苗所含抗原的特性，本发明还可用于生产疫苗抵御一种或多种HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16，和/或NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。
除了适合生产疫苗抵御大流行间期毒株外，本发明的组合物特别有助于生产疫苗抵御大流行毒株。可能引起大流行爆发的流感毒株的特征是：(a)与目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即十年来在人群中未显见的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如通常只出现在鸟群体中的H5、H6或H9)，从而人群未曾免疫接触过该毒株的血凝素；(b)它能够在人群中水平传播；和(c)它对人有致病性。优选用含H5血凝素类型的病毒免疫以抵御大流行流感，如H5N1毒株。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出现的大流行毒株和H1N1毒株。
本发明组合物可包含一种或多种(如1、2、3、4或更多种)流感病毒株，包括A型流感病毒和/或B型流感病毒的抗原。疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，收获病毒后将它们混合在一起，然后制备抗原。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。通常为三价疫苗，其包含来自两种A型流感病毒株和一种B型流感病毒株的抗原。也可用四价疫苗，其包含来自2种A型流感病毒株和2种B型流感病毒株的抗原；或者来自3种A型流感病毒株和一种B型流感病毒株的抗原(WO2008/068631)。
如本发明所述制备的疫苗组合物是药学上可接受的。它们通常还包含抗原外的其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。如下所述，也可包含佐剂。此类组分的详细讨论可见参考文献(明确引用的WO2008/068631)。本发明组合物优选包含佐剂，佐剂的作用是增强在接受组合物的患者中引起的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。优选的佐剂包含水包油乳液。已知各种这类乳液，其通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。所述油可包括鲨烯。乳剂中的油滴直径通常小于5μm，理想情况下具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。WO2008/068631(第14页起；其已明确引用；例如MF59TM)中详述了可能的佐剂。适用于本发明组合物(或药盒组分)的容器包括无菌药瓶、注射器(如一次性注射器)、鼻喷雾等。WO2008/068631(第31页；其已明确引用)中详述了此类容器。
本发明提供按本发明所述制备的疫苗。这些疫苗组合物适合给予人类患者，且本发明提供了引起患者免疫应答的方法，该方法包括将本发明组合物给予患者的步骤(详述于WO 2008/068631；第32页起，其已明确引用)。
序列与药盒
本发明还有部分是表1所列引物和探针序列(SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11)。SEQ ID NO：8包括两个简并碱基，因此可呈现4种分离的独立寡核苷酸序列。
对于A型流感：正向引物包括SEQ ID NO：5、2和7；反向引物是SEQID NO：4；可用探针是SEQ ID NO：3。对于B型流感：反向引物包括SEQ IDNO：8、10和1；正向引物是SEQ ID NO：11；可用探针是SEQ ID NO：9。SEQ ID NO：6是A型流感的又一个正向引物。术语‘正向’仅为方便而用，指与基质蛋白含ATG的编码链具有同一编码意义的引物。由于流感病毒具有负链基因组，涉及与病毒基因组RNA片段杂交时术语正向和反向应反转。
本发明的进一步实施方式是SEQ ID NO 4和7所示引物与SEQ ID NO3所示探针(A型流感)的特定组合，以及SEQ ID NO 11和1所示引物与SEQID NO 9所示探针(B型流感)的特定组合，特别是以药盒形式。所述药盒可含有其他组分，例如缓冲液、聚合酶和其他扩增用反应组分。本发明的又一方面是所述序列、组合物和药盒在诊断应用的疫苗生产过程中检测流感病毒和特别用于定量分析病毒的用途。
