CN105331745A - Aiv h7n9亚型双重微滴式数字pcr绝对定量检测试剂盒 - Google Patents

Aiv h7n9亚型双重微滴式数字pcr绝对定量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种AIV？H7N9亚型双重微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒，该试剂盒包含2对特异性引物对和2条与特异性引物对配合使用的特异性探针，其核苷酸序列分别如SEQ？ID？No.1-6所示。本发明的试剂盒利用数字化PCR仪器可快速、特异、灵敏地检测禽流感H7N9亚型病毒，检测灵敏度达到1个拷贝。本发明试剂盒使用方法简单、成本低廉，无需标准曲线，可快速、直接、定量检测禽流感H7N9亚型病毒，非常适用于疾病监测、现场应急以及临床标本的检测，适合大范围推广应用。

Description

AIV H7N9亚型双重微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及试剂盒检测技术领域，具体的说涉及一种检测禽流感病毒H7N9亚型的双重微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒。
背景技术
禽流感病毒H7N9亚型(AIVH7N9)是一种甲型流感病毒，是禽流感病毒的一个亚型。2013年H7N9禽流感感染人病例出来以来，中国杭州疾控中心和WHO中国流感中心共采集、分析了4个新H7N9甲型禽流感的基因组，并在GISAID数据库上公布。利用这4个基因组以及1193个已知的流感各亚型的基因组，分析全面的系统生成树和进化历程。结果表明，在新H7N9亚型型禽流感的8个基因中，表面血凝素(Haemagglutinin，H)蛋白基因来自于H7亚型病毒，神经氨酸酶(Neuraminidase，N)基因来自韩国野鸟中分离的禽流感病毒H11N9，其余6个内核基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)都来自H9N2，表明新H7N9甲型禽流感是一个变异种，是由H7、H11N9、H9N2这三个病毒的基因重组产生的一个全新的基因。
为了对禽流感疫情在早期就能够有效控制，保障动物性食品卫生安全，建立快速、敏感、准确的禽流感H7N9病毒检测方法是十分必要的。近年荧光PCR技术在病毒等微生物检测领域得到广泛的应用,它利用PCR技术对DNA的高效扩增并结合探针技术的高特异性和敏感性,克服了常规血清学和普通PCR方法的不足,但是荧光PCR技术的检测下限仍很高，还不能检测出微量的病毒。
数字化PCR(DigitalPCR，dPCR)的概念早在1999年就由BertVogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminaldilution)。Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化PCR(DropletDigitalPCR，ddPCR)。QX200ddPCR系统包括两台仪器：微滴发生器和微滴分析仪，及其相关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。随后微滴转移至96孔PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(dropletreader)逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。与传统的定量PCR相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。癌症相关突变因浓度较低，往往逃过检测。凭借QX200系统的高灵敏度，研究人员如今可检测浓度低至1/1,000,000的靶分子。
全世界的研究人员已利用系统开展了HIV、癌症和疾病鉴定等方面的开创性研究。利用ddPCR，加州大学的HIV研究人员能够证明一个出生时携带HIV的婴儿已被功能性治愈。目前，还没有将ddPCR应用于禽流感病毒绝对定量检测的报道，虽然ddPCR有望用于癌症筛查、传染病的诊断、食品中转基因成分的定量以及水质监测，但由于目前禽流感病毒容易发生变异，特别是我国2013年发生的人感染禽流感病毒H7N9亚型就是一个新的变异基因，致使对新发现的AIVH7N9的检测工作滞后，无法有效地实现对该亚型病毒的精确、准确、灵敏、高效、特异地检测。因此，亟需一种能够绝对定量检测AIVH7N9的方法，以应用于流行病学调查、疫情监控、口岸检验检疫以及食品卫生保障领域。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测禽流感病毒H7N9亚型的特异性引物和探针组合。
