CN108085413A - 一种用于同时检测三种禽病毒病的高通量试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

一种用于同时检测三种禽病毒病的高通量试剂盒及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于检测三种禽病毒病的高通量试剂盒及其检测方法和应用，本发明提供的基因芯片方法检测NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒核酸检测试剂盒，其检测更加快速、敏感性更高、操作简便。本研究开发的是NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒核酸同时检测的试剂盒，能够在实际生产中快速诊断鸡群是否感染上诉的检测的病毒、监测鸡群的发病情况。为临床上NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感的大规模病毒监测、流行病学调查以及上诉疾病的防控提供了一种新的、有效的检测手段。

Description

一种用于同时检测三种禽病毒病的高通量试剂盒及其检测方 法和应用
技术领域：
本发明属于分子生物学检测方法领域，具体涉及用于同时检测NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒的试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术：
禽流感(avian influenza，AI)是由正黏病毒科流感病毒属的A型流感病毒(AIV)引起的一种禽类或人类感染的传染病。根据AIV的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原差异，AIV可分为16个HA亚型(H1～H16)和9个NA亚型(N1～N9)，在家禽中，主要流行的是H9N2、H5N1以及H7N3亚型流感病毒。新城疫(Newcastle disease，ND)是又称亚洲鸡瘟，是由禽副流感病毒型新城疫病毒(NDV)引起的一种主要侵害鸡、火鸡、野禽及观赏鸟类的高度接触传染性、致死性疾病，有强毒株和弱毒株两类，主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊乱、粘膜和浆膜出血。死亡率高，对养禽业危害严重。鸡的传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis Virus,IBV)引起的鸡急性、高度接触性的呼吸道和生殖道传染病，鸡传染性支气管炎病毒具有多种血清型和多组织嗜性。这些禽类疾病对养禽业的能造成严重的经济损失，养殖业健康发展在很大程度上取决于疾病的诊断和控制，所以能同时区分IBV、NDV和AIV及其H5、H7和H9亚型流感病毒是很重要的。
基因芯片技术的方法敏感性高、时间短。禽流感病毒具有16种HA亚型和9种NA亚型，AIV、NDV、IBV对养禽业的危害巨大，在临床上快速鉴定和诊断是非常必要的。
本研究将进行的是同时鉴定出IBV、NDV和AIV及其H5、H7和H9病毒的亚型类别，基于iPDMS(initiator integrated poly(dimethysiloxane),iPDMS)为基因芯片膜，进行以上病毒的核酸检测的诊断方法还未见报道。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于检测NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒的试剂盒及其检测方法和应用。该试剂盒采用基因芯片方法可同时检测NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒，为临床上诉禽病的诊断和抗体水平的检测提供经济实用可靠的检测工具。检测敏感性高、特异性和重复性好；试剂盒检测样本的价格便宜；检测时间短且结果易观察。
为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：
一种用于同时检测NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒的试剂盒，该试剂盒包括：
(1)用探针制备的基因芯片；
(2)洗液1：20×SSC；
(3)洗液2：10％SDS；
(4)洗液3：1M柠檬酸钠；
(5)正向引物和反向引物；
(6)POD(Streptavidin-Horseradish Peroxidase)；
(7)一步法多重RT-PCR试剂，其中包含：2×One Step Q Probe Mix、One Step QProbe Enzyme Mix和RNase-free water；
(8)阳性对照样品；
(9)底物显色液。
