CN109207643A - 一种禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明首先提供一种检测禽流感病毒通用型引物对和探针组,分别是鉴定禽流感病毒M基因的引物对M forward、M reverse和探针组M probe,其中正向引物的序列为SEQ ID NO:1,反向引物的序列为SEQ ID NO:2,探针的序列为SEQ ID NO:3。本发明提供一种基于分子生物学的快速检测禽流感病毒的方法,以实现对禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测,从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测,能够同时检测大量样品并快速判定结果,而且使用TaqMan荧光探针,避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。
Description
技术领域
本发明属于荧光定量RT-PCR检测技术领域,具体涉及一种禽流感病毒通用型荧光定量RT-PCR的检测方法,包括鉴定禽流感病毒的引物对和探针。
背景技术
禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)为单股负链RNA病毒,由8个独立的RNA节段组成,显著的生物学特征之一是亚型众多,变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株,根据其病毒粒子表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异,分为18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。
Perroncito于1878年在意大利首次报道了高致病性禽流感。禽流感现在分布很广,世界各地均有分离该病病原的报道。其病原致病性有高致病性和低致病性之分。近5年来全球共向OIE报告5000余起高致病性禽流感疫情和1000余起低致病性禽流感疫情。禽流感的发生给养禽业造成严重危害。禽流感爆发对中国家禽养殖农户的生计造成了巨大的冲击,农户的家禽养殖收入和家庭收入均显著下降。在控制其他变量的条件下,一次禽流感发生会造成农户人均家禽养殖收入平均降低65%,会造成农民人均收入下降29%。
同亚型毒株对宿主的致病力差异显著,在所有HA亚型中,只有H5和H7亚型对禽是高致病性的,称为高致病性禽流感(High pathogenic avian influenza,HPAI),该类病毒可引起鸡群100%死亡,被国际兽疫局确定为A类传染病。可见,禽流感的危害已不仅是对养禽业的破坏,还对人类健康构成潜在的威胁。
发明内容
本发明的目的是提供一种禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法,以实现对禽流感病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。
本发明首先提供一种检测禽流感病毒通用型引物对和探针组,分别是鉴定禽流感病毒M基因的引物对M forward、M reverse和探针组M probe,其引物对和探针序列信息如下:
正向引物M forward:
5′-TGGARTGGMTAAAGACAAGACCAAT-3′(SEQ ID NO:1)
反向引物M reverse:
5′-GCRTTYTGGACAAASCGTCTACGC-3′(SEQ ID NO:2)
探针M probe:
5′-CTGCAGTCCTCGCTCACTGG-3′(SEQ ID NO:3)
其中探针的5′端进行羧基荧光素ROX标记,3′端进行淬灭基团BHQ2标记。
本发明再一个方面提供检测临床样品中禽流感病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,包括如下的步骤:
1)配制荧光定量RT-PCR反应体系
反应液每管25μL,含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ12.5μL,5U/μL TaKaRa ExTaq HS 0.5μL,PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μL,10pmol/μL M forward、M reverse和M probe各0.5μL,RNase Free dH2O 8.0μL,待检测的样品RNA模板2μL。
2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增
将检测反应条件设置为:第一阶段,42℃/5min;第二阶段,95℃/10s,第三阶段,95℃/5s,60℃/20s(收集荧光),40个循环。保存文件,运行。
3)结果判定
结果分析条件设定:读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,不同仪器可对阈值线的位置进行调整,然后读取检测结果。
质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线;阳性对照的Ct值应≤28.0,并出现特定的扩增曲线;如阴性对照和阳性条件不满足以上条件,此次实验视为无效。
结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线,样品判为阴性;Ct值≤36,且出现典型的扩增曲线,样品判为阳性。
本发明提供一种基于分子生物学的快速检测禽流感病毒的方法,以实现对禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测,从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测,能够同时检测大量样品并快速判定结果,而且使用TaqMan荧光探针,避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。