本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和精确度的、操作简单的检测禽流感病毒H7N9亚型的检测试剂盒。
本发明提供了用于检测禽流感病毒H7N9亚型的特异性引物组合，包括以下2对特异性引物对和2条分别与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列分别为：
HA-F：CCAGTGCATGTAGGAGATCAG
HA-R：ACTTAGTCATCTGCGGGAAAG
HA-P：HEX-CAGCATTGTCTGTGTTTGACAGGAGC-BHQ3
NA-F：GGGAAACACTCAAACGGAAC
NA-R：TCATGGCAACTAGTACTTGACC
NA-P：FAM-CCAGCTTATCAGGGCGCGATACT-BHQ1。
本发明提供了上述特异性引物和探针组合在制备禽流感病毒H7N9亚型检测试剂盒或检测试剂中的应用。
本发明提供了一种含有上述特异性引物和探针组合的试剂盒或检测试剂。
本发明提供了一种含有上述特异性引物和探针组合的双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。
优选地，本发明的试剂盒中，HA-P探针的5’端标记荧光基团HEX，3’标记淬灭基团BHQ3，NA-P探针5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ1。
本发明的试剂盒还包含病毒总RNA提取试剂和检测试剂；所述检测试剂包括无RNA酶的蒸馏水，一步法ddPCR探针法预混液，探针法ddPCR微滴发生油，质控液，阴性对照和阳性对照。
所述病毒总RNA提取试剂含有TRIzoL、氯仿或异戊醇、异丙醇。所述一步法ddPCR探针法预混液其900μl的配方为：500μl的2XOne-stepRT-ddPCRSupermix，HA上、下游引物分别为90μl，NA上、下游引物分别为90μl，HA和NA的特异探针分别为20μl，引物和探针的浓度均为10μM。
所述阳性对照为含有AIV-H7N9HA基因组的RNA和NA基因组RNA的混合液，阴性对照为无RNA酶蒸馏水。
本发明的试剂盒其工作原理是采用微滴式数字化PCR(ddPCR)，所述试剂盒的工作程序为：
(1)配制ddPCR反应液；ddPCR反应液20μl配方为：一步法ddPCR探针法预混液18μl，待测样品RNA模板为2μl；
(2)制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增；
(3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果。
在本发明的一个实施例中，制备微滴的方法是采用Bio-Rad公司的QX200系统中的微滴发生器，按照说明书操作进行微滴制备即可。
其中，步骤(2)中PCR的扩增程序为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，54-56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应；每步都设置2.5℃/sec的升降温速度。
本发明提供的试剂盒在食品卫生检验检疫中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：20±5个拷贝；(2)阴性对照：<1个拷贝；待测样本结果判定：(1)阳性：标本检测结果≥1个拷贝。(2)阴性：标本检测结果<1拷贝。
本发明摸索了引物和探针的浓度，找到了最适微滴式数字PCR的引物和探针的工作浓度。摸索了PCR反应过程中最适的升降温速度，以提高数字PCR的扩增效率，使本发明方法能够与BIO-RAD公司的QX200系统相结合。另外，在引物设计方面，由于微滴式数字PCR最后分析结果对PCR的扩增效率要求特别高，且特别灵敏，所以双重的引物探针的设计并非简单依靠软件，还需要有特定的修饰。
本发明试剂盒具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、高准确度、操作简便、适合现场检测等优点，表现在：
(1)高特异性：本发明根据禽流感H7N9(AIV-H7N9)的血凝素基因(HA基因)和神经氨酸酶基因(NA基因)设计了2对特异性引物和2条特异探针，其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行，进一步确保H7N9检出的特异性；
(2)高灵敏度：检测浓度低至1/1,000,000的靶分子；能够直接定量待测样本中H7N9的拷贝数；
(3)低模板：由于检测的灵敏度很高，可以检测出低丰度的目的基因，所以可以降低模板用量，稀释模板浓度，对于一些珍贵，稀少的样本可以有更多的研究；
(4)增加PCR抑制物的耐受：PCR抑制物在数字PCR生成微滴的时候会随机分布在两万个微滴里，PCR抑制物只能影响少量的微滴反应，不影响大局的扩增效果，从此角度说明数字PCR系统可以一定程度上增加PCR抑制物的耐受。