上述的一步法多重RT-PCR试剂取自市售的一步法多重RT-PCR试剂盒，上述的试剂盒中所述的探针和引物见表2，其中，所述的正向引物为上游引物H9-F、H7-F、H5-F、M-F、IBV-F和NDV-F的混合，所述的反向引物为下游引物H9-R、H7-R、H5-R、M-R、IBV-R和NDV-R的混合。
上述基因芯片的制备过程为：用点样缓冲液将探针稀释至工作浓度，点样到iPDMS白膜制备基因芯片；所述点样缓冲液的配方为：0.3M PB,0.2％(v/v)Glycerin,0.01％(v/v)Triton and 1.5％Mannitol(g/100ml，每100ml点样缓冲液中含1.5gMannitol)。
上述试剂盒中阳性标准品的制备过程为：
A、分别提取IBV、NDV病毒样本的总RNA；
B、将所述步骤A中得到的IBV、NDV分别进行反转录，得到IBV、NDV病毒的cDNA；
C、以所述步骤B得到的cDNA为模版，采用下表1所示的核苷酸序列分别作为上游引物和下游引物扩增IBV、NDV病毒特异性目标片段，得到IBV-N,NDV-F特异性目的片段；
D、将所述步骤C得到的IBV、NDV特异性目的片段连接到pMD18T载体上转入大肠杆菌中，H5、H7、H9和M的片段连接于pMD18T载体上的质粒实验室已存在，制备过程同上，引物序列如下表1所示，将上诉质粒等体积混合得到各阳性质粒的终浓度为0.1mg/ml的阳性标准品。
上述的试剂盒在同时检测NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒中的应用。
一种非诊疗目的的同时检测NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒的方法(即上述试剂盒的检测方法)，包括以下步骤：
(1)基因芯片的制备：用点样缓冲液将探针稀释至工作浓度，点样到iPDMS白膜制备基因芯片；所述点样缓冲液的配方为：0.3M PB,0.2％Glycerin,0.01％Triton and1.5％Mannitol；
(2)一步法多重RT-PCR：其体系为20μL：PCR Forward Primer1μL、PCR ReversePrimer 1μL、2×One Step Q Probe Mix 10μL,One Step Q Probe Enzyme Mix 1μL、RNase-free water 6μL and待测样品RNA 1μl，total 20μL；反应程序：50℃5min；95℃2min；1Cycle；95℃10s；54℃10s；40Cycles；
(3)PCR产物的制备：将一步法多重RT-PCR的产物用A液(2×SSC，0.01％SDS)稀释5倍，沸水浴5-10min后冰水混合浴2-5min；
(4)PCR产物的孵育：将步骤(3)制备的PCR产物加到基因芯片中震荡孵育，B液(0.5×SSC，0.02％SDS，预热到47℃)润洗后，弃掉洗涤液得到孵育后的PCR产物；
(5)POD的孵育：在基因芯片加入47℃预热的用A液500倍稀释后的POD震荡孵育，B液(预热到47℃)润洗后，弃掉洗涤液；
(6)显色：0.05M柠檬酸钠淋洗后；TMB显色5-10min，弃显色液，洗涤液冲洗干净，肉眼观察检测结果；
(7)结果判定：用肉眼观察显色情况，除了阳性质控点为蓝色外，其它点如果显色，则判断为阳性，如果没有显色则判断为阴性，如果显色但颜色很淡，则判断为弱阳。
步骤(1)中所述的探针及步骤(2)一步法多重RT-PCR中所采用的引物见表2
步骤(1)中所述探针的工作浓度为6μM。
步骤(1)中所述的基因芯片制备后需要真空干燥包装，4℃保存；步骤(4)中所述的基因芯片使用前4℃拿出后需要在常温放置15-20min使其恢复室温。
步骤(4)中将步骤(3)制备的PCR产物60μL加到基因芯片中震荡孵育，所述震荡孵育的条件为：47℃，200rpm，震荡孵育20min；步骤(5)中用A液500倍稀释后的POD的添加量为100μL，所述震荡孵育的条件为：47℃，200rpm，震荡孵育20min。
步骤(4)和步骤(5)中所述B液润洗的次数分别为3次；步骤(6)中柠檬酸钠淋洗2次，TMB的添加量为100μL/孔。
本发明提供的可同时检测NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒的试剂盒优选包括以下组分：
(1)用探针制备的48孔基因反应板，五块白膜；
(2)洗液1(20×SSC)，体积100mL；
(3)洗液2(10％SDS，10g的SDS溶于水中定溶到100ml)体积30mL；
(4)洗液3(1M柠檬酸钠)体积100mL；
(5)正向引物(4nmol/μl)5μl，反向引物(4nmol/μl)5μl；
(6)POD(Streptavidin-Horseradish Peroxidase)：50μl；
