KR20090031362A - 인플루엔자 바이러스의 검출 방법 - Google Patents

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이리나 알렉산드로브나 루바비나
로베르트-마티아스 라이져
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페터리내르메디찌니쉐 우니버지태트 빈
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Abstract

헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제를 포함하는 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 신속한 검출 방법으로서, 상기 방법은 a) 상기 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 글리코포린, a1-산 당단백질, a2-마크로글로불린, 오보뮤코이드 및 그들의 조합과 같은 당 단백질에 접합되거나, 또는 당 단백질과 조합된 조성물 내에 위치하는 천연 올리고사카라이드 또는 합성 올리고사카라이드로 구성된 군으로부터 선택된 한 종류 이상의 탄수화물 수용체를 포함하고, 상기 탄수화물 수용체는 상기 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 헤마글루티닌 성분에 결합하는 것인 지지체에 결합시키는 단계; b) 상기 결합된 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 뉴라미니다아제 성분을 그의 표지된 효소 기질과 반응시켜, 검출가능한 신호의 생성을 유발하는 단계; 및 c) 상기 단계 b)에서 생성된 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
인플루엔자 바이러스, 헤마글루티닌, 뉴라미니다아제

Description

인플루엔자 바이러스의 검출 방법{Detection method for influenza viruses}
본 발명은 헤마글루티닌(hemagglutinin) 및 뉴라미니다아제(neuraminidase) 성분을 포함하는 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 신속하게 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 헤마글루티닌 성분을 결합하는, 특정한 결합 분자에 의해 지지체에 상기 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 결합시키는 단계 및 상기 뉴라미니다아제 성분을 그의 효소 기질과 반응시켜 검출가능한 신호를 생성하는 것에 상기 결합된 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 검출하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법을 이용한, 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 신속한 검출을 위한 검출 시스템 및 본 발명에 따른 상기 검출 시스템의 용도에 관한 것이다.
모든 조류 인플루엔자(avian influenza: AI) 바이러스는 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae)의 바이러스 과에 속하는 타입 A 인플루엔자 바이러스이고 모든 공지된 종의 인플루엔자 A 바이러스는 조류를 감염시킨다. 인플루엔자 바이러스 타입 A는 중심 바이러스 코어(central virus core)로부터의 헤마글루티닌(H)과 뉴라미니다아제(N) 단백질 스파이크에 기반하여 아형(subtype)으로 세분된다. 16개의 H 형 및 9개의 N 아형이 있어서, H와 N의 144개의 상이한 조합에 대한 가능성을 가 져온다.
조류 인플루엔자(새 독감(bird flu), 조류 독감(avian flu), 인플루엔자 바이러스 A 독감, 타입 A 독감 또는 A 속 독감(genus A flu)로도 알려짐)는 새를 숙주로 하는 일종의 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 독감이나, 여러 종의 포유동물을 감염시킬 수 있다.
1918년의 스페인 독감(Spanish flu)과 같이, 인플루엔자 범유행(influenza pandemic)은 인플루엔자 바이러스의 대규모 전염이다. 세계보건기구(WHO)는 향후 수년 내에 인플루엔자 범유행의 실질적 위험이 있다고 경고한다. 가장 강력한 후보 중 하나는 조류 인플루엔자의 A(H5N1) 아형이다.
H5N1은 항원성 소변이(antigenic drift)를 통해 수십종의 고병원성 변이체로 돌연변이된 조류 인플루엔자 바이러스(조류 독감 바이러스)의 한 종류이나, 현재 모두 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1의 유전자형 Z에 속한다. 유전자형 Z는 1996년 중국에서는 조류에서 최초로 나타나고 및 1997년 홍콩에서는 인간에서 최초로 나타난 H5N1의 보다 초기의 고병원성 유전자형으로부터 2002년에 재조합(reassortment)을 통해 등장했다. 인간 감염으로부터의 H5N1 바이러스 및 2004년과 2005년에 분리된 긴밀하게 관계된 조류 바이러스는 종종 유전자형 Z로 지칭되는, 단일의 유전자형에 속한다.
