CN101240352A - 同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒的核酸检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于检验检疫技术领域，具体为一种同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒的核酸检测试剂盒。该试剂盒的检测试剂包括用于硅胶吸附柱法提取病毒RNA的提取试剂、用于RT－PCR Taq Man荧光探针法检测核酸的检测扩增试剂和供提取病毒RNA的固体组织标本的预处理液，此外，还采用体外转RNA作为试剂盒的阳性对照。该试剂盒可以同步快速鉴别诊断禽类疫病中传染性极高而症状相似的新城疫与禽流感，并可确定出H5、H7、H9等当前主要流行亚型，同时可区分出传染源是否为对人高致病性的禽流感或无致病性或低致病性禽流感等。本试剂盒适于畜牧兽医站或出入境检验检疫局等实验室的使用，并可用作大规模的流调及疫情监测等。

Description

同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒的核酸检测试剂盒

技术领域

本发明属于检验检疫技术领域，具体涉及一种同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒的核酸检测试剂盒。

背景技术

禽流感(欧洲鸡瘟、真鸡瘟)与新城疫(亚洲鸡瘟、伪鸡瘟)同属国际兽医局指定的甲类烈性禽类传染病，都具有传播快、发病急、死亡率高的特征，在国家动物防疫法上同被列为一类动物疫病。禽流感(记为AIV)与新城疫(记为DNV)的症状相似、病理进程难以区分，而社会危害相差悬殊：目前对这两种疫病采取的控制及扑杀的规定不同，禽流感特别是高致病性禽流感如H5N1、H7等可以突破种群传播的界限，能够导致易感人群发病，具有极高的致死率；而新城疫属于严格的禽类传染病，一般对人不致病。所以一旦误诊误判，后果将不堪想象。同时，并非所有的禽流感均可传播到人群，只有高致病性禽流感(目前所知主要为H5N1、H7N7、H7N2、H7N3、H9N2等亚型)具备这种能力，其余亚型的禽流感一般对人不致病或低致病(轻微感冒等)，例如常见的H9亚型禽流感。虽然禽流感与新城疫症状相似，二者的病原学相差很大，禽流感病毒属于正粘病毒科甲型流感病毒属(基因组为分节段的RNA，容易发生重排)，不同亚型的H基因及N基因存在规律性差异；而新城疫病毒是副粘病毒科(基因组为单股不分节的RNA)，因此，可以借助基因诊断等分子生物学手段进行快速准确的鉴别诊断。

新城疫和禽流感对养殖业可造成致命性打击，高致病性禽流感已造成多人感染与死亡，例如1997年H5N1导致香港18人感染6人死亡，2003年又导致2人感染1人死亡；2004年1-10月则导致越南、泰国33人死亡。1993年美国宾州暴发禽流感，花6000万美元用于捕杀1700万只鸡；1995年墨西哥暴发禽流感，1800万只鸡被淘汰，3200万只鸡被封锁，1.3亿只鸡紧急接种疫苗，直接经济损失10亿美元以上。而在防控禽流感的诸多环节中，最重要的是要快速准确诊断，及时圈定封锁疫区以免疫情扩散。传统禽流感、新城疫的诊断方法为鸡胚培养试验、琼脂扩散试验、病毒中和实验、酶联免疫吸附试验等，采用红细胞血凝抑制试验及神经氨酸酶抑制试验来确定亚型。传统检测手段耗时长，难度大，操作复杂。因此，研制一种灵敏度高、特异性强、准确性高的“同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒及其H5、H7、H9、N1亚型的快检试剂”具有重要的公共卫生意义和现实意义。

关于禽流感核酸检测的专利申请众多，但这些申请均为单项目检测，或多项目PCR-电泳法检测，或H5、H7、H9亚型的多重荧光PCR检测，费事费力，不能实现新城疫与禽流感通用型、H5、H7、H9、N1等的同步鉴别检测。涉及禽流感与新城疫同步检测的中国专利申请只有一件，申请号为200510042527.1(名称：复合定量聚合酶链反应检测禽流感和新城疫病毒的方法)，但其采用非探针技术而为荧光染料溶解曲线分析法，缺点是特异性差，不能将禽流感分型；究其原因是特异性差的荧光染料溶解曲线分析法不能用作多项目研究，否则过多扩增杂带干扰导致Tm无法分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能同步鉴别鉴别诊断禽流感病毒和新城疫病毒的核酸检测试剂盒。其中禽流感病毒还包括其亚型如亚洲主要流行的H5、H7、H9、N1，通过本试剂盒的检测，可确定病原体是禽流感病毒还是新城疫病毒，并能确认是高致病型禽流感(H5、N1、H7)还是其它低致病型禽流感(H9及除H5、H7、H9之外的其它亚型)。