(7)一步法多重RT-PCR试剂，该试剂为市售产品其中包括2×One Step Q ProbeMix3mL、One Step Q Probe Enzyme Mix300μl和RNase-free water3mL；
(8)阳性对照样品：阳性标准品200μl；
(9)底物显色液，体积30mL；
上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)基因芯片的制备：基因芯片的探针于公司合成后，-40℃保存备用；基因芯片在十万级洁净的房间进行微阵点样，点样浓度用点样缓冲液稀释为6μM，制备48孔点样板。真空干燥包装，4℃保存备用。所述基因芯片上各探针的加样表见表3，但不限于此，其中的阳性对照孔点样biotin标准品，阴性对照孔点样buffer缓冲液。
(2)一步法多重RT-PCR：一步法多重RT-PCR的体系为20μL：PCR Forward Primer(正向引物)1μL、PCR Reverse Primer(反向引物)1μL、2×One Step Q Probe Mix(2×缓冲液，其中包含优化的缓冲体系和dNTP)10μL，One Step Q Probe Enzyme Mix(一步法PCR酶)1μL、RNase-free water(无核糖核酸酶水)6μL and RNA 1μl,total 20μL。一步法多重PCR反应程序：50℃5min；95℃2min；95℃10s，54℃10s，40Cycles。一步法多重RT-PCR的体系中的2×One Step Q Probe Mix、One Step Q Probe Enzyme Mix和RNase-free water为市售一步法多重RT-PCR试剂盒中的试剂。
(3)PCR产物的制备：一步法多重PCR的产物用A液(2×SSC，0.01％SDS)稀释5倍，沸水浴5-10min后冰水混合浴2-5min。
(4)基因芯片的回温：在四度拿出后在常温放置15-20min待其恢复至室温；
(5)PCR产物的孵育：PCR产物60μL加到基因芯片的孔中，47℃，200rpm，震荡孵育20min，B液(0.5×SSC，0.02％SDS，预热到47℃)润洗3次后，弃掉洗涤液；
(6)POD(Streptavidin-Horseradish Peroxidase)的孵育：先用A液500倍稀释POD，47℃预热后100μL加入芯片孔中，47℃，200rpm，震荡孵育20min，B液(预热到47℃)润洗3次后，弃掉洗涤液；吸取试剂盒中的洗液1和洗液2制备A液和B液的方法为本领域技术人员所公知的。
(7)显色：0.05M柠檬酸钠淋洗2次；TMB100μL/孔，显色5-10min，弃显色液，洗涤液冲洗干净，肉眼观察检测结果。
(8)结果判定：
用肉眼观察显色情况，除了阳性质控点为蓝色外，其它点如果显色，则判断为阳性，如果没有显色则判断为阴性，如果显色但颜色很淡，则判断为弱阳。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供的基因芯片方法检测NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒核酸检测试剂盒，成本降低，检测更加快速、敏感性更高、操作简便。
本研究NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒核酸同时检测的试剂盒，能够在实际生产中快速诊断鸡群是否感染上诉的检测的病毒、监测鸡群的发病情况。为临床上NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感的大规模病毒监测、流行病学调查以及上诉疾病的防控提供了一种有效的检测手段。
附图说明：
图1为基因芯片的不同的混合或单一的病毒检测结果
Fig.1.Detection and typing of NDV,IBV or AIV using oligonucleotidemicroarrays.(A)Microarray map.Each dot indicates the spotted position of eachprobe.P:Positive control；N:Negative control；1:AIV-H5；2:AIV-H7；3:AIV-H9；4:AIV-M；5:IBV-N；6:NDV-F.(B)The detection and typing results shown on themicroarrays.B1:H5AIV；B2:H7AIV；B3:H9AIV；B4:IBV；B5:NDV；B6:H5AIV+NDV；B7:H7AIV+NDV；B8:H7AIV+IBV+NDV；B9:H9AIV+IBV；B10:H9AIV+NDV；B11：H5AIV+H7AIV；B12:H5AIV+H9AIV+NDV；B13:H5AIV+H7AIV+H9AIV；B14:H5AIV+H7AIV+H9AIV+IBV+NDV；B15:Negativecontrol.