알려진 인간 사망 건수에 따라 순서대로, 인간에서 확인된 조류 인플루엔자 아형은 스페인 독감을 유발한 HlNl, 아시아 독감을 유발한 H2N2, 홍공 독감을 유발한 H3N2, H5N1, H7N7, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7이다.
인간에서 인간으로 전파시킬 수 있는 돌연변이된 전염성의 신규한 인플루엔자 변종이 출현하는 경우에 신속하게 대응할 수 있기 위해, 동물 또는 사람이 상기 바이러스에 의해 감염되었는지 여부를 결정하기 위한 신속하고 신뢰할 수 있는 테스트를 필요로 할 것이다. 환경, 동물 및 환자 시료로부터 바이러스를 검출하기 위한 현재의 검사 방법은 힘들고 시간을 많이 소요한다.
US-B-6,503,745는 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법에서의 용도와 함께 제공된 시클로펜탄 및 시클로펜텐 화합물을 개시한다. 상기 바이러스는 페투인(fetuin) 코팅된 표면을 이용하여 포획되고 검출은 뉴라미니다아제를 결합하는 표지된 화합물로 수행된다.
D. E. Noyola 등은 Journal of Clinical Microbiology, 2000, p. 1161 - 1165에서 페투인으로 코팅된 비드에 관해 보고한다. 페투인은 또한 뉴라미니다아제에 대한 기질로 작용하고, 검출은 응집(agglutination)을 통해 수행된다.
US-A-2003/0129618은 분석물의 중합체 물질로의 선택적 결합에 반응하여 중합체 물질에서 나타나는 형광을 이용하여 분석물을 검출하는 방법 및 이를 위한 조성물을 개시한다. 특히, 본 발명은 막 변형 반응(membrane modifying reaction) 및 그와 같은 변형을 일으키는 분석물의 형광 검출 및 작용 억제제(action inhibitor)의 스크리닝을 가능하게 한다.
모든 공지되고 접근가능한 신속한 현장 접근방법(on-site approach)은 바이러스 에피토프에 대한 항체의 이용 또는 단순한 뉴라미니다아제(NA) 테스트에 근거한다.
측방 유동(lateral flow) 기법 또는 다른 분석법 유형에 근거한 항체 접근방법의 주요한 단점은 항체 시약의 불안정성이다. 또한, 현재까지 이용가능한 면역학적 분석법의 대다수는 H5N1이 아닌, 인플루엔자 A에 대해 특이성을 보인다. 추가적으로, 항체의 이용은 불가피하게 분석 비용의 증가를 초래한다.
인플루엔자 바이러스에 대해 특이적인 NA 테스트의 주요 단점은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 현재 사용되는, 부분적으로 메틸화되어야 하는 필요한 값비싼 기질 시약이다.
본 발명은 청구항에 정의된 바와 같은 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 신속한 검출 방법, 상기 방법을 이용한 검출 시스템 및 상기 검출 시스템의 용도를 제공하는 것에 의해 이 문제들을 해결한다.
본 명세서에서 하기의 약자들이 사용될 것이다: 3'SLN = Neu5Acα2-3Galβl-4GlcNAc HA = 헤마글루티닌(hemagglutinin); HAR = 혈구응집반응(reaction of hemagglutination); LOD = 검출 한계(limit of detection); NA = 뉴라미니다아제(neuraminidase); TCID = 조직 배양 감염 용량(tissue culture infectious dose); TN 완충액 = 0.1M NaCl을 포함하는 0.02 M tris-HCl (pH 7.2).
본 발명에 따라, 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 신속한 검출 방법이 이용되고, 상기 방법은:
a) 글리코포린, a1-산 당단백질, a2-마크로글로불린, 오보뮤코이드(ovomucoid) 및 그들의 조합과 같은 당 단백질에 접합되거나, 또는 상기 당 단백질과 조합된 조성물 내에 위치하는 천연 올리고사카라이드 또는 합성 올리고사카라이드로 구성된 군으로부터 선택된 한 종류 이상의 탄수화물 수용체를 포함하고, 상기 탄수화물 수용체가 상기 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 헤마글루티닌 성분에 결합하는 것인 지지체에 상기 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 결합시키는 단계;
b) 상기 결합된 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 뉴라미니다아제 성분을 그의 표지된 효소 기질과 반응시켜, 검출가능한 신호의 생성을 유발하는 단계; 및
c) 상기 단계 b)에서 생성된 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
특히, 모든 알려진 조류 인플루엔자(AI) 아형(sub-type)을 포함하는 인플루엔자 바이러스 및/또는 인플루엔자 입자가 검출된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자는 특정한 아형 또는 아형의 군을 포함한다. 본 발명의 방법은 고병원성 변이체(highly pathogenic variant)를 포함하는 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 검출하기에 적합하다.
