CN112831596A - 一种利用数字pcr检测h9n2亚型禽流感病毒含量的方法 - Google Patents

一种利用数字pcr检测h9n2亚型禽流感病毒含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法，提取待检样品中H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因DNA制备DNA模板溶液，和提前设计的HA基因与NA基因的引物与探针一起制备微滴，然后进行PCR扩增，最后用微滴分析仪检测得到H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因的拷贝数。该方法检测H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因的拷贝数的灵敏度高，可通过数字PCR技术检测H9N2亚型禽流感病毒含量来优化无血清全悬浮MDCK细胞增值H9N2亚型禽流感病毒的技术参数，建立实验的优势，增加可信度。

Description

一种利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法。
背景技术
目前，家禽年出栏量和产值在逐年上升，但禽流感的持续爆发严重危害了养禽业，不仅造成了巨大的经济损失，还引起了多起公共卫生事件，接种禽流感疫苗是最有效的防控手段，因此必须提高禽流感疫苗技术水平。
传统禽流感疫苗通过鸡胚培养生产，效率低、成本高、品质不稳定。国内多家单位也开展了禽流感细胞苗的研究，但由于微载体工艺扩大困难、细胞密度和病毒滴度较低等的因素制约了其产业化进程。而细胞悬浮培养是大规模培养动物细胞生产生物制品的核心技术，是生物制药行业发展的必然趋势，该技术完全克服了以往技术的弊端。
全悬浮无血清MDCK细胞培养H9N2亚型禽流感病毒是旨在克服鸡胚或贴壁细胞生产禽流感病毒缺点基础之上建立的一种先进的培养方式，即能节约成本、省时省力、又能扩大培养，生产高质量、高滴度的禽流感病毒。然而目前全悬浮无血清MDCK细胞培养H9N2亚型禽流感病毒工艺尚未成熟，未能把握H9N2亚型禽流感病毒增值的关键因素,无法来满足市场对大量生产H9N2亚型禽流感病毒疫苗的需求。目前虽然可以从HA滴度值、鸡胚半数感染量、单位细胞均产毒量、活细胞密度等方面探讨无血清全悬浮MDCK细胞增值H9N2亚型禽流感病毒的规律及优化，但是未曾有文献报道从基因水平来分析不同参数下禽流感病毒增值的规律，例如利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量来优化无血清全悬浮MDCK细胞增值H9N2亚型禽流感病毒的技术参数。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法，提取待检样品中H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因DNA制备DNA模板溶液，和提前设计的HA基因与NA基因的引物与探针一起制备微滴，然后进行PCR扩增，最后用微滴分析仪检测得到H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因的拷贝数。该方法检测H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因的拷贝数的灵敏度高，可通过数字PCR技术检测H9N2亚型禽流感病毒含量来优化无血清全悬浮MDCK细胞增值H9N2亚型禽流感病毒的技术参数，建立实验的优势，增加可信度。
本发明的技术方案为：
一种用于检测H9N2亚型禽流感病毒含量的特异性引物与探针组合，包括以下2对特异性引物对和2条分别与引物对配合使用的特异探针，其中一对特异性引物为HA-F和HA-R，对应的探针为HA-P；另外一对特异性引物为NA-F和NA-R，对应的探针为NA-P；
其中，引物HA-F的的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；
引物HA-R的的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；
探针HA-P的的核苷酸序列如SEQ NO.3所示；
引物NA-F的的核苷酸序列如SEQ NO.4所示；
引物NA-R的的核苷酸序列如SEQ NO.5所示；
探针NA-P的的核苷酸序列如SEQ NO.6所示
其核苷酸序列分别为：
HA-F：attgtaggtcccgttccga(SEQ NO.1)
HA-R：atgcggtggaagatgagaaa(SEQ NO.2)
HA-P：tgcattggtcatcaca(SEQ NO.3)
NA-F：tccaaacatcattaccatcgtc(SEQ NO.4)
NA-R：ttgagtcccgttatgtgtgct(SEQ NO.5)
NA-P：ccatcctttcactcct(SEQ NO.6)。
一种利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品中H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因RNA，然后对该基因RNA反转录为cDNA；