图2为基因芯片的特异性实验结果
Fig.2.The specificity of oligonucleotide microarrays.Rapid detectionthe other avian respiratory viruses and H1～H13AIVs using oligonucleotidemicroarrays.1:Positive control；2:H1AIV；3:H2AIV；4:H3AIV；5:H4AIV；6:H6AIV；7:H8AIV；8:H10AIV；9:H11AIV；10:H12AIV；11:H13AIV；12:IBDV；13：Negative control.
具体实施方式：
下面结合实施例和附图作进一步说明。应该理解这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[实施例1]引物与探针的设计与筛选
据GenBank中AIV的M基因，H5、H7和H9亚型禽流感病毒血凝素基因序列，IBV的核衣壳蛋白基因(N基因)以及NDV的融合蛋白基因(F基因)，用DNAMAN软件进行同源性分析，采用Primer Express5.0软件，在其保守区域设计特异性引物和基因探针，每种探针设计2种或2种以上的引物和探针进行筛选，选出的特异好无交叉反应及扩增效率好的引物和探针，引物上游的5’都有Biotin进行修饰。各亚型引物及探针见下表2。
[实施例2]阳性标准品的制备
A、分别提取IBV、NDV病毒样本的总RNA；
B、将所述步骤A中得到的IBV、NDV分别进行反转录，得到IBV、NDV病毒的cDNA；
C、以所述步骤B得到的cDNA为模版，采用下表1所示的核苷酸序列分别作为上游引物和下游引物扩增IBV、NDV病毒特异性目标片段，得到IBV-N,NDV-F特异性目的片段；
D、将所述步骤C得到的IBV、NDV特异性目的片段连接到pMD18T载体上转入大肠杆菌中，H5、H7、H9和M的片段连接于pMD18T载体上的质粒实验室已存在，制备过程同上，引物序列如下表1所示，将上诉质粒等体积混合得到各阳性质粒的终浓度为0.1mg/ml的阳性标准品。
[实施例3]可同时检测NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒的试剂盒
包含以下组分：
(1)用探针制备的48孔基因反应板，五块白膜；
(2)洗液1(20×SSC)，体积100mL；
(3)洗液2(10％SDS，10g的SDS溶于水中定溶到100ml)体积30mL；
(4)洗液3(1M柠檬酸钠)体积100mL；
(5)正向引物(4nmol/μl)5μl，反向引物(4nmol/μl)5μL；
(6)POD(Streptavidin-Horseradish Peroxidase)：50μL；
(7)一步法多重RT-PCR试剂，该试剂中包括2×One Step Q Probe Mix3mL、OneStep Q Probe Enzyme Mix300μl和RNase-free water3mL；上述的试剂为市售一步法多重RT-PCR试剂盒(HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit产品编号：Q222-01)中的试剂。
(8)阳性对照样品：实施例2制备的阳性标准品200μL；
(9)底物显色液，体积30mL；
上述的试剂盒中所述的探针和引物见表2，其中，所述的正向引物为上游引物H9-F、H7-F、H5-F、M-F、IBV-F和NDV-F的混合，所述的反向引物为下游引物H9-R、H7-R、H5-R、M-R、IBV-R和NDV-R的混合。
上述基因芯片的制备过程为：基因芯片的探针于公司合成后，-40℃保存备用；在十万级洁净的房间进行核酸微阵点样。用点样缓冲液将探针稀释至工作浓度6μM，点样到iPDMS白膜，制备48孔基因芯片，真空干燥包装，4℃保存备用。所述点样缓冲液的配方为：0.3M PB,0.2％(v/v)Glycerin,0.01％(v/v)Triton and 1.5％Mannitol(g/100ml，每100mL点样缓冲液中含1.5gMannitol)。所述基因芯片上各探针的加样表见表3，但不限于此，其中的阳性对照孔点样biotin标准品，阴性对照孔点样buffer缓冲液。
[实施例4]一步法多重RT-PCR条件的优化
提取所用的阳性模板的RNA(EID50为106的H5、H7、H9、IBV和NDV的病毒)，按照Trizol的说明书操作。具体方法如下，取适量鸡胚尿囊液，12000rpm离心5min，取500μL尿囊液上清，向其中加入700μL Trizol，振荡混匀，静置10min，4℃12000rpm离心15min，取上清加入500μL异丙醇中，混匀，4℃静置15min，15000rpm离心10min，弃上清，温和用1mL 75％乙醇洗涤沉淀，勿将沉淀重悬，7500rpm离心5min，控干尽量弃净液体，加入20μL无核酸酶水，涡旋混匀，放置于-80℃保存。同上诉的RNA模板进行一步法多重RT-PCR，用控制变量法来优化一步法多重RT-PCR的条件，改变其引物的浓度，退火温度设置不同的梯度，改变模板的加入量，改变其循环数。最后确定的一步法多重RT-PCR的体系为20μL：PCR Forward Primer1μL；PCR Reverse Primer 1μL；2×One Step Q Probe Mix10μL；One Step Q Probe EnzymeMix 1μL；RNase-free water 6μL and RNA模板1μL,total20μL。一步法多重PCR反应程序：50℃5min；95℃2min；95℃10s，54℃10s，40Cycles。图1为基因芯片的不同的混合或单一的病毒检测结果。