本发明提供的核酸检测试剂盒的工作原理为：通过硅胶吸附柱法提取病毒RNA，高浓度胍盐制成的裂解液在操作开始就加入到待检标本中，使可能潜在的病毒颗粒裂解变性得以灭活，病毒核酸释放出来，在有机试剂如乙醇的存在下病毒核酸吸附于硅胶膜上，经过两次洗涤，除去杂质，低盐或纯水制备的洗脱液将病毒核酸洗脱下来，用作RT-PCR TaqMan荧光探针法检测的模板。

本发明提供的核酸检测试剂盒，其检测试剂包括用于硅胶吸附柱法提取病毒RNA的提取试剂和用于提取试剂RT-PCR TaqMan荧光探针法检测的核酸检测扩增试剂。此外，还可包括供提取病毒RNA用的固体组织标本的处理液。其中：

固体组织标本预处理液的配方如下：

0.8-2M GTC，0.1-0.8M硫氰酸胺，0.05-0.5M NaOAc PH 5.0，2-10％甘油，30-50％苯酚(或使用Trizol/Trizol LS试剂，Invitrogen.Cat No.10296010)，用来研磨肉类标本(液氮处理也可)。

提取试剂的组成和配方如下：

裂解液：4-5.5M GTC，10-50m M Tris-HCl Ph6.0-8.0，5-20％非离子表面活性剂即去垢剂(如Triton X-100、NP-40、Tween20等)、1-10μg/ml多聚腺苷酸或其它载体核酸；

去抑制剂：1-50mg/ml蛋白酶；

洗涤液A：0.5-4M GTC，10-50m M Tris-HCl Ph6.5-8.0，10-70％乙醇，为体积浓度；

洗涤液B：2-20mM NaCl，0-20mM Tris-HCl Ph6.5-8.0，30-80％乙醇，为体积浓度；

洗脱液：含0.01-0.05％重量NaN₃的DEPC处理过的纯化水；

核酸吸附柱：硅胶膜(如Millipore公司)性质的层析柱。

核酸扩增检测试剂的组成与配方如下：

RT-PCR反应液A：40-400MM Trizma-Cl或Tricine-Cl，Ph8.3-9.2；40-120MM KCl；20-80MM(NH₄)₂SO₄；10-20MM MgCl₂；0.01-0.05％Brij-35或Triton X-100或Tween 20；0.8-2MM d NTPs，5-40％(mg/ml)甘油等；

RT-PCR反应液B：AMV或SuperScriptIII逆转录酶，1-100U/反应，R Nasin 4-40U/反应，抗体封闭或寡核苷酸封闭的HotStart Taq Pol，1-5U/反应，适量RT促进剂与糖类稳定剂等；

NDV PCR反应液C：0.05-0.8μM NDV正向引物(NDVF)，0.05-0.8μM NDV反向引物(NDVR)，0.01-0.2μM NDV TaqMan探针(NDVP)；

AIV PCR反应液C：0.05-0.8μM AIV正向引物(AIVF)，0.05-0.8μM AIV反向引物(AIVR)，0.01-0.2μM AIV TaqMan探针(AIVP)；

H5 PCR反应液C：0.05-0.8μM H5正向引物(H5F)，0.05-0.8μM H5反向引物(H5R)，0.01-0.2μM H5 TaqMan探针(H5P)；

H7 PCR反应液C：0.05-0.8μM H7正向引物(H7F)，0.05-0.8μM H7反向引物(H7R)，0.01-0.2μM H7 TaqMan探针(H7P)；

H9 PCR反应液C：0.05-0.8μM H9正向引物(H9F)，0.05-0.8μM H9反向引物(H9R)，0.01-0.2μM H9 TaqMan探针(H9P)；

N1 PCR反应液C：0.05-0.8μM N1正向引物(N1F)，0.05-0.8μM N1反向引物(N1R)，0.01-0.2μM N1 TaqMan探针(N1P)。