본 발명은 특히, 크로마토그래피용 용지(chromatographic paper) 또는 막(membrance)인 지지체로 수행될 수 있다. 그와 같은 재료는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에 따르면, 전술된 탄수화물 수용체를 상기 지지체에 공유결합에 의해 부착시키거나 또는 물리적으로 흡착시킬 수 있다.
본 발명은 특히 α2-3Gal 모티브를 포함하는 탄수화물 수용체를 이용한다. 본 발명의 일 구체예(도트-블랏(dot-blot) 방법)에 따르면, 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 결합은 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 함유한 시료를 지지체에 스팟(spot)으로 적재하는 것에 의해 수행된다. 본 발명에 따르면, 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 결합은 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 함유한 시료를 소위 측방 유동 방법의 형태로 상기 지지체를 따라 적시는 것(soak)에 의해 수행된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 뉴라미니다아제 성분의 표지된 효소 기질이 결합된 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 위치 위에 침전된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 효소 기질은 발색성 기(chromogenic group)로 표지되고 뉴라미니다아제와의 반응은 상기 효소 기질의 색상 변화를 유도한다. 효소 기질로서, 무엇보다도, 하기의 N-아세틸 뉴라민산의 발색성 유도체, 특히, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-α-N-아세틸 뉴라민산이 이용될 수 있다. 대안적으로, 뉴라미니다아제와의 반응은 적합한 형광 분자를 표지로 이용하는 경우 특정한 형광 신호를 유도한다.
본 발명의 방법은 유리하게 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 신속한 검출을 위한 검출 시스템으로 수행될 수 있다. 상기 시스템은 본 발명의 방법을 이용하여 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 식속한 검출을 위한 검출 시스템을 포함하고, 상기 시스템은:
a) 글리코포린, a1-산 당단백질, a2-마크로글로불린, 오보뮤코이드 및 그들의 조합과 같은 당 단백질에 접합되거나, 또는 상기 당 단백질과 조합된 조성물 내에 위치하는 천연 올리고사카라이드 또는 합성 올리고사카라이드로 구성된 군으로부터 선택된 한 종류 이상의 탄수화물 수용체를 포함하고, 상기 탄수화물 수용체가 상기 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 헤마글루티닌 성분에 결합하는 것인 지지체;
b) 상기 뉴라미니다아제 성분과 반응하여, 검출가능한 신호를 생성하는 표지된 효소 기질을 포함한다.
특히, 지지체는 시료 및 양성 대조군에 의한 테스트 결과의 판독을 위한 창을 갖는 플라스틱 홀더 내에 담긴다. 상기 지지체는 특히, 시료 내의 바이러스 함량의 반-정량적(semi-quantitative) 추정을 위한 특정한 결합제의 둘 이상의 상이한 양을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 지지체는 상이한 아형에 속하는 바이러스의 동시 검출을 상이한 아형 특이성의 둘 이상의 특정한 수용체를 포함한다. 본 발명의 검출 시스템은 원하는 특이성의 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 존재를 밝힌 후에 역전사 중합효소 연쇄반응(reversed transcription polymerase chain reaction)과 같은 확인 테스트를 위한 시료 용기 및 수송 유닛으로 작용한다.
본 발명에 따라, 스웝(swab), 분변물 및 혈액과 같은 동물 및/또는 인간으로부터 유래된 시료, 환경으로부터의 시료 내의 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 검출 및/또는 새로운 고병원성 바이러스 아형의 조기 경보 시스템으로서의 상기 검출 시스템의 용도가 청구된다.
헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)가 인플루엔자 바이러스의 표면 상에 존재한다. HA는 바이러스의 시알릴-함유 세포 수용체로의 결합을 유도하고, NA는 바이러스의 표적 세포로의 접근을 증진하고 감염된 세포 및 천연 억제제로부터의 바이러스의 방출을 촉진하며[Matrosovich, M. N., Matrosovich, T.Y., Gray, T., Roberts, N.A., Klenk, H. D. 2004: J. Virol.. 78(22) 12665-7], 즉, HA는 수용체 결합성(receptor-binding)이고, NA는 수용체는 수용체-파괴성(receptor-destroying)이다. 효율적인 바이러스 복제를 위한 중요한 조건은 HA와 NA의 조화된 작용이고, 상이한 종에 대해, 이 두 활성의 결과는 상이하다. 조류로부터 분리된 인플루엔자 바이러스는 일부 독특한 특징을 보인다. 모든 조류 인플루엔자 바이러스는 Neu5Acα2-3Gal-종료 탄수화물 사슬(Neu5Acα2-3Gal-terminated carbohydrate cahin)에 대해 가장 높은 특이성을 갖는, HA를 갖는다. 또한, 그들의 NA 활성은 다른 기원의 바이러스에 비해 더 높다.
본 발명에 따른 검출 방법 및 검출 시스템에서, 조류 바이러스의 두 비리온 성분(virion component), HA 및 NA의 이 특성들이 이용된다. 인플루엔자 바이러스는 특정한 결합 분자, 바람직하게는 시알릴화(sialylated) 탄수화물을 포함하고 막에 결합된 물질에 결합되고, 막 상에서 상기 바이러스-함유 영역의 염색을 유발하는 뉴라미니다아제 기질과의 반응, 바람직하게는 소화(digestion)가 이어진다. 본 발명에 따른 독감(flu) 바이러스 검출 방법 및 시스템은 본 발명이 속하는 기술 분야의 현재의 테스트 시스템에 비해 다양한 장점을 보인다: 두 성분, HA 및 NA의 이용은 분석법의 특이성을 증가시키고 선택된 특이성을 갖는 검출 시스템의 구축을 가능하게 한다. 동시에 및 면역학적 방법에 기반한 검출 시스템과 대조적으로, 바이러스의 뉴라미니다아제 자체가 이 목적을 위해 이용되기 때문에, 양성 검출을 밝히기 위해 추가적인 마커 효소를 필요로 하지 않는다.
탄수화물 수용체 분자의 철저하게 선택된 종류의 상이한 변이체는 바이러스의 타입 및 아형과 독립적으로, 모든 인플루엔자 바이러스를 수집하고, H5N1과 같은 고병원성 변이체의 동시의 특이적 검출을 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 검출 시스템의 결과는 복잡한 장치의 이용 없이 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 0.1 내지 2시간 이내에 인플루엔자 바이러스의 검출을 가능하게 한다.
본 발명은 하기의 비-한정적인 실시예에 의해 더 설명될 것이다.
실시예 1:
특정한 탄수화물 수용체 분자의 제조를 위한 3'SLN 트리사카라이드의 폴리아크릴아미드 컨쥬게이트의 합성
200 ㎕ DMSO 중의 N-히드록시숙시니미드, MW ~1000 kDa로 완전히 활성화된 1.7 mg (10 μmol) 폴리아크릴산의 용액과 4 ㎕의 디이소프로필에틸아민을 200 ㎕ DMSO 중의 1.46 mg (2 μmol) 3'SLN-O(CH2)3NH2의 용액에 첨가하고 상기 혼합액을 37℃에서 48 시간 동안 유지시키고, 40 ㎕의 25% 암모니아 수용액 또는 40 ㎕의 에탄올아민을 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 18시간 동안 방치하고 세파로오스 LH 상에서의 겔-투과 크로마토그래피를 수행하였고, 수율은 ~ 90%였다.