附图说明
图1为HA四对引物：F1R1、F1R2、F2R1、F2R2扩增电泳图，以F2R2引物的扩增效果最佳。其中，泳道M为DL2000marker，泳道1-4分别为HA引物F1R1、F1R2、F2R2、F2R1的扩增结果。
图2为NA四对引物：F1R1、F1R2、F2R1、F2R2扩增电泳图，以F2R2引物的扩增效果最佳。其中，泳道M为DL2000marker，泳道1-4分别为NA引物F1R1、F1R2、F2R2、F2R1的扩增结果。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1检测禽流感H7N9亚型的特异性引物和探针的设计
1、本发明引物、探针设计：以禽流感H7N9(AIV-H7N9)的血凝素基因(HA基因，GenBank登录号为KP417119)为靶基因，以及以禽流感H7N9(AIV-H7N9)的神经氨酸酶基因(NA基因，GenBank登录号为KR351266)为靶基因，进行适用于ddPCR的特异性引物和的设计。
本实施例给出了筛选最佳引物的过程，选择用软件设计出的其中几对备选引物进行筛选，备选引物如下，见表1。
表1
2、引物的筛选
(1)HA的引物随机配为四对：F1R1、F1R2、F2R1、F2R2；NA的引物随机配为四对：F1R1、F1R2、F2R1、F2R2。
(2)然后反转录PCR，PCR体系配方：2XOne-stepRT-ddPCRSupermix10μl，上游引物，下游引物分别为1μl，RNaseFreedH2O3μl，阳性模板5μl。PCR的扩增程序为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，57℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应。
(3)用PCR产物，100V，30分钟跑凝胶电泳，通过凝胶成像，选择特异性好，扩增效率好的引物对。据结果分析，HA选择F2R2引物对，NA选择F2R2引物对，扩增结果的特异性和扩增效率最好。见图1，图2。
3、探针的筛选
(1)引物探针的组合为：1、HA-F2R2P1+NA-F2R2P1；2、HA-F2R2P1+NA-F2R2P2；3、HA-F2R2P2+NA-F2R2P1；4、HA-F2R2P2+NA-F2R2P2。
(2)然后在ddPCR平台上，ddPCR体系配方：2XOne-stepRT-ddPCRSupermix10μl，上游引物，下游引物分别为1μl，探针分别0.5μl，RNaseFreedH2O3μl，阳性模板2μl，总体积20μl(引物和探针的浓度均为10μM)。然后生成微滴。
(3)上PCR仪扩增，PCR的扩增程序为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，55℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。
(4)分析结果：根据实验结果选择HA-F2R2P2+NA-F2R2P2引物探针组合。
实施例2在ddPCR平台上检测H7N9的PCR方法退火温度的优化。
1、选择引物探针的组合为：HA-F2R2P2+NA-F2R2P2。
2、然后在ddPCR平台上，ddPCR体系配方：2XOne-stepRT-ddPCRSupermix10μl，上游引物，下游引物分别为1μl，探针分别0.5μl，RNaseFreedH2O3μl，阳性模板2μl，总体积20μl(引物和探针的浓度均为10μM)。做8个复孔，然后生成微滴。
3、上PCR仪扩增，PCR的扩增程序为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，50～60℃(仪器自动分布8个温度梯度)退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。
4、分析结果：根据实验结果选择54～56℃的退火温度。
实施例3引物、探针浓度的优化实验
设计引物探针浓度均为10μM,组合为HA-F2R2P2+NA-F2R2P2,体系配置方法见表2。
表2
然后在ddPCR平台上生成微滴，转移到96孔板内，封铝膜。
上PCR仪扩增，PCR的扩增程序为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，55℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。
分析结果：根据实验结果选择HA-F2R2P2+NA-F2R2P2引物探针配方，选择引物分别为1.8μl，探针分别为0.4μl。
实施例4PCR扩增升降温速度的优化实验
1、然后在ddPCR平台上，引物探针组合HA-F2R2P2+NA-F2R2P2(浓度为10μM),用ddPCR体系配方：2XOne-stepRT-ddPCRSupermix10μl，上游引物，下游引物分别为1.8μl，探针分别0.4μl，阳性模板2μl，总体积20μl。每台仪器做4个复孔。然后生成微滴，转移到PCR小管内。