上述的引物、探针等寡核苷酸序列的确定是通过分析基因库中已有新城疫及禽流感的核酸序列，并结合文献报道的保守区域，通过序列比对获知特异性后，设计出符合TaqManPCR技术要求的多对引物与探针，并经临床标本的实践筛选后确定H5、H7、H9、N1、通用型禽流感病毒及新城疫病毒特异扩增检测的引物与探针。选取H和N基因用作分型检测的靶基因，而选取保守性高的基质蛋白M基因作为检测禽流感通用型的靶基因。符合设计要求并能最佳实施本发明的引物及探针序列如下：

扩增NDV的引物序列：

NDVF：5′-agt gat gtg ctc ggR cct tc-3′，

NDVR：5′-cct gag gag aRg cat ttg cta-3′，

扩增AIV的引物序列：

AIVF：5′-atg agt ctt cta acc gag gtc g-3′，

AIVR：5′-tgc aaa aac atc ttc aag tct ctg-3′，

扩增H5的引物序列：

H5F：5′-aaa cag aga gga aat aag tgg agt aa-3′，

H5R：5′-gat aga cca gct acc atg att gc-3′，

扩增H7的引物序列：

H7F：5′-att gga cac gag acg caa tg-3′，

H7R：5′-ttt ctg agt ccg caa gat cta ttg-3′，

扩增H9的引物序列：

H9F：5′-tta ttc gac tgt cgc ctc atc tc-3′，

H9R：5′-ctg caa gat cca ttg gac atg g-3′，

扩增N1的引物序列：

N1F：5′-agg ttt gag tct gtt gct tgg tc-3′，

N1R：5′-caa ctc ttg ata gtg tct gtt att atg cc-3′，

检测NDV的Taqman探针：

NDVP：5’FAM-ttc tct agc agt ggg aca gcc tgc-BHQ1 3’，

检测AIV的Taqman探针：

AIVP：5’FAM-tca ggc ccc ctc aaa gcc g-BHQ1 3’，

检测H5的Taqman探针：

H5P：5’FAM-tca aca gtg gcg agt tcc cta gca-BHQ1 3’，

检测H7的Taqman探针：

H7P：5’FAM-aat gct gag ctg ttg gtg gca atg-BHQ1 3’，

检测H9的Taqman探针：

H9P：5’FAM-ccc aga aca gga agg cag caa acc c-BHQ1 3’，

检测N1的Taqman探针：

N1P：5’FAM-caa gtg ctt gcc atg atg gca c-BHQ1 3’。

本发明通过优化RT-PCR一步法反应中的关键因素，使RT反应与PCR反应偶联而连续进行不必分开分步操作，既简化实验流程又避免污染，并使两者高效特异进行，本发明者对RT-PCR一步法的缓冲体系、盐离子极其浓度、逆转录酶的选择及用量、耐热聚合酶的选择及用量、附加剂的使用等进行了深入而独特的研究。建立了以40-400MM Trizma-Cl，PH8.3-9.2；40-120MM KCl；20-80MM(NH₄)₂SO₄；10-20MM MgCl₂；0.01-0.05％Brij-35或Triton X-100或Tween 20、0.8-2MM d NTPs、5-40％甘油等的配方作为高效PCR/RT-PCR的基础缓冲液盐体系；选择AMV或SuperScriptIII逆转录酶，用量为1-100U AMV/反应、选择R Nasin 4-40U/反应，选择抗体封闭或寡核苷酸封闭的HotStart Taq Pol，用量为1-5U/反应，由此为基础增添RT促进剂与糖类稳定剂后制成可以稳定储存的RT-PCR混合酶。上述的引物与探针混合后滴配选择浓度，最终确定优化后的浓度均为0.05-0.8μM引物，50-200nM探针。

另外，本发明还采用体外转录RNA作为绿色环保试剂盒的阳性对照，既避免了用病毒株直接作为阳性模板可能带来的潜在风险，又可实施对标本处理与RT-PCR的双重监测。通过构建涵盖H5、H7、H9、通用型禽流感及新城疫病毒扩增靶基因的重组质粒，酶切线型化后，RNA聚合酶行体外转录，并经DNA酶消化去除DNA模板，纯化后制得RNA，紫外分光光度计测得OD260后计算得到RNA的浓度，采用RNA稳定的储存液稀释到适当浓度用作阳性对照。其优点是安全可靠，可以实施核酸提取、逆转录、荧光PCR扩增检测等全程的质控。