실시예 2:
본 발명에 따른 방법 및 테스트 시스템을 이용한, 요막액에서 인플루엔자 바이러스의 검출
실시예-키트:
1. 테스트-스트립(Test- strip)
2. 프로브 완충액 버퍼 #1
3. 조영 완충액(Contrasting buffer) 버퍼 #2
4. 세척 완충액 A 버퍼 #3
5. 세척 완충액 B 버퍼 #4
6. 염색 완충액(Dying buffer) 버퍼 #5
7. 더블 스트립(8개의 웰을 갖는 2개의 행) 또는 96-웰 플레이트
8. 가위 또는 외과용 메스
9. 집게(Pincers)
10. 스트립 세척용 플레이트
11. 현상용 바이알(Development vial)
12. 항온기(또는 그 대용품)
13. 크로마토그래피 절차를 위한 카메라
(또는 스트립을 가진 96-웰 플레이트를 덮기 위해 이용되는, 덮개).
재료
스트립: 니트로셀룰로오스, 흡수제, Whatman, USA으로부터 수득된 시료 패드.
1. 특정 시약(페투인, Sigma)을 신선한 계란으로부터 분리하였다.
2. 완충액 #1: 3M NaCl 및 0.5% 트윈-20을 포함한 0.2 M tris-HCl(pH 7.2)
3. 완충액 #2: 0.3M NaCl 및 0.05% 트윈-20을 포함한 0.02 M tris-HCl(pH 7.2)
4. 완충액 #3: 0.1M NaCl 및 0.05% 트윈-20을 포함한 0.02 M tris-HCl(pH 7.2)
5. 완충액 #4: 0.1M NaCl을 포함한 0.02 M tris-HCl(pH 7.2)(TN 완충액)
6. 완충액 #5: 0.01 M CaCl2을 포함한 TN 완충액 중의 Neu-X의 4 mM 용액
TN 완충액은 또 다른 적합한 완충액(fitting buffer), 예를 들면, 인산염 완충 염수 또는 염수로 치환될 수 있다.
스트립(도 1)을 3개의 영역으로 나누었다: 적심(soaking) 영역, 검출 영역 및 흡수 영역. 탄수화물 수용체 분자의 라인(테스트 라인) 및 대조군 라인이 검출 영역에 위치했다. 막, 흡수제 및 시료 패드로부터 상기 스트립을 조립했다. 상기 스트립을 건조시키고 세척한 후, 탄수화물 수용체 분자(1 mg/mL 용액 1 마이크로리터)를 검출 영역에 적재하였다. 그 후, 상기 스트립을 18-25℃에서 밀폐된 플라스크에 보관했다.
검출
1. 시료 준비. 분석 직전에 완충액 #1 1/10 부(part)(v/v)를 프로브에 첨가하고 잘 흔들었다. 이것이 프로브 #1(P #1)이다.
2. 검출 절차는 여러 단계들을 포함했다(표 1).
제1 단계에서, 스트립의 시료 패드를 P #1의 80-100㎕에 넣었다. 모세관 현상의 작용시, 시료로부터의 액체가 빨아들여지고 바이러스 입자들이 탄수화물 수용체 분자에 결합하는 것인 검출 영역을 통해 흡수 영역에 들어갔다. 이 절차의 지속시간은 시료의 점도에 의존적이나, 15분을 초과해서는 안된다. 완충액 #2를 플레이트의 동일한 웰에 첨가했다(대안적으로, 상기 스트립을 완충액 #2가 채워진 또 다른 웰로 옮길 수 있다). 10분 후에, 상기 스트립을 웰로부터 꺼냈다.
제2 단계에서, 스트립의 적심 부분을 (가위로) 잘라냈다. 상기 스트립 부분의 흡수 영역의 조심스러운 제거(예를 들면, 집게를 이용하여) 후에, 테스트 영역을 완충액 #3으로 세척하고 뒤이어 완충액 #4로 세척하였다. 뒤이어 흡수 영역도 잘라냈다.
제3 단계. 테스트 영역의 나머지를 완충액 #5가 담긴 플스스크에 넣었다. 상기 플라스크를 단단히 닫고 37-40℃에서 암소에 방치했다. 시료 중 인플루엔자 바이러스의 존재를 탄수화물 수용체 분자 영역의 암청색 염색으로 검출하였다. 이 단계의 지속시간은 시료 내의 바이러스 농도에 의존적이고, 바이러스가 혈구응집 반응(약 2의 HAR)에 의해 검출될 수 있을 때까지 20분 내지 60분이 소요될 수 있다. 일반적으로, 이 시료들은 약 105의 TCID/ml 값을 갖는다. 10배 및 100배 낮은 바이러스 함량의 프로브(104-103 TCID/ml)의 경우, 염색은 수 시간 후에 나타날 수 있다. 이 절차 후에, 스트립을 용액에서 꺼내고 반응 결과의 육안 검사를 수행하였다.