2、在两台同样的PCR仪平台上扩增，PCR的扩增程序为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，55℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应，一台设置升降温速度设置为5℃/sec，另一台上设置升降温速度设置为2.5℃/sec，扩增结束后，把PCR小管内的扩增产物转移到同一块96孔板内，封铝膜，上微滴数字PCR检测仪检测。
3、分析结果：根据实验结果分析发现，升降温速度慢的最后检测的微滴数比升降温速度快的多，扩增效率高，升降温速度慢的阴性微滴和阳性微粒之间的距离分的很开，很容易区分，升降温速度快的阴性微滴和阳性微粒之间的距离分的不开，不容易区分，故选择2.5℃/sec升降温速度。
实施例5检测H7N9的双重ddPCR方法的建立
1、双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒的组装
将试剂盒分为A和B两部分组装。A部分为病毒总RNA萃取试剂，B部分为一步法微滴数字PCR检测试剂，方便保存和运输。用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签(标示名称、批号、生产日期、有效期等)。
A部分：(1)溶液A(TRIzoL)一瓶，25mL；(2)溶液B(氯仿/异戊醇)一瓶，6mL；(3)溶液C(异丙醇)一瓶，18mL；
B部分：溶液D(RNaseFreedH2O)1支，1mL；溶液E(一步法ddPCR探针法预混液)一支，900μL；溶液F(探针法ddPCR微滴发生油)一支，7ml；溶液G为ddPCR探针法质控液，3.5ml；溶液H(阳性对照)一支，40μL；溶液I(阴性对照)一支，40μL；使用H7病毒基因组RNA和N9病毒RAN混合液为阳性模板，使用Tris-EDTA缓冲液(0.01MpH8.0)稀释后冷冻保存。将检验合格的阳性对照制剂按400μL定量分装。使用RNaseFreedH2O为阴性对照。
上述一步法ddPCR探针法预混液其900μl的配方为：500μl的2XOne-stepRT-ddPCRSupermix，HA上、下游引物分别为90μl，NA上、下游引物分别为90μl，HA和NA的特异探针分别为20μl，引物和探针的浓度均为10μM。
使用时，在18μl的ddPCR探针法预混液中加入2μl的RNA模板，得到20μl的ddPCR反应液，用于制备微滴。
2、总RNA提取
取100μL组织样品研磨上清液置1.5mLeppendorf管中，加500μL溶液A，混匀，室温剧烈震荡15s，室温静置5min。加120μL溶液B，小心盖上帽盖，室温剧烈震荡15s，室温放置5min。12,000rpm，4℃，离心15min，可见分为三层，上层水相含RNA。转移水相至一新eppendorf管，加入等量溶液C(约500μL)，混匀，室温放置15min。12,000rpm，4℃，离心10min，离心后在eppendorf管边和底部可见有胶样RNA沉淀。洗RNA：弃上清，加1000μL75％乙醇(使用前用溶液D加无水乙醇配置而成，-20℃预冷)漂洗沉淀，12000rpm，4℃，离心5min，弃上清。室温充分干燥RNA沉淀。加15μLRNaseFreedH2O，即可用于PCR扩增。可以-20℃保存备用。
3、双重ddPCR方法的建立
(1)制备ddPCR反应液，总体积20μL。向扩增管中加入下列反应物：
单反应体系配方 一步法ddPCR探针法预混液 18μL
模板 RNA 2μL
空白对照：以RNaseFreedH2O代替模板，同样条件下扩增。
(2)将20μl反应液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20μl1×溶液G补足，建议使用8通道20μl排枪和20μl枪头(不能用200ul枪头)，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。
(3)在微滴发生卡最底下一排8个孔中各加入70μl微滴生成油，同样不能有空着的孔。
(4)盖上胶垫，注意两边的小孔都要钩牢。
(5)将以上卡托轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2分钟之内完成
(6)微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，建议使用8通道排枪和200μl枪头小心缓慢吸取，调整吸取体积为40μl，将卡托放平，枪头以与孔壁呈30～45°角放入，轻触孔底，约5秒吸取40ul，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内(约5秒)，枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的微滴发生卡和胶垫。