其他有用引物是SEQ ID NO：12、13、14和15。其他有用探针是SEQ IDNO：16和17。SEQ ID NO：14和15可与SEQ ID NO.：16联用。SEQ ID NO：17可与SEQ ID NO：4和7联用。
本发明的探针(例如，SEQ ID NO：3和9)可标记有例如5′6-羧基荧光素(6FAM)标记和/或3′‘黑莓淬灭剂’(BBQ)标记。
本发明还提供包含选自SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所示核苷酸序列的核酸。这些核酸应为单链，长度小于80个核苷酸，例如小于50个核苷酸或小于30个核苷酸。它们可用作引物和/或探针以检测流感病毒。所述核酸可具有与相关SEQ ID NO相同的3′残基，即，其可包含序列5′-X-Y-3′，其中Y是选自SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的序列；且X是具有1个或多个核苷酸的核苷酸序列。具有序列5′-X-Y-3′的核酸可杂交流感病毒基质核酸。
附图简要说明
图1显示qPCR病毒颗粒测定与感染期间测得的已知感染性病毒动力学的关联。X轴表示感染后的小时数。Y轴以对数标度显示qPCR测得的每毫升拷贝数。该图显示低m.o.i.时qPCR曲线对应于标准感染性病毒滴度动力学。具体地，16-24小时后上清液中可测得病毒后代，48小时后得到最大感染性。每条线显示不同实验。
图2显示由透射电子显微镜测得病毒颗粒与由本发明所述qPCR测得病毒颗粒数量间的关联。X轴显示每毫升的TEM病毒颗粒计数数量，y轴显示qPCR测得的每毫升拷贝数。
实施本发明的具体实施方式
不同流感亚型的检测
从德国国立动物流感研究中心(罗福乐研究所(Frierich LoefflerInstitute)，黎姆斯)获得流感病毒株。所述毒株在MDCK 33016PF细胞上培养，通过本发明的RT-PCR方法使用凯杰公司QuantiTectTM病毒试剂盒或英杰公司Super Script(TM)III PlatinumTM试剂盒分析第一和第二代上清液。所用引物和探针见表1所示。
使用QuantiTectTM病毒试剂盒时，运行以下温度曲线：
-荧光信号测定：60℃
-温度变化速率2℃/秒
-RT步骤：50℃20分钟
-Taq活化95℃5分钟
-主运行：45轮循环：94℃15秒；60℃45秒(2步法)或45轮循环：94℃15秒；60℃30秒；72℃30秒(3步法)。
使用Super Script(tm)III PlatinumTM试剂盒时，运行以下温度曲线：
-荧光信号测定：60℃
-温度变化速率2℃/秒
-RT步骤：50℃15分钟
-Taq活化95℃2分钟
-主运行：45轮循环：94℃15秒，60℃45秒
用相应的实时软件分析荧光信号。通过比较所得荧光信号与IVT系列稀释的相应信号定量分析所述信号。表2所示结果表明所有测试的流感病毒亚型都能用同一组引物和探针鉴定。这表明本发明的方法能检测多种不同流感亚型。发明人还检测了表7所示流感毒株。
为了评估本发明方法的灵敏度，进行含A/Bayern/7/95流感毒株或B/Baden Württemberg/3/06流感毒株样品的系列稀释。使用QuantiTectTM病毒试剂盒或Super Script(tm)III PlatinumTM试剂盒按本发明的方法(如上所述)或CepheidTM流感病毒A/B引物与探针组按生产商的方案对所述样品进行qPCR。用相应的实时软件分析荧光信号。通过比较所得荧光信号与IVT系列稀释的相应信号定量分析所述信号。结果列于表5和6。对于A型流感毒株，当使用本发明的方法时在多至1∶1000000稀释时病毒颗粒仍可检测，而Cepheid试剂盒最多只可检测1∶100000稀释时的病毒颗粒。对于B型流感毒株，病毒颗粒在多至1∶1000000稀释时仍可检测，而Cepheid试剂盒最多只可检测1∶10000稀释时的病毒颗粒。因此，本发明的方法比现有技术的方法灵敏得多。
样品中流感病毒颗粒的定量分析
样品中流感病毒颗粒测定如图1所示。简单来说，21μl样品用15U RNA酶A和7.5U T1的混合物进行RNA酶处理。样品与RNA酶混合物一起孵育1小时。经预处理的样品以1∶100-1∶10000的比例稀释以获得qPCR给出结果在线性范围内的稀释液。样品按本文的方法进行qPCR。所述结果与用体外转录RNA(IVT)所得标准曲线比较。结果(图1所示)显示低MOI时qPCR拷贝数所得曲线对应于标准感染性病毒滴度动力学。具体地，16-24小时后上清液中可测得病毒后代，48小时后得到最大毒力滴度。
由透射电子显微镜和本发明所述qPCR评估的病毒颗粒的关联
