CN109342726A - 一种犬腺病毒ⅱ型检测试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒，包括抗犬腺病毒Ⅱ型的单克隆抗体E1和E2、Tris‑HCl缓冲液、包被板条、层析柱、铕标记试剂、分析缓冲液和标准品。本发明采用时间分辨荧光微球作为标记物，提高了对犬腺病毒的检测灵敏度和准确度；本发明的试剂盒可以动态观察疗效和病情监测：定量检测犬腺病毒抗原浓度变化，可对CAV的病程、治疗、预后起一个动态监测的作用；本发明的试剂盒检测的批间和批内差异小，性能稳定。

Description

一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其是一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒和方法。

背景技术

犬腺病毒(CAV)是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒，有两个血清型。Ⅰ型可引起犬传染性肝炎和狐狸脑炎；Ⅱ型主要引起犬的传染性喉气管炎和肠炎，多可见于4月龄以下的幼犬，潜伏期为5-6天，以持续性高热(体温在39.5℃左右)、咳嗽、浆液性或黏液性鼻涕、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎为特征。CAV-Ⅱ型不仅流行于我国和世界各地家养的犬、狐中，而且广泛地流行于野生的狐、熊、郊狼和浣熊等动物中。该病一年四季均可发生，各种性别、年龄和品种的犬、狐均易感染，但其中以离乳至一岁的动物，发病率和死亡率最高。病程较犬瘟热短，大约在2周内恢复或死亡，有时在数日内死亡。如与犬瘟热混合感染，则死亡率更高。患病犬及带毒犬是本病传染来源，本病主要通过消化道感染，也可通过胎盘传染。

市场上现有的检测犬腺病毒