(2)以此cDNA为模板，以上述HA-F、HA-R、NA-F、NA-R为引物，以上述HA-P、NA-P为探针，加入数字PCR反应缓冲液和双蒸水作为反应体系；
(3)将步骤(2)中反应体系制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR反应扩增仪中进行扩增；
(4)将扩增后的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，得到H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因的拷贝数。
优选地，步骤(3)中的扩增条件为：95℃预变性10min，94℃变性30sec，60℃退火60sec，共40个循环，98℃延伸10min，最后4℃保温，每步都设置小于2.5℃/sec的升降温速度。
优选地，所述反应体系为：数字PCR反应缓冲液10uL，HA-F、HA-R、NA-F和NA-R引物共3.6uL(终浓度均为10uM)，HA-P和NA-P探针共1uL(终浓度均为10uM)，cDNA模板2uL，双蒸水3.4uL，总体系共20uL。
上述利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法在优化无血清全悬浮MDCK细胞增值H9N2亚型禽流感病毒的技术参数中的应用，包括以下步骤：
将不同技术参数下无血清全悬浮MDCK细胞增值的H9N2亚型禽流感病毒样品提取H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因RNA，然后反转录为cDNA，通过上述数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法，测定不同技术参数下无血清全悬浮MDCK细胞增值的H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因的拷贝数，通过H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因拷贝数的差异，确定并优化无血清全悬浮MDCK细胞增值的H9N2亚型禽流感病毒的技术参数。
本发明的有益效果如下：
本发明一种利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法检测H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因的拷贝数的灵敏度高，可通过数字PCR技术检测H9N2亚型禽流感病毒含量来优化无血清全悬浮MDCK细胞增值H9N2亚型禽流感病毒的技术参数，建立实验的优势，增加可信度。
附图说明
附图1为实施例1中MOI为0.01和0.0001时不同感染时间数字PCR检测HA基因拷贝数结果；
附图2为对比例1中目的基因HA梯度稀释样品扩增曲线；
附图3为对比例1中目的基因HA梯度稀释样品溶解曲线；
附图4为对比例1中目的基因HA标准曲线结果，纵坐标是CT值；横坐标LogCO，LogCO是指Log浓度即取浓度的对数，Slope＝-3.237，扩增效率：E＝10-1/斜率-1＝10-1/-3.237-1＝103.7％，相关系数：R2＝0.9989，YIntercept:37.75，Error:0.0494；
附图5为对比例1中目的基因NA梯度稀释样品扩增曲线；
附图6为对比例1中目的基因NA梯度稀释样品溶解曲线；
附图7为对比例1中目的基因NA标准曲线结果，纵坐标是CT值；横坐标LogCO，LogCO是指Log浓度即取浓度的对数，Slope＝-3.016扩增效率：E＝10-1/斜率-1＝10-1/-3.016-1＝114.6％，相关系数：R2＝0.9991，YIntercept:39.98，Error:0.0361；
附图8为对比例1中第一批样品病毒基因HA扩增曲线，其中a图为1—14个样品病毒基因HA扩增曲线，b图为15-39个样品病毒基因HA扩增曲线；
附图9为对比例1中第一批样品病毒基因NA扩增曲线，其中a图为1—14个样品病毒基因NA扩增曲线，b图为15-39个样品病毒基因NA扩增曲线；
附图10为对比例1中第一批样品病毒基因HA溶解曲线，其中a图为1—14个样品病毒基因HA溶解曲线，b图为15-39个样品病毒基因HA溶解曲线；
附图11为对比例1中第一批样品病毒基因NA溶解曲线，其中a图为1—14个样品病毒基因NA溶解曲线，b图为15-39个样品病毒基因NA溶解曲线；
附图12为对比例1中不同MOI和感染时间下第一批样品Taqman探针法荧光定量检测病毒基因HA拷贝数结果；
附图13为对比例1中不同MOI和感染时间下第一批样品Taqman探针法荧光定量检测病毒基因NA拷贝数结果；
附图14为对比例1中MOI为0.01和0.0001时第二批样品Taqman探针法荧光定量检测病毒基因HA拷贝数结果；
附图15为对比例2中不同MOI时病毒HA滴度的比较图，*表示有显著性差异(p＜0.05)；**表示极显著性差异(p＜0.01)；
附图16为对比例2中不同MOI时病毒含量的比较图，*表示有显著性差异(p＜0.05)；**表示极显著性差异(p＜0.01)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