[实施例5]基因芯片检测条件的优化
基因芯片反应的基本程序
(1)基因芯片的制备：在十万级洁净的房间进行微阵点样。探针然后用点样缓冲液(0.3M PB,0.2％Glycerin,0.01％Triton and 1.5％Mannitol)稀释至工作浓度6μM，点样到iPDMS白膜。制备48孔基因芯片。真空干燥包装，4℃保存备用；芯片的加样表见表3。
(2)一步法多重RT-PCR：一步法多重RT-PCR的体系为20μL：PCR Forward Primer1μL、PCR Reverse Primer 1μL、2×One Step Q Probe Mix 10μL,One Step Q Probe EnzymeMix 1μL、RNase-free water 6μL and RNA 1μl,total 20μL。一步法多重PCR反应程序：50℃5min；95℃2min；1Cycle；95℃10s；54℃10s；40Cycles；
(3)PCR产物的制备：一步法多重PCR的产物用A液(2×SSC，0.01％SDS)稀释5倍，沸水浴5min后冰水混合浴2min。
(4)基因芯片板从4℃取出放置室温(25±5℃)15-20min；
(5)PCR产物的孵育：将制备好的PCR产物60μL加到基因芯片的孔中，47℃，200rpm，震荡孵育20min，B液(0.5×SSC，0.02％SDS，预热到47℃润洗3次后，弃掉洗涤液；
(6)POD(Streptavidin-Horseradish Peroxidase)的孵育：先用A液500倍稀释POD，47℃预热后100μL加入芯片孔中,47℃，200rpm，震荡孵育20min，B液(预热到47℃)润洗3次后，弃掉洗涤液；
(7)显色：C液(0.05M柠檬酸钠)淋洗2次；TMB100μL/孔，显色5-10min，弃显色液，洗涤液冲洗干净，肉眼观察检测结果。
(8)结果判定：用肉眼观察显色情况，除了阳性质控点为蓝色外，其它点如果显色，则判断为阳性，如果没有显色则判断为阴性，如果显色但颜色很淡，则判断为弱阳。
将阳性标准品的RNA模板采用上述步骤进行处理并点样阳性对照孔，将待测样品的RNA模板采用上述步骤进行处理并点样加样孔。反应完全后，用肉眼观察显色情况并进行结果判断。
基因芯片反应条件的优化
以上述的基本程序为基础，对基因芯片的反应条件进行优化。
(1)POD稀释度的选择
将POD分别作1:250、1:500、1:1000、1:2000、1:4000稀释，进行POD稀释倍数的优化，选择最佳稀释倍数。能检测出阳性样本且易于观察，所以POD稀释度的选择1:500。
(2)PCR产物的孵育及POD的孵育时间的选择
设置不同的PCR产物的孵育及POD的孵育时间，选择能检测出阳性样本且易于观察时间较短的孵育条件，最后选择的震荡孵育时间为20min。
[实施例6]重复性试验
批内重复性实验：2个不同的EID50(106、105)的IBV、NDV和AIV的H5、H7、H9亚型的病毒病毒，选择3个不同时间段的PCR产物，在同一基因芯片中进行4次重复检测，观察结果是否一致。批间重复性实验：所用样品同批内重复试验，对不同批次合成的探针制备的基因芯片进行4次重复检测，观察结果是否一致。由观察结果可以得出结论：构建的基因芯片检测方法具有良好的稳定性。
[实施例7]基因芯片方法的敏感性
将已知EID50的IBV、NDV和AIV的H5、H7、H9亚型的病毒按照10倍梯度稀释，得到含有105-10-2EID50的上诉病毒稀释液分别进行检测分析，以期获得其检测下限。同时，以上述不同EID50的病毒提取RNA并且反转录为cDNA做常规PCR方法的检测，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。所建立的基因芯片方法检测H5、H7、H9流感病毒和流感病毒M基因的检测限度均为0.1EID50，NDV病毒和IBV病毒的检测下线分别为0.1EID50和1EID50。基因芯片方法的敏感性是常规PCR的100-10000倍，结果如表4所示。
[实施例8]基因芯片方法的特异性
检测体系的特异性分析，均利用病毒感染鸡胚或细胞上清分析，先进行RNA提取，然后做一步法多重PCR检测。针对IBV、NDV和AIV的H5、H7、H9亚型的病毒，分别检测每种病毒来自不同地方的3株病毒，考核该检测体系中NDV、IBV和AIV的H5、H7、H9引物和探针的保守性；分别选取流感病毒的其它亚型进行检测，考核该检测体系中的流感M引物探针的保守性和其他引物探针的特异性。分别选取禽类的其他RNA病毒(IBDV)进行检测分析，以考核该体系的特异性；经检测，其基因芯片对应的探针均能正确的显色，引物和探针都具有很好的的保守性和特异性。图2为基因芯片的特异性实验结果。
[实施例9]基因芯片试剂盒有效性验证
临床样品检测和病毒分离:初步应用建立的方法检测临床样品93份：对2016年7月到2017年8月采自江苏南京周边地区的样品，利用基因芯片方法检测分析携带该病毒的状况。
将93份病料研磨液分别接种SPF胚进行病毒分离；基因芯片方法以肉眼观察显色为阳性的判定原则：基因芯片检测结果显在93份病料中，鉴定到M阳性病毒31株，H9亚型病毒3株，H5亚型病毒18株、H7亚型病毒7株，H7亚型病毒和H9亚型病毒混合感染2株，IBV病毒0株，NDV病毒22株。结果如下表5所示。
