CN103160617A - H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种流感病毒rRT-PCR(real-time RT-PCR)检测引物和探针及检测流感病毒的方法及H7N9亚型流感病毒标准品，包括H7N9亚型流感病毒特异性引物和探针3种共9条寡核苷酸引物和探针序列，同时包括待检样本的处理、rRT-PCR反应体系及反应条件、结果分析。能快速有效的甄别人和动物中的H7N9亚型流感病毒。操作简单、应用方便，为临床诊断、检验检疫等领域的流感疫情早期预警机制提供了可行的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种rRT-PCR检测技术及其标准品的制备，尤其涉及一种H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品。
背景技术
流感病毒基因组由8条（甲、乙型）或者7条（丙型）负链RNA节段构成。根据病毒的核蛋白（NP）和基质蛋白（M）不同分为甲型、乙型、丙型。其中A型流感病毒根据血凝素（HA）基因分为HA1-16亚型，根据神经氨酸酶基因（NA）分为NA1-9亚型。H7N9亚型流感病毒是A型流感病毒的一种，禽类是其天然宿主，亚洲、北美洲等地区多个国家的禽类养殖场中检测到过H7N9禽流感病毒。
动物实验表明，H7N9亚型流感病毒能够感染雪貂的上呼吸道和下呼吸道，提示其具有感染人的风险，目前尚无一种快速、灵敏的方法用于检测H7N9亚型流感病毒及其重配变异株。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、应用方便的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，包括以下一种或多种引物和探针：
H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针、H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针；
所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒HA基因相对保守区；
所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒NA基因相对保守区。
本发明的应用上述的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测流感病毒的方法，包括步骤：
首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA；
然后，利用一步法或两步法rRT-PCR试剂加入所述引物和探针进行核酸扩增；
之后，根据Ct值判断rRT-PCR检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。
本发明的流感病毒标准品，含有H7和N9亚型的全长基因，用于上述检测流感病毒的方法的阳性对照品。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所述的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品，由于包括针对H7N9亚型流感病毒HA基因和NA基因相对保守区引物和探针，可以通过rRT-PCR法检测H7N9亚型流感病毒及其变异株，操作简单、应用方便。
具体实施方式
本发明的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR(real-time RT-PCR)检测引物和探针，其较佳的具体实施方式是，包括以下一种或多种引物和探针：
H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针、H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针；
所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒HA基因相对保守区；
所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒NA基因相对保守区。
所述引物和探针包括长度为18～31bp的寡核苷酸片段。
所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针包括以下两套引物/探针组合，共计四条引物序列和二条探针序列：
第一套：
引物序列：5’AGAGATGAAATGGCTCCTGTCAA3’、5’GGTCTTTCCTTGTATTTTTGTATGACTTAG3’；
探针序列：5’FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3’；
第二套：
引物序列：5’TCTCGGTCAATGTGGACTTCTG3’、5’TTAAATCGGCTGAAAATTCTAGGAA3’；
探针序列：5’FAM-ATCACTGGACCACCCCAATGTGACCA-BHQ1-3’；
所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列：
引物序列：5’TGGCAATGACACACACTAGTCAGT3’、5’ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT3’；
探针序列：5’FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1-3’。
所述探针序列两端的标记FAM、BHQ1为荧光素标记。
本发明的应用上述的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测流感病毒的方法，其较佳的具体实施方式包括步骤：
首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA；
然后，利用一步法或两步法rRT-PCR试剂加入所述引物和探针进行核酸扩增；
之后，根据Ct值判断rRT-PCR检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。
所述流感病毒包括以下一种或多种病毒：
禽H7N9亚型流感病毒、内部基因变异的禽H7N9亚型流感病毒、人感染H7N9亚型流感病毒、人感染内部基因变异的H7N9亚型流感病毒。
本发明的流感病毒标准品，其较佳的具体实施方式是：