以下实施例中的H9N2亚型禽流感病毒SS株(细胞适应株)，病毒含量为109.0EID50/0.2mL；全悬浮MDCK-sus细胞均由肇庆大华农农业部动物疫控生物技术与制品创制重点实验室保存供应。
实施例1
一种利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法，包括以下步骤：
(1)根据H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因序列，应用Primer5软件设计特异性引物和探针，引物和探针序列为：
HA-F：attgtaggtcccgttccga
HA-R：atgcggtggaagatgagaaa
HA-P：tgcattggtcatcaca
NA-F：tccaaacatcattaccatcgtc
NA-R：ttgagtcccgttatgtgtgct
NA-P：ccatcctttcactcct
(2)按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0的说明书提取待测样品中H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因RNA，RNA提取后立即按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)的说明书的步骤进行反转录为cDNA(其中待测样品制备步骤如下：取扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液，按照起始密度为1×106cells/mL，同时传至2个125mL的摇瓶中，工作体积为30mL。培养至第60h，按照TPCK胰酶浓度为7ug/mL，分别按感染复数为0.01、0.0001进行接毒，放于33℃、5％CO2培养箱中进行培养。接毒0小时开始取样，每隔24小时取一次样，每次取样每管2ml共2管，取至第96小时，并放于-80℃保存，将样品从冰箱中取出，在室温下解冻得到多个待检测样品)；
(3)以此cDNA为模板，以上述HA-F、HA-R、NA-F、NA-R为引物，以上述HA-P、NA-P为探针，加入数字PCR反应缓冲液和双蒸水作为反应体系，具体反应体系为：反应体系为：数字PCR反应缓冲液10uL，HA-F、HA-R、NA-F和NA-R引物共3.6uL(终浓度均为10uM)，HA-P和、NA-P探针共1uL(终浓度均为10uM)，cDNA模板2uL，双蒸水3.4uL，总体系共20uL；
(4)将步骤(3)中反应体系用QX200(BIO-RAD)微滴制备仪制备微滴，具体操作如下：
将一个新的DG8 cartridgeDG8放入holder中，注意缺口方向；将20ul体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔中(不足8样时用稀释一倍的20ul1Xbuffer controlbuffer补足)；在DG8 cartridge最底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油(DG Oil)，同样不能有空着的孔盖上胶垫(gasket)，注意两边的小孔都要钩牢；将以上holder轻轻地平稳放置于QX200微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态,约2分钟完成；微滴生成于cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴转移到96孔板中，结束后将96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜；
(5)将反应板放入T100(BIO-RAD)PCR仪中进行扩增，扩增条件为：95℃预变性10min，94℃变性30sec，60℃退火60sec，共40个循环，98℃延伸10min，最后4℃保温，每步都设置小于2.5℃/sec的升降温速度；
(6)将扩增后的PCR板放入QX200 Droplet(BIO-RAD)微滴分析仪中，检测微滴，得到MOI为0.01和0.0001时不同感染时间数字PCR检测HA基因拷贝数结果，如附图1所示，当MOI为0.01时病毒HA基因拷贝数总体浓度值高于0.0001组，在第0h为37200copies/uL，在第72h时达到最高值(7E+07)copies/uL，因此通过数字PCR检测得到一个实验结果：以MOI为0.01接种病毒为最佳MOI。
对比例1
(1)Taqman探针法荧光定量标准品配置
配制好25uL反应体系，PCR电泳，回收，然后按目的条带用手术刀切下，进行连接反应，再进行连接产物转化，最后进行质粒提取，定量质粒信息；10倍梯度稀释构建好的各质粒，90uL稀释液+10uL质粒，一般做4-6个点，通过预实验选取合适标准品用于制备标准曲线；
(2)待检测样品制备