(7)封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR，可在任意一台96孔PCR仪上完成，注意升降温速度≤2.5℃/s。推荐反应条件：
(8)将之前完成PCR的96孔板放入plateholder中组装好，注意板斜角方位，组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中。
(9)打开QuantaSoft软件，建议每次实验之前做一次系统清洗，若一周以上未使用建议先做一次填充油路再做系统清洗。之后对96孔板中样品信息进行设置，主要是提供实验名称、实验类型以及探针信息等，完成后即可运行仪器，结束后结果会被自动分析，人工核实后保存结果。
4、结果分析和判定
本发明试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：20±5个拷贝；(2)阴性对照：<1个拷贝；待测样本结果判定：(1)阳性：标本检测结果≥1个拷贝。(2)阴性：标本检测结果<1拷贝。
实施例6本发明试剂盒的特异性评价
按实施例5的建立的方法，同时检测H7N9、H3N2、H9N2、H1N1、H6N2、H5N1六种病毒，以验证本发明试剂盒的特异性。
用以上6种病毒为模板，用H7N9双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒上数字PCR检测系统检测。结果：H7N9为阳性，拷贝数分别为305和280。H3N2、H9N2、H1N1、H6N2、H5N1双通道都为阴性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于检测禽流感病毒H7N9亚型的特异性引物和探针组合，其特征在于，包括以下2对特异性引物对和2条分别与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列分别为：
HA-F：CCAGTGCATGTAGGAGATCAG
HA-R：ACTTAGTCATCTGCGGGAAAG
HA-P：HEX-CAGCATTGTCTGTGTTTGACAGGAGC-BHQ3
NA-F：GGGAAACACTCAAACGGAAC
NA-R：TCATGGCAACTAGTACTTGACC
NA-P：FAM-CCAGCTTATCAGGGCGCGATACT-BHQ1。
2.权利要求1所述的特异性引物和探针组合在制备禽流感病毒H7N9亚型检测试剂盒或检测试剂中的应用。
3.一种含有权利要求1所述特异性引物和探针组合的试剂盒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其为双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含病毒总RNA提取试剂和检测试剂；所述检测试剂包括无RNA酶的蒸馏水，一步法ddPCR探针法预混液，探针法ddPCR微滴发生油，质控液，阴性对照和阳性对照。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有AIV-H7N9HA基因组的RNA和NA基因组RNA的混合液，阴性对照为无RNA酶蒸馏水。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述一步法ddPCR探针法预混液其900μl的配方为：500μl的2XOne-stepRT-ddPCRSupermix，HA上、下游引物分别为90μl，NA上、下游引物分别为90μl，HA和NA的特异探针分别为20μl，引物和探针的浓度均为10μM。
8.如权利要求4-7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作程序为：
(1)配制ddPCR反应液；ddPCR反应液20μl配方为：一步法ddPCR探针法预混液18μl，待测样品RNA模板为2μl。
(2)制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增；
(3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，步骤(2)中PCR的扩增程序为为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，54～56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应，每步都设置2.5℃/sec的升降温速度。
10.权利要求3-9任一所述的试剂盒在食品卫生检验检疫中的应用。
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