含有H7和N9亚型的全长基因，用于上述的检测流感病毒的方法的阳性对照品。
进一步用于H7和N9的RNA体外转录和蛋白质体外合成。
本发明中的引物和探针序列（5’→3’）及其检测的靶片段如下：
具体实施例：
包括了寡核苷酸引物的设计、待检样本的处理、检测和分析。为进一步说明流感病毒rRT-PCR检测引物及应用方法，参照下列实施例进行说明：
实施例一：H7N9亚型流感病毒rRT-PCR寡核苷酸引物的设计与合成：
从GenBank流感数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html）中下载H7亚型流感病毒的所有HA序列、N9亚型流感病毒的所有NA序列，使用MEGA5.1进行比对，选择相对保守区设计引物和探针；引物和探针设计中同一变异位点允许2个及2个以下简并碱基。将所提取的备选引物满足以下要求进行筛选：①引物和探针长度在18～31bp之间；②Tm值在42～59℃之间；③GC%在25～75%之间；④polyN≤4bp；⑤Hairpin≤4bp；⑥覆盖率>90%；⑦进行BLAST筛选，特异性分数>L×0.4。最佳Tm值设定在59℃，最佳引物和探针长度为18-25bp。
实施例二：本发明检测未知病毒的应用举例：
1.病毒RNA的提取：
取病毒采样液200μL，加入500μL裂解液，按RNeasy Mini Kit（Qiagen公司，catalog#74104）说明书提取病毒RNA50μL。
2.rRT-PCR反应
1)体系配置：使用Ag Path-IDTM One-step RT-PCR kit（#4387424）反应液
2)rRT-PCR：将加好上述反应体系的反应管放于PCR仪进行rRT-PCR，反应程序如下
3.结果判断：
阴阳对照结果成立的情况下判断结果，要求阴性对照没有Ct值或者为0，阳性参照有Ct值20～30之间。一般情况下Ct小于38的可以判断为阳性。
本发明提供了3套用于甄别H7N9亚型流感病毒的特异性寡核苷酸引物及探针序列。本发明并提供了rRT-PCR的检测体系及其在H7N9亚型流感病毒快速检测中的应用。
检测评价：
特异性评价：选取国内近三年流行季节性流感病毒H1N1亚型,H3N2亚型，乙型流感，腺病毒，副流感病毒，以及HA1-16亚型,NA1-9亚型禽流感病毒RNA进行检测，结果表明对H7N9亚型基因检测为阳性，对其他病毒/基因检测均为阴性。
本发明可以将rRT-PCR技术应用于H7N9亚型流感病毒的甄别。为H7N9亚型流感病毒的实验室诊断提供了快速有效的检测技术，为H7N9亚型流感病毒的早发现、早预防和早治疗以及公共卫生策略的制定提供技术手段和检测依据。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，其特征在于，包括以下一种或多种引物和探针：
H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针、H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针；
所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒HA基因相对保守区；
所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒NA基因相对保守区。
2.根据权利要求1所述的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括长度为18～31bp的寡核苷酸片段。
3.根据权利要求2所述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，其特征在于：
所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针包括以下两套引物/探针组合，共计四条引物序列和二条探针序列：
第一套：
引物序列：5’AGAGATGAAATGGCTCCTGTCAA3’、5’GGTCTTTCCTTGTATTTTTGTATGACTTAG3’；
探针序列：5’FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3’；
第二套：
引物序列：5’TCTCGGTCAATGTGGACTTCTG3’、5’TTAAATCGGCTGAAAATTCTAGGAA3’；
探针序列：5’FAM-ATCACTGGACCACCCCAATGTGACCA-BHQ1-3’；
所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列：
引物序列：5’TGGCAATGACACACACTAGTCAGT3’、5’ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT3’；
探针序列：5’FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1-3’。
4.根据权利要求3所述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，其特征在于，所述探针序列两端的标记FAM、BHQ1为荧光素标记。
5.一种应用权利要求1至4中任一项所述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测流感病毒的方法，其特征在于，包括步骤：
首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA；
然后，利用一步法或两步法rRT-PCR试剂加入所述引物和探针进行核酸扩增；
之后，根据Ct值判断rRT-PCR检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。
6.根据权利要求5所述的检测流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒包括以下一种或多种病毒：
禽H7N9亚型流感病毒、内部基因变异的禽H7N9亚型流感病毒、人感染H7N9亚型流感病毒、人感染内部基因变异的H7N9亚型流感病毒。
7.一种H7N9亚型流感病毒标准品，其特征在于，含有H7和N9亚型的全长基因，用于权利要求5或6所述的检测流感病毒的方法的阳性对照品。
8.根据权利要求7所述的H7N9亚型流感病毒标准品，其特征在于，进一步用于H7和N9的RNA体外转录和蛋白质体外合成。
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