所得流感毒株是A/Bayern/7/95、A/New Caledonia/20/99、A/HongKong/8/68、B/Lee/40和A/Puerto Rico/8/34从ABI在线(ABI online)获得。通过透射电子显微镜(TEM)评估病毒颗粒数。为此，将病毒颗粒施用到涂层铜网格上并空气干燥。然后所述材料用2.5％(v/v)戊二醛固定、清洗并用2％(w/v)乙酸铀水溶液和2％(w/v)磷钨酸(PTA)pH 6.5染色。用TEM确定样品中的病毒颗粒数。TEM计数所得病毒颗粒数与本发明所述qPCR评估所得病毒颗粒数作比较。结果(见图2)显示本发明的方法精确测定样品中各种不同流感毒株的病毒颗粒数。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可进行修改而仍在本发明的范围和构思内。
表1：用于检测A型和B型流感病毒的优选引物与探针序列。探针序列为TaqmanTM探针。
Figure BPA00001481580900111
表2
Figure BPA00001481580900112
Figure BPA00001481580900121
表3
Figure BPA00001481580900122
Figure BPA00001481580900151
表4：
Figure BPA00001481580900152
表5：A/Bayern/7/95
Figure BPA00001481580900161
表6：B/Baden-Württemberg/3/06
Figure BPA00001481580900162
表7
Figure IPA00001481580300011
Figure IPA00001481580300021
Figure IPA00001481580300031

Claims (16)

1.一种检测流感病毒RNA的方法，其特征在于，流感基因组内的保守区得到扩增。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述保守区部分或全部编码M蛋白。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法提供的扩增子包含SEQID NO 3或SEQ ID NO 9。
4.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，进行一步RT-qPCR。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，使用表1所示(SEQ ID NO 1-11)的至少一种引物或探针。
6.一种定量分析流感病毒RNA含量的方法，其特征在于，进行以下步骤：
a)采用如权利要求1-5中任一项所述的方法，
b)所得信号与标准RNA所得信号作比较，
c)获得病毒RNA的含量。
7.一种定量分析样品中完整病毒颗粒含量的方法，其特征在于，进行以下步骤：
a)去除样品中的游离病毒RNA，
b)采用如权利要求1-5中任一项所述的方法，
c)所得信号与标准RNA所得信号作比较，
d)获得完整病毒颗粒的含量。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中的RNA用RNA酶处理去除。
9.一种生产流感疫苗的方法，其中采用如上述权利要求之一所述的方法。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法用于基于细胞培养的生产过程中的发酵步骤，且定量分析病毒颗粒的含量以确定收获病毒的最优时间。
11.一种基于细胞培养生产流感疫苗的方法，其特征在于，进行以下步骤：
●在发酵容器内增殖细胞；
●添加种病毒；
●采用权利要求7所述的方法监测所述病毒增殖；
●离心并过滤所述病毒悬液；
●所述病毒通过层析和超滤/渗滤步骤纯化，灭活，破坏以使病毒表面抗原HA和NA溶解；
●所述抗原过滤以获得单价散料；
●任选地，将所述单价散料混入多价散料(通常为三价散料)并装入最终容器。
12.如权利要求9或10所述的方法制得的流感疫苗。
13.一种诊断流感的方法，其特征在于，其中采用如权利要求1-6之一所述的方法。
14.表1所示引物和探针寡核苷酸(SEQ ID NO 1-11)。
15.一种药盒，其包含至少一种权利要求14所述的引物或探针，并任选地包含其他组分，例如进行核酸扩增用的试剂，和进行扩增的说明。
16.如权利要求13所述的寡核苷酸和权利要求14所述的药盒在流感疫苗生产或流感诊断中的应用。
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