本发明提供的核酸检测试剂盒，可实现包括标本处理、核酸扩增、荧光探针杂交检测等流程在内的同步检测，并提供了优化的操作程序，快速方便，操作者经过简单的培训即可胜任该项工作。通过本试剂盒的检测，可确定病原体是禽流感病毒还是新城疫病毒，并能确认是高致病型禽流感(H5、N1、H7)还是其它低致病型禽流感(H9及除H5、H7、H9之外的其它亚型)。

具体实施方式

本发明的核酸检测试剂盒的具体操作步骤如下：

1、用硅胶吸附法提取RNA病毒取一份体积(V)的液体(如尿囊液)样本中加入等体积的裂解液，混匀后加入适量如1/5-1/4体积的去抑制剂，振荡混匀后置55-70℃ 5-20分钟，加入适量如1/3--1/2上述总体积的无水乙醇并颠倒混匀后转移液体至核酸吸附柱，离心或开启负压使液体流穿硅胶膜，在依次通过洗涤液A及B，最后洗脱液滴加于膜中央并流穿，将RNA洗脱下来用作PCR检测的模板。

2、RT-PCR TaqMan荧光探针法检测，取扩增检测试剂的反应液A∶B∶C，按照一定的比例如8∶6∶1的比例配制成反应液，加入等体积的核酸模板，上机按照50-60℃ 10-30Min(逆转录)、95℃2-5Min(预变性)、95℃0-10S 45℃10-30S 72℃10-30S预扩增5个循环(低严谨度扩增)、95℃0-10S 60℃30-60S 40-50个循环(高严谨度扩增)。根据荧光PCR仪的软件及试剂盒的质控来判断标本的阴阳性。

下面以实施例对本发明作进一步说明，可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明，凡依据本发明的内容所做的任何本领域的等同替换均属于本发明要求的保护范围之内。

实施例1：

来自出入境检验检疫局的108份禽流感、新城疫病毒相关标本的检测。

A)标本情况：禽流感标本12份(含两份参考株：H5N1与H9，其余禽流感阳标本AIV 1-10共10份)；新城疫标本82份(含两份参考株：F48E9与N79株，其余新城疫阳性标本NDV 1-80共80份)；各种禽类相关的其它病毒或疫苗14份，来自Intervet；Merialselect，Inc；Maine Biological Laboratories，Inc；ISBI；Vineland laboratories；American Scientific Laboratories，Inc。均为出入境检验检疫局所购或保存。

禽流感12份阳性标本中H5阳性标本7份；H9阳性标本5份。两株禽流感病毒的参考株为：禽流感病毒A/chicken/HK/1000/97(H5N1)、A/chicken/HK/230.2/01(H9)。其余H5、H9病毒(AIV 1-10)由检验检疫局收集、分离、保存。经过HI试验鉴定为禽流感H5、H9病毒。

新城疫标本NDV 1-80由检验检疫局收集、分离、保存，经过HI试验鉴定为新城疫病毒。流感毒阶标本两份。一份为A/chicken/HK/1000/97(H5N1)，毒价为10^-6.5ELD₅₀/0.1ml，共有11个稀释度(10倍梯度稀释)；另一份为A/chicken/HK/230.2/01(H9)，毒价为10^-7.2ELD₅₀/ml，共有9个稀释度。

B)详细的检测流程：

1.标本处理

活禽样品：取咽喉拭子和泄殖腔拭子，取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮几次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子时将拭子深入泻殖腔转一圈沾取少量粪便。然后将同一份样品的咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放入盛有1ml PBS的离心管中，充分浸泡，让拭子在离心管壁上挤压，使液体挤出，丢弃拭子，充分混匀，10000RPM离心2分钟，取上清备用。