검출 영역에서 뉴라미니다아제의 대조군 라인을 이용하여 분석법의 기능성을 평가하였다. 대조군 영역의 암청색 염색이 나타나야 한다.
결과는 하기와 같이 해석하였다:
1) 균일하게 염색된 라인이 관찰되는 경우, 양성으로 간주하였다. 즉, 프로브가 바이러스를 함유한 것으로 간주하였다; 색상의 강도가 대조군 라인의 강도와 유사해야 한다.
2) 약하게 염색된 라인이 관찰되는 경우, 시료는 명확한 검출을 위해 충분하지 않은 농도로 바이러스를 포함하며, 스트립의 완충액 #5에 대한 노출이 밤새 지속되거나 또는 테스트가 1회 더 반복될 수 있다.
3) 염색된 라인의 부재는 시료 내에 바이러스가 없다거나 또는 그 농도가 최소 검출 수준 미만이라는 것을 의미한다.
4) 양성 대조군 라인에서 염색된 라인의 부재는 실험이 잘못 수행되었다거나 또는 대조군 라인의 NA가 파괴되었다는 것을 의미한다: 이 경우, 새로운 테스트 키트를 이용하여 표본을 재-테스트할 것이 권장된다.
테스트 민감도에 대한 데이터가 표 2에 주어진다.
표 1: 본 발명에 따른 검출 방법의 개요
Figure 112008086715302-PCT00001
Figure 112008086715302-PCT00002
Figure 112008086715302-PCT00003
실시예 3:
본 발명에 따른 검출 시스템을 이용한, 닭 분변에서 인플루엔자 바이러스의 검출
본 실시예에서, 실시예 2에서 사용된 것과 동일한 재료 및 방법을 이용하였다.
1. 건강한 닭의 분변의 현탁액(완충액 10ml 당 2g의 건조 물질) 중 바이러스-함유 프로브의 연속 희석(serial dilution)을 수행하였다. 분변은 테스트에 의한 인플루엔자 바이러스의 민감도와 특이성에 영향을 미치지 않는 것으로 입증되었다.
2. 신선한 닭의 분변에, A/duck/Alberta/76 바이러스(HAR-역치 1:10)의 1/10 부(v/v)를 첨가하고, 혼합물을 균질화시켰다. 균질액에 완충액 #2를 첨가한 후(1:1 v/v), 결과물인 현탁액의 분량(aliquot)을 분석에서 이용하기 위해 채취하였다. 2시간 후에 테스트 영역에서 검청색 염색이 나타났다. 테스트 절차의 개시 전에 표 1로부터의 시료에 닭의 분변을 첨가했을 때 테스트 결과에 대한 주목할 만한 영향은 관찰되지 않았다.
실시예 4:
본 발명에 따른 검출 시스템을 이용한, 죽은 닭의 폐 조직에서 인플루엔자 바이러스의 검출
본 실시예에서, 실시예 2에서 사용된 것과 동일한 재료 및 방법을 이용하였다.
인플루엔자 바이러스 H5N1에 의한 감염으로 사망한 닭의 폐 조직을 분석된 실린 완충액(silin buffer)으로 추출하였다(수집: Crimea/January 2006). 인플루엔자 바이러스는 분석된 닭의 폐에서 용이하게 검출될 수 있는 것으로 확인할 수 있었다.
표 2:본 발명에 따른 테스트 시스템으로 조사된 바이러스-함유 시료에서 조류 인플루엔자 바이러스의 검출 한계(LOD)
Figure 112008086715302-PCT00004
a - 이것은 A/Vietnam/1194/04 병원성 바이러스로부터의 HA 및 NA 유전자 및 A/Puerto Rico/2/34로부터의 모든 내부 단백질(inner protein) 유전자를 갖는, 백신 스트레인이다. 바이러스는 회색척수염 및 바이러스성 뇌염 연구소(Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitis)(Moscow Region) 및 인플루엔자 연구소(Institute of Influenza)(St. Petersburg)로부터 수득하였다.