附图说明
图1:禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR优化的引物和探针设计示意图,其中引物由方框圈出,探针由斜体并加下划线表示;
图2:本发明引物和探针的灵敏度的检测结果图;
图3:本发明引物和探针的特异性检测结果图。
具体实施方式
实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点,目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1:禽流感病毒通用型检测引物及探针设计与筛选
根据禽流感病毒基质蛋白编码基因M基因进行引物设计,通过NCBI查找到1641条公开的禽流感病毒的M基因序列,根据基因比对分析保守区域,经同源性分析后,以位于124-275的碱基(参考序列GenBank登录号:KU042441)为目的片段进行荧光定量检测引物和探针设计(图1)。
设计2条上游引物和2条下游引物分别组合筛选最佳引物,为提高引物灵敏度,将上游引物所在区域对应的参考序列第132位碱基设计成简并碱基R,第136位碱基设计成简并碱基M;将下游引物所在区域对应的参考序列第234位碱基设计成简并碱基S,第243位碱基设计成简并碱基Y,第246位碱基设计成简并碱基。引物序列如下:
上游引物M-F1:5′-TGGARTGGMTAAAGACAAGACCAAT-3′(25bp)
上游引物M-F2:5′-TGGARTGGMTAAAGACAAGACCA-3′(23bp)
下游引物M-R1:5′-GCRTTYTGGACAAASCGTCTACGC-3′(24bp)
下游引物M-R2:5′-TTYTGGACAAASCGTCTACGC-3′(21bp)
设计2条探针进行最佳探针筛选。探针的5′端进行羧基荧光素ROX标记,3′端进行淬灭基团BHQ2标记。修饰后探针序列如下:
M-P1:5′-ROX-CTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC–BHQ2-3′(24bp)
M-P2:5′-ROX-CTGCAGTCCTCGCTCACTGG–BHQ2-3′(20bp)
2对引物和2条探针两两配对形成8个组合进行最佳引物和探针组合筛选。
组合1:M-F1、M-R1和M-P1
组合2:M-F1、M-R2和M-P1
组合3:M-F2、M-R1和M-P1
组合4:M-F2、M-R2和M-P1
组合5:M-F1、M-R1和M-P2
组合6:M-F1、M-R2和M-P2
组合7:M-F2、M-R1和M-P2
组合8:M-F2、M-R2和M-P2
引物对和探针的筛选包括如下步骤
1)配制荧光定量RT-PCR反应体系
反应液每管25μL,含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ12.5μL,5U/μL TaKaRa ExTaq HS 0.5μL,PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μL,10pmol/μL M forward、M reverse和M probe各0.5μL,RNase Free dH2O 8μL,待检测的样品RNA模板2μL。
2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增
将检测反应条件设置为:第一阶段,42℃/5min;第二阶段,95℃/10s,第三阶段,95℃/5s,60℃/20s(收集荧光),40个循环。保存文件,运行。
3)结果判定
结果分析条件设定:读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,不同仪器可对阈值线的位置进行调整,然后读取检测结果。
质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线;阳性对照的Ct值应≤28.0,并出现特定的扩增曲线;如阴性对照和阳性条件不满足以上条件,此次实验视为无效。
结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线,样品判为阴性;Ct值≤36,且出现典型的扩增曲线,样品判为阳性。
实验结果表明,相同反应条件,M组合5的扩增效率优于其他7个组合,因此将M组合5的引物对和探针作为优选,最终确定的引物和探针的序列信息如下:
正向引物M forward:
5′-TGGARTGGMTAAAGACAAGACCAAT-3′(SEQ ID NO:1)
反向引物M reverse:
5′-GCRTTYTGGACAAASCGTCTACGC-3′(SEQ ID NO:2)
探针M probe:
5′-CTGCAGTCCTCGCTCACTGG-3′(SEQ ID NO:3)
其中探针的5′端进行羧基荧光素ROX标记,3′端进行淬灭基团BHQ2标记。
实施例2:引物探针的检测灵敏度和特异性
检测灵敏度
设置6组不同浓度的禽流感病毒RNA模板,进行荧光定量RT-PCR最适条件下的核酸扩增。
参照RNA提取试剂盒说明书提取禽流感病毒RNA,测定所提取的RNA模板原始浓度,按照比例稀释至1ng/μL,再以10倍梯度稀释成10-1ng/μL,10-2ng/μL,10-3ng/μL,10-4ng/μL,10-5ng/μL,10-6ng/μL,分别取2μL作为反应模板,按照前述加样方法进行实时荧光定量RT-PCR核酸扩增。
结果显示本发明设计的引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性,检测灵敏度为RNA终浓度10-4ng/μL(图2)。
检测特异性