从上述结果可以看出，病毒的基因芯片检测方法与病毒分离方法比较具有用时短、敏感性高的特点，病毒分离的阳性结果在基因芯片检测均为阳性。通过本实验初步证实了该方法在病毒的检测方面具有可行性。
由以上实施例可知，本发明设计得到的IBV、NDV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒特异性引物和探针具有较强的特异性，对检测除IBV、NDV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒以外的病毒都为阴性；批间批内实验表明构建的基因芯片检测方法具有良好的稳定性。
表1制备阳性标准品所需要的IBV、NDV病毒的上游引物和下游引物
表2.基因芯片的引物和探针
表3芯片的加样表
阳性对照 阴性对照
H5探针 H7探针 H9探针
M探针 IBV探针 NDV探针
表4基因芯片敏感性
表5基因芯片检测临床样本
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种用于同时检测三种禽病毒病的高通量试剂盒及其检测方法和应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatygcygc racyaatga 19
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcatctgat ysagrgtrtt rttcc 25
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggtagygg ygttcctg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccccarttaa thacyttggg 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgacatttc atggagcaaa gga 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggagaaaa taatgtttct tc 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttaaatgcaa attctgcatt g 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgaacactc aaattctggt att 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttatatacaa atagtgcacc gca 23
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggagacag tatcactaat aacta 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttatatacaa atgttgcatc tgcaa 25
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttcgactgtc gcctcatctc ttg 23
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagaacaaga aggcagcaa 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aatgtgatga ccartgcatg g 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggtttagctt cggggcatca tg 22
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccattrcaat ggctagaag 19
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatagaatac agatwgaccc agt 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcctcaaact gagtgttcat tttgt 25
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtaccaccat agcaatgagc ag 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agtccagaca tctaggaatc cgt 23
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcggctttga gggggcctga 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgagycttc traccgaggt cg 22
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaggtgacag gattggtctt gtc 23
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcccatcct taataccttc ctca 24