肌肉、脏器样品：取待检样品0.5-2g，放在洁净灭菌研钵中，加适量禽肉组织预处理液或液氮充分研磨，加1ml PBS混匀，取上清备用。

其它体液(血清、血浆、尿液、组织渗出液等液体样品)等：直接取样。

2.核酸提取

2.1取N个0.5ml离心管(N＝标本数量+2个对照品)，作好标记后分别加入100μl裂解液。

2.2分别用带滤芯吸嘴加入100μl预处理过的样品和对照品，用带滤芯吸嘴反复吹打1-2次。

2.3分别用带滤芯吸嘴加入20μl去抑制剂，盖上管盖，振荡混匀，低速离心数秒，置70℃反应10分钟。

2.4离心数秒，用带滤芯吸嘴加入110μl无水乙醇，混匀，离心数秒。

2.5将作好标记的核酸吸附柱插入连接管后，固定在负压装置上，将步骤2.4中的所有液体小心移入核酸提取柱，注意不要将液体溅入其它样品的核酸提取柱内。

2.6开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。

2.7在每个核酸提取柱内加入500μl洗涤液A，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。

2.8在每个核酸提取柱内加入500μl洗涤液B，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。

2.9从连接套管上取下核酸提取柱，将其放入2ml离心管中，盖上管盖，14000rpm离心2分钟。

2.10将提取柱放入一新的2ml离心管中，小心将120μl洗脱液加在柱面中央，静置1分钟。

2.11盖上管盖，10000rpm离心2分钟，取2ml离心管中的收集液做PCR反应模板。

3.RT-PCR试剂准备及加样

3.1取[RT-PCR反应液A]、[RT-PCR反应液B]、[NDV PCR反应液C]、[AIV PCR反应液C]、H5 PCR反应液C]、[H7 PCR反应液C]、[H9 PCR反应液C]、[N1 PCR反应液C]室温融化后根据待扩增样品数按以下比例分别配制PCR反应液，并分装至PCR反应管中，每管15μl。

NDV：RT-PCR反应液A∶RT-PCR反应液B∶NDV PCR反应液C＝8∶6∶1

AIV：RT-PCR反应液A∶RT-PCR反应液B∶AIV PCR反应液C＝8∶6∶1

H5：RT-PCR反应液A∶RT-PCR反应液B∶H5 PCR反应液C＝8∶6∶1

H7：RT-PCR反应液A∶RT-PCR反应液B∶H7 PCR反应液C＝8∶6∶1

H9：RT-PCR反应液A∶RT-PCR反应液B∶H9 PCR反应液C＝8∶6∶1

N1：RT-PCR反应液A∶RT-PCR反应液B∶N1 PCR反应液C＝8∶6∶1

3.2在装有PCR反应液的反应管中用带滤芯吸嘴分别加入15μl提取好的RNA溶液(核酸提取步骤2.11中的收集液)。盖上管盖，转移到扩增检测区。

4.RT-PCR扩增检测(在扩增检测区进行)

4.1将反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。

4.2循环参数设定：(请参照各类仪器的操作软件进行设置)

4.3样品设置

在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型。

5.结果分析

根据各类仪器的软件进行分析，得到各样品的RNA检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。

6.结果判定

6.1质控标准：阴性对照品的测定结果为阴性(CT≥40)；阳性对照品的测定结果为阳性(CT＜40)；应同时满足上述2项条件，否则试验无效。

6.2待测标本结果判定：测定CT值≥40的样品为阴性样品；测定CT值≤32的样品为阳性样品；测定CT值在32～40之间的样品为灰区样品，建议复测。若复测无数值者为阴性，否则为阳性。

C)检测结果：

表1.AIV、H5、H9、NDV标本、禽类相关的其它病毒或疫苗标本中AIV、H5、H9、NDVRNA的检出结果

	例数	SPF鸡胚培养试验	AIV RNA检出数	AIV RNA检出率	NDV RNA检出数	NDV RNA检出率	H5 RNA检出率	H9 RNA检出率
									禽流感(AIV)	12	AIV阳性(H5:7；H9:5)	12	100％	0	0	7/7(100％)	5/5(100％)
新城疫(NDV)	82	NDV阳性	0	0	82	100％	0	0

禽类相关的其它病毒或疫苗	14	阴性	0	0	0	0	0	0
									总计	108	AIV 12NDV 82	12	11.11％	82	75.93％	6.48％	4.63％

*注：由于暂无H7标本故未作检测及评价。

分析：准确性方面，在108份各式各样的标本中均可检出相应的RNA阳性标本，阳性检出率100％；特异性方面，在禽类相关的其它病毒或疫苗14份标本和若干份交叉标本中检测相应的特异病毒RNA均为阴性，特异性符合率100％。

附：14份干扰性病毒或疫苗分别为：

(1)EDS鸡产蛋下降综合征(EDS)(Batch 09030)系Intervet产品；

(2)鸭肝炎病毒；

(3)鸭瘟病毒；

(4)新城疫I系活疫苗；

(5)猪冠状病毒；

(6)Bursal Disease Vaccine Merial select，Inc.Serial No：LZ014；

(7)Parvokan(parvovirosis and Derzsy’s disease)疫苗、Parvovirosis And Derzsy’Diseases Vaccine(lot L71846)系Merial Select，Inc产品；