取两批扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液，第一批MDCK-sus细胞悬液按照起始密度为1×106cells/mL，同时传至2个125mL的摇瓶中，工作体积为30mL，培养至第60h，按照TPCK胰酶浓度为7ug/mL，分别按感染复数为0.1、0.01、0.001、0.0001进行接毒，放于33℃、5％CO2培养箱中进行培养，接毒0小时开始取样，每隔12小时取一次样，取至第96小时，并放于-80℃保存。第二批MDCK-sus细胞悬液按照起始密度为1×106cells/mL，同时传至2个125mL的摇瓶中，工作体积为30mL，培养至第60h，按照TPCK胰酶浓度为7ug/mL，分别按感染复数为0.01、0.0001进行接毒，放于33℃、5％CO2培养箱中进行培养，接毒0小时开始取样，每隔24小时取一次样，每次取样每管2ml共2管，取至第96小时，并放于-80℃保存。
(3)Taqman探针法荧光定量实验
按照下表1中的反应体系，分别将上述不同浓度的标准品和待检测样品分别进行Taqman探针法荧光定量实验，分别得到目的基因HA梯度稀释样品扩增曲线如附图2所示；目的基因HA梯度稀释样品溶解曲线如附图3所示；目的基因HA标准曲线结果如附图4所示；目的基因NA梯度稀释样品扩增曲线如附图5所示；目的基因NA梯度稀释样品溶解曲线如附图6所示；目的基因NA标准曲线结果如附图7所示；第一批样品病毒基因HA扩增曲线如附图8所示，其中a图为1—14个样品病毒基因HA扩增曲线，b图为15-39个样品病毒基因HA扩增曲线；第一批样品病毒基因NA扩增曲线如附图9所示，其中a图为1—14个样品病毒基因NA扩增曲线，b图为15-39个样品病毒基因NA扩增曲线；第一批样品病毒基因HA溶解曲线如附图10所示，其中a图为1—14个样品病毒基因HA溶解曲线，b图为15-39个样品病毒基因HA溶解曲线；第一批样品病毒基因NA溶解曲线如附图11所示，其中a图为1—14个样品病毒基因NA溶解曲线，b图为15-39个样品病毒基因NA溶解曲线；根据目的基因HA和NA标准曲线结果以及第一批样品检测结果，得到不同MOI和感染时间下第一批样品Taqman探针法荧光定量检测病毒基因HA拷贝数结果如附图12所示，通过Taqman探针法荧光定量检测发现当感染复数为0.01，第72h取样时，病毒基因HA拷贝数达到最高值104445408.6042copies/uL,第0h测得为3778.99copies/uL，且当感染复数为0.01时，各个时间点测得的病毒基因HA拷贝数略高于其它实验组；当感染复数为0.1时，各个时间点测得的病毒基因HA拷贝数明显低于其它实验组。MOI为0.01接种病毒为最佳MOI，这与实施例1中数字PCR检测结果一致；不同MOI和感染时间下第一批样品Taqman探针法荧光定量检测病毒基因NA拷贝数结果如附图13所示，通过对病毒基因NA拷贝数检测发现当感染复数为0.01、0.001、0.0001时各时间点的基因拷贝数高于病毒基因HA拷贝数，且病毒基因HA、NA基因拷贝数有着同幅度变化的趋势；MOI为0.01和0.0001时第二批样品Taqman探针法荧光定量检测病毒基因HA拷贝数结果如附图14所示，通过用Taqman探针法荧光定量检测发现当MOI为0.01时病毒HA基因拷贝数总体浓度值高于0.0001组，在第0h为5053copies/uL，在第72h时达到最高值(6.87E+07)copies/uL，这与实施例1中数字PCR结果保持一致，并且实施例1中数字PCR检测结果的灵敏度更高。
表1 Taqman探针法荧光定量检测病毒基因DNA拷贝数的反应体系
Figure BDA0002284055970000091
对比例2
取扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液采用起始活细胞接种密度1×106cells/mL，设置转速为130r/min、温度为37℃、通入浓度为5％的CO2的条件下，在125mL摇瓶30mL培养体系中进行无血清全悬浮培养并扩繁传代，细胞密度达到对数生长期密度且总量达到一定规模时，分瓶培养，均是125mL摇瓶30mL培养体系。细胞培养至第48H，设计MOI分别为0.1、0.01、0.001、0.0001，根据接种病毒含量与细胞数量比例关系，计算所需接种的AIV体积，同时加入TPCK-胰酶，并转移至5％CO2培养箱继续培养，温度设为33℃。接种病毒24小时起，每12小时取样监测细胞密度和活度；每12小时留取培养液样本待测HA血凝效价和病毒含量，连续观察96小时，做三次重复。
得到的不同MOI时病毒HA滴度的比较图如附图15所示，通过各实验组感染后HA滴度比较，MOI为0.001和0.0001时，感染后HA滴度均在第48小时达到峰值为9.32±0.44log2；当MOI为0.1时，感染后HA滴度值最高为8.73±0.44log2，低于其它实验组；当MOI为0.01时，感染后HA滴度高于其它实验组，且于感染后36小时达到峰值为10log2，随后至72小时，HA滴度保持不变；不同MOI时病毒含量的比较图如附图16所示；当MOI为0.1时，病毒含量最高仅为104.00EID50/0.1mL，而当MOI为0.01、0.001、0.0001时，病毒含量均在48h达到最高点，最高点分别为108.21±0.61EID50/0.1mL、108.00±0.67EID50/0.1mL、107.54±0.07EID50/0.1mL，因此当MOI为0.01时，病毒含量高于其它实验组，且MOI为0.01时病毒含量与MOI为0.1时病毒含量有极显著性差异。据上判断：MOI为0.01接种病毒为最佳MOI，这与实施例1中数字PCR检测结果和对比例1中Taqman探针法荧光定量检测结果一致。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司