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gtarggaggg naattttggt gatga 25
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acacactsrt cacaaatytt yacataatta 30
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gaggtgtcaa gytcttctat cacagaacc 29
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtcccraarg trgtgacaca 20
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gggaaytgtc actatyctdg taca 24

Claims (10)

1.一种用于同时检测NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：
(1)用探针制备的基因芯片；
(2)洗液1：20×SSC；
(3)洗液2：10％SDS；
(4)洗液3：1M柠檬酸钠；
(5)正向引物和反向引物；
(6)POD；
(7)一步法多重RT-PCR试剂
(8)阳性对照样品；
(9)底物显色液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的探针包括：
所述的正向引物和反向引物包括：
。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述基因芯片的制备过程为：用点样缓冲液将探针稀释至工作浓度，点样到iPDMS白膜制备基因芯片；所述点样缓冲液的配方为：0.3M PB,0.2％Glycerin,0.01％Triton and 1.5％Mannitol。
4.权利要求1或2所述的试剂盒在同时检测NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒中的应用。
5.一种同时检测NDV、IBV和AIV及其H5、H7、H9亚型流感病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)基因芯片的制备：用点样缓冲液将探针稀释至工作浓度，点样到iPDMS白膜制备基因芯片；所述点样缓冲液的配方为：0.3M PB,0.2％Glycerin,0.01％Triton and 1.5％Mannitol；
(2)一步法多重RT-PCR：其体系为20μL：PCR Forward Primer 1μL、PCR ReversePrimer 1μL、2×One Step Q Probe Mix 10μL,One Step Q Probe Enzyme Mix 1μL、RNase-free water 6μL and待测样品RNA 1μl，total 20μL；反应程序：50℃5min；95℃2min；1Cycle；95℃10s；54℃10s；40Cycles；
(3)PCR产物的制备：将一步法多重RT-PCR的产物用A液(2×SSC，0.01％SDS)稀释5倍，沸水浴5-10min后冰水混合浴2-5min；
(4)PCR产物的孵育：将步骤(3)制备的PCR产物加到基因芯片中震荡孵育，B液(0.5×SSC，0.02％SDS，预热到47℃)润洗后，弃掉洗涤液得到孵育后的PCR产物；
(5)POD的孵育：在基因芯片加入47℃预热的用A液500倍稀释后的POD震荡孵育，B液(预热到47℃)润洗后，弃掉洗涤液；
(6)显色：0.05M柠檬酸钠淋洗后；TMB显色5-10min，弃显色液，洗涤液冲洗干净，肉眼观察检测结果；
(7)结果判定：用肉眼观察显色情况，除了阳性质控点为蓝色外，其它点如果显色，则判断为阳性，如果没有显色则判断为阴性，如果显色但颜色很淡，则判断为弱阳。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的探针及步骤(2)一步法多重RT-PCR中所采用的引物为：
。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的工作浓度为6μM。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的基因芯片制备后需要真空干燥包装，4℃保存；步骤(4)中所述的基因芯片使用前4℃拿出后需要在常温放置15-20min使其恢复室温。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(4)中将步骤(3)制备的PCR产物60μL加到基因芯片中震荡孵育，所述震荡孵育的条件为：47℃，200rpm，震荡孵育20min；步骤(5)中用A液500倍稀释后的POD的添加量为100μL，所述震荡孵育的条件为：47℃，200rpm，震荡孵育20min。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(4)和步骤(5)中所述B液润洗的次数分别为3次；步骤(6)中柠檬酸钠淋洗2次，TMB的添加量为100μL/孔。
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