(8)鸡传染性支气管炎疫苗Bronchitis Vaccine(Mass.&Ark.Types)(SerialNo：31003Z)系Maine Biological Laboratories，Inc产品；

(9)Infectious Laryngotracheitis Vaccine ISBI Batch N：987096；

(10)腱鞘炎疫苗(TSV)Tenosynovitis Vaccine(Serial No：0160003)系Intervet产品；

(11)Marek’s Disease Vaccine)(Serial No：G9048)Maine Biological Laboratories Inc产品；

(12)Fowl Pox Vaccine Vineland laboratories，Serial No.51234；

(13)脊髓炎疫苗Avian Encephalomyelitis-Fowl Pox Vaccine(Serial No：P1016)、系Merial Select，Inc产品；

(14)球虫Coccidiosis Vaccine(serial No：193/00)American Scientific LaboratoriesInc.

表2PCR-荧光检测试剂盒检测的敏感性与鸡胚病毒分离比较

AIV PCR-荧光检测试剂盒结果(CT值)病毒株：A/chicken/HK/1000/97(H5N1)	H5 PCR-荧光检测试剂盒结果(CT值)病毒株：A/chicken/HK/1000/97(H5N1)	H9 PCR-荧光检测试剂盒结果(CT值)病毒株：A/chicken/HK/230.2/01(H9)	NDV PCR-荧光检测试剂盒结果(CT值)病毒株：F48E9	鸡胚最小致死量(ELD50/0.1ml)
					阳性	阳性	阳性	11.57(阳性)	10-1
阳性	阳性	阳性	13.96(阳性)	10-2
					阳性	阳性	阳性	18.78(阳性)	10-3
阳性	阳性	阳性	21.63(阳性)	10-4
					阳性	阳性	阳性	25.47(阳性)	10-5
阳性	阳性	阳性	29.39(阳性)	10-6
					阳性	阳性	阳性	30.10(阳性)	10-7
阳性	阳性	阴性	30.96(阳性)	10-8
					阳性	阴性	阴性	＞40(阴性)	10-9
阴性	阴性	/	/	10-10
					阴性	阴性	/	/	10-11

分析：灵敏度方面，与目前该类病毒检测的“金标准”----“鸡胚病毒分离培养试验”比较，本发明试剂的灵敏度至少与之相当，达到10^-8左右。其中以通用型禽流感试剂的灵敏度为最高，达到10^-9，而H5、NDV的灵敏度均可达到10^-8，H9为10^-7。

评价：该试剂盒采用体外转录RNA作为阳性对照，是一个绿色环保的试剂盒。既避免了用病毒株直接作为阳性模板可能带来的潜在风险，又可实施对标本处理与RT-PCR的双重监测。

实施例2：来自上海市畜牧兽医站的500份禽类标本的检测。标本来自上海及周边地区的禽类标本，标本类型有咽拭子、禽肉。采用组织标本预处理液处理或直接于生理盐水中挤压棉拭子获取可能带有病毒的液体，取100μl同案例1操作。检测结果H5、H7、H9、NDV均为阴性，由于考核标本均来源于健康禽类(常规调研采集)，并且考核前后均无禽流感或新城疫的发生，提示经实践证明，本发明试剂的检测特异性良好。

Claims (4)

1、一种同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒的核酸检测试剂盒，其特征在于其检测试剂包括用硅吸附柱法提取病毒RNA的提取试剂和用作RT-PCR TaqMan荧光探针法检测的核酸扩增试剂，其中：

提取试剂的组成和配方如下：

裂解液：4-5.5M GTC，10-50m M Tris-HCl Ph6.0-8.0，5-20％去垢剂、1-10μg/ml多聚腺苷酸或其它载体核酸；

去抑制剂：1-50mg/ml蛋白酶；

洗涤液A：0.5-4M GTC，10-50m M Tris-HCl Ph6.5-8.0，10-70％乙醇，为体积浓度；

洗涤液B：2-20mM NaCl，0-20mM Tris-HCl Ph6.5-8.0，30-80％乙醇，为体积浓度；

洗脱液：含0.01-0.05％重量NaN₃的DEPC处理过的纯化水；

核酸吸附柱：硅胶膜性质的层析柱；

核酸扩增检测试剂的组成与配方如下：

RT-PCR反应液A：40-400MM Trizma-Cl或Tricine-Cl，Ph8.3-9.2；40-120MM KCl；20-80MM(NH₄)₂SO₄；10-20MM MgCl₂；0.01-0.05％Brij-35或Triton X-100或Tween 20；0.8-2MM d NTPs，5-40％(mg/ml)甘油；