<120> 一种利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
attgtaggtc ccgttccga 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
atgcggtgga agatgagaaa 20
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
tgcattggtc atcaca 16
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
tccaaacatc attaccatcg tc 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
ttgagtcccg ttatgtgtgc t 21
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
ccatcctttc actcct 16

Claims (5)

1.一种用于检测H9N2亚型禽流感病毒含量的特异性引物与探针组合，其特征在于，包括以下2对特异性引物对和2条分别与引物对配合使用的特异探针，其中一对特异性引物为HA-F和HA-R，对应的探针为HA-P；另外一对特异性引物为NA-F和NA-R，对应的探针为NA-P；
其中，引物HA-F的的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；
引物HA-R的的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；
探针HA-P的的核苷酸序列如SEQ NO.3所示；
引物NA-F的的核苷酸序列如SEQ NO.4所示；
引物NA-R的的核苷酸序列如SEQ NO.5所示；
探针NA-P的的核苷酸序列如SEQ NO.6所示。
2.一种利用权利要求1所述的异性引物与探针组合进行数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品中H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因RNA，然后对该基因RNA反转录为cDNA；
(2)以此cDNA为模板，以上述HA-F、HA-R、NA-F、NA-R为引物，以上述HA-P、NA-P为探针，加入数字PCR反应缓冲液和双蒸水作为反应体系；
(3)将步骤(2)中反应体系制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR反应扩增仪中进行扩增；
(4)将扩增后的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，得到H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因的拷贝数。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的扩增条件为：95℃预变性10min，94℃变性30sec，60℃退火60sec，共40个循环，98℃延伸10min，最后4℃保温，每步都设置小于2.5℃/sec的升降温速度。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应体系为：数字PCR反应缓冲液10uL，HA-F、HA-R、NA-F和NA-R引物共3.6uL，HA-P和NA-P探针共1uL，cDNA模板2uL，双蒸水3.4uL，总体系共20uL。
5.权利要求2至4所述的任一种方法在优化无血清全悬浮MDCK细胞增值H9N2亚型禽流感病毒的技术参数中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
将不同技术参数下无血清全悬浮MDCK细胞增值的H9N2亚型禽流感病毒样品提取H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因RNA，然后反转录为cDNA，通过权利要求2～4任一项所述的数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法，测定不同技术参数下无血清全悬浮MDCK细胞增值的H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因的拷贝数，通过H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因拷贝数的差异，确定并优化无血清全悬浮MDCK细胞增值的H9N2亚型禽流感病毒的技术参数。
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