Claims (19)

  1. 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 성분을 포함하는 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 신속하게 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 글리코포린, a1-산 당단백질, a2-마크로글로불린, 오보뮤코이드 및 그들의 조합과 같은 당 단백질에 접합되거나, 또는 상기 당 단백질과 조합된 조성물 내에 위치하는 천연 올리고사카라이드 또는 합성 올리고사카라이드로 구성된 군으로부터 선택된 한 종류 이상의 탄수화물 수용체를 포함하고, 상기 탄수화물 수용체는 상기 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 헤마글루티닌 성분에 결합하는 것인 지지체에 상기 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 결합시키는 단계;
    b) 상기 결합된 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 뉴라미니다아제 성분을 그의 표지된 효소 기질과 반응시켜, 검출가능한 신호의 생성을 유발하는 단계; 및
    c) 상기 단계 b)에서 생성된 신호를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자는 모든 알려진 조류 인플루엔자(AI) 아형(subtype)을 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자는 특정 아형 또는 아형의 그룹을 포함하는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자는 고병원성 변이체(highly pathogenic variant)를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지체는 크로마토그래피 용지 또는 막인 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄수화물 수용체는 상기 지지체에 공유결합에 의해 부착되거나 또는 물리적으로 흡착된 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 탄수화물 수용체는 α2-3Gal 모티프를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 상기 결합은 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 함유한 시료를 상기 지지체에 스팟으로 로딩하는 것(도트-블랏 방법)에 의해 수행되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 상기 결합은 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 함유한 시료를 상기 지지체를 따라 적시는 것(측방 유동 방법)에 의해 수행되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴라미니다아제 성분의 상기 표지된 효소 기질은 상기 결합된 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 위치에 침전되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 기질은 발색성 기로 표지되고 상기 뉴라미니다아제와의 반응은 상기 효소 기질의 색상 변화를 유도하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 기질은 N-아세틸뉴라민산의 발색성 유도체, 특히, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-α-N-아세틸뉴라민산인 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴라미니다아제와의 반응은 특정한 형광 신호를 유도하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 신속하게 검출하기 위한 검출 시스템으로서, 상기 시스템은:
    a) 글리코포린, a1-산 당단백질, a2-마크로글로불린, 오보뮤코이드 및 그들의 조합과 같은 당 단백질에 접합되거나, 또는 상기 당 단백질과 조합된 조성물 내 에 위치하는 천연 올리고사카라이드 또는 합성 올리고사카라이드로 구성된 군으로부터 선택된 한 종류 이상의 탄수화물 수용체를 포함하고, 상기 탄수화물 수용체가 상기 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 헤마글루티닌 성분에 결합하는 것인 지지체;
    b) 상기 뉴라미니다아제와 반응하여, 검출가능한 신호를 생성하는 표지된 효소 기질을 포함하는 것인 검출 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 지지체는 시료 및 양성 대조군에 의한 테스트 결과의 판독을 위한 창(window)을 갖는 플라스틱 홀더(plastic holder) 내에 담기는 것인 검출 시스템.
  16. 제14항 및/또는 제15항에 있어서, 상기 지지체는 상기 시료 내의 바이러스 함량의 반-정량적(semi-quantitative) 추정을 위해 상기 특정한 결합제의 둘 이상의 상이한 양을 포함하는 것인 검출 시스템.
  17. 제14항 및/또는 제16항에 있어서, 상기 지지체는 상이한 아형(subtype)에 속하는 바이러스의 동시 검출을 위해 상이한 아형 특이성의 둘 이상의 특정한 수용체를 포함하는 것인 검출 시스템.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 원하는 특이성의 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 존재를 밝힌 후, 상기 시스템은 역전사 PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)과 같은 확인 테스트를 위한 시료 용기 및 수송 유닛으로 작용하는 것인 검출 시스템.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 검출 시스템의, 스웝(swab), 분변물 및 혈액과 같은 동물 및/또는 인간으로부터 유래된 시료, 환경으로부터의 시료에서 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 검출하기 위한 및/또는 새로운 고병원성 바이러스 아형의 조기 경보 시스템으로서의 용도
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