RT-PCR反应液B：AMV或SuperScriptIII逆转录酶，1-100U/反应，R Nasin 4-40U/反应，抗体封闭或寡核苷酸封闭的HotStart Taq Pol，1-5U/反应，适量RT促进剂与糖类稳定剂；

NDV PCR反应液C：0.05-0.8μM NDV正向引物(NDVF)，0.05-0.8μM NDV反向引物(NDVR)，0.01-0.2μM NDV TaqMan探针(NDVP)；

AIV PCR反应液C：0.05-0.8μM AIV正向引物(AIVF)，0.05-0.8μM AIV反向引物(AIVR)，0.01-0.2μ M AIV TaqMan探针(AIVP)；

H5 PCR反应液C：0.05-0.8μM H5正向引物(H5F)，0.05-0.8μM H5反向引物(H5R)，0.01-0.2μM H5 TaqMan探针(H5P)；

H7 PCR反应液C：0.05-0.8μ M H7正向引物(H7F)，0.05-0.8μ M H7反向引物(H7R)，0.01-0.2μ M H7 TaqMan探针(H7P)；

H9 PCR反应液C：0.05-0.8μ M H9正向引物(H9F)，0.05-0.8μ M H9反向引物(H9R)，0.01-0.2μ M H9 TaqMan探针(H9P)；

N1 PCR反应液C：0.05-0.8μ M N1正向引物(N1F)，0.05-0.8μ M N1反向引物(N1R)，0.01-0.2μ M N1 TaqMan探针(N1P)；

这里，NDV为新城疫病毒，AIV为禽流感病毒，H5、H7、M9和N1为禽流感病毒亚型。

2、根据权利要求1所述的同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒的核酸检测试剂盒，其特征在于所述的扩增引物和探针序列如下：

扩增NDV的引物序列：

NDVF：5′-agt gat gtg ctc ggR cct tc-3′，

NDVR：5′-cct gag gag aRg cat ttg cta-3′，

扩增AIV的引物序列：

AIVF：5′- atg agt ctt cta acc gag gtc g-3′，

AIVR：5′-tgc aaa aac atc ttc aag tct ctg-3′，

扩增H5的引物序列：

H5F：5′-aaa cag aga gga aat aag tgg agt aa-3′，

H5R：5′-gat aga cca gct acc atg att gc-3′，

扩增H7的引物序列：

H7F：5′-att gga cac gag acg caa tg-3′，

H7R：5′-ttt ctg agt ccg caa gat cta ttg-3′，

扩增H9的引物序列：

H9F：5′-tta ttc gac tgt cgc ctc atc tc-3′，

H9R：5′-ctg caa gat cca ttg gac atg g-3′，

扩增N1的引物序列：

N1F：5′-agg ttt gag tct gtt gct tgg tc-3′，

N1R：5′-caa ctc ttg ata gtg tct gtt att atg cc-3′，

检测NDV的Taqman探针：

NDVP：5’FAM-ttc tct agc agt ggg aca gcc tgc-BHQ1 3’，

检测AIV的Taqman探针：

AIVP：5’FAM-tca ggc ccc ctc aaa gcc g-BHQ1 3’，

检测H5的Taqman探针：

H5P：5’FAM-tca aca gtg gcg agt tcc cta gca-BHQ1 3’，

检测H7的Taqman探针：

H7P：5’FAM-aat gct gag ctg ttg gtg gca atg-BHQ1 3’，

检测H9的Taqman探针：

H9P：5’FAM-ccc aga aca gga agg cag caa acc c-BHQ1 3’，

检测N1的Taqman探针：

N1P：5’FAM-caa gtg ctt gcc atg atg gca c-BHQ1 3’。

3、根据权利要求1所述的同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒的核酸检测试剂盒，其特征在于还包括固体组织标本预处理液，其配方为：0.8-2M GTC，0.1-0.8M硫氰酸胺，0.05-0.5M NaOAc PH 5.0，2-10％甘油，30-50％苯酚。

4、根据权利要求1所述的同步鉴别诊断新城疫病毒和禽流感病毒的核酸检测试剂盒，其特征在于还采用体外转录RNA作为阳性对照。