根据前述反应体系添加各组分,各亚型禽流感病毒(H1N2亚型禽流感病毒,H3N2亚型禽流感病毒,H4N2亚型禽流感病毒,H5N1亚型禽流感病毒,H5N2亚型禽流感病毒,H5N6亚型禽流感病毒,H6N2亚型禽流感病毒,H7N3亚型禽流感病毒,H9N2亚型禽流感病毒,H10N2亚型禽流感病毒,H11N2亚型禽流感病毒)RNA模板为2μL,非特异性病毒(新城疫病毒,传染性支气管炎病毒)RNA模板分别为2μL。检测反应条件设置为:第一阶段,42℃/5min;第二阶段,95℃/10s,第三阶段,95℃/5s,60℃/20s(收集荧光),40个循环。结果显示,除了禽流感病毒通用型RNA模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线,其他非特异性病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明,此方法可以实现对禽流感病毒的特异性检测,不与其他相关病毒发生交叉反应(图3)。
实施例3:对实际样品的检测应用
1.样品采集:
采集某活禽批发市场的各类家禽的咽拭子样品共30份,其中鸡、鸭、鹅各10份。采用PBS液(pH7.0~7.4,0.01mol/L)作为保存液(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/mL、制霉菌素1000IU/mL,BSA 5mg/mL)。样品采集后置于加冰的保温箱中密封,24h内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。
2.样品制备
将棉拭子置于装有1mL样品保存液的离心管中,涡旋混匀后,4℃10000r/min离心5min,取上清进行核酸提取。
3.核酸提取
参照RNA提取试剂盒说明书提取待检的30份临床样品、阳性对照和阴性对照RNA。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增,长时间保存,须置于-70℃条件下。
4.鉴定
4.1对比方法:参考国家标准《GB/T 19438.1-2004禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》中的荧光RT-PCR检测方法,作为对比方法。根据标准中所注购买了深圳匹基生物工程股份有限公司生产的禽流感病毒通用型荧光RT-PCR检测试剂盒。
4.2样品检测
采用国标方法和本专利方法,同时检测此临床样品。
4.3检测结果
结果显示,采用国标方法鉴定结果为1号、3号、10号、13号、16号和29号样品临床样品有FAM荧光信号,且Ct值均小于36,判定为AIV阳性,其余样品均没有荧光信号;采用本发明中的方法鉴定结果为1号、3号、10号、13号、16号和29号临床样品有ROX荧光信号,且Ct值均小于36,判定为AIV阳性,其余样品均没有荧光信号;阳性对照组两种方法均出现相应的荧光信号,结果准确可信。
综上所述,这30份临床样品中,1号、3号、10号、13号、16号和29号样品可以判定为AIV阳性,其余样品均为阴性。本发明中的方法可以快速、准确的鉴定禽流感病毒,对我国当前流行的多种亚型禽流感病毒都有较高的检测准确度,满足了当前对于禽流感病毒检测的需求。
序列表
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggartggmt aaagacaaga ccaat 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcrttytgga caaascgtct acgc 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgcagtcct cgctcactgg 20
Claims (5)
1.一种检测禽流感病毒通用型引物对和探针组,其特征在于,所述的引物对和探针,其中正向引物的序列为SEQ ID NO:1,反向引物的序列为SEQ ID NO:2,探针的序列为SEQ IDNO:3。
2.如权利要求1所述的引物对和探针组,其特征在于,所述的探针的5′端进行羧基荧光素ROX标记,3′端进行淬灭基团BHQ2标记。
3.权利要求1或2所述的引物对和探针组在制备检测禽流感病毒的制品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的制品,为荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
5.一种检测临床样品中禽流感病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,包括如下的步骤:
1)配制荧光定量RT-PCR反应体系
反应液每管25μL,含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μL,5U/μLTaKaRa Ex TaqHS 0.5μL,PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL,10pmol/μL M forward、M reverse和Mprobe各0.5μL,RNase Free dH2O 8.0μL,待检测的样品RNA模板2μL。
2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增
将检测反应条件设置为:第一阶段,42℃/5min;第二阶段,95℃/10s,第三阶段,95℃/5s,60℃/20s(收集荧光),40个循环。保存文件,运行。
3)结果判定
结果分析条件设定:读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,不同仪器可对阈值线的位置进行调整,然后读取检测结果。
质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线;阳性对照的Ct值应≤28.0,并出现特定的扩增曲线;如阴性对照和阳性条件不满足以上条件,此次实验视为无效;
结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线,样品判为阴性;Ct值≤36,且出现典型的扩增曲线,样品判为阳性。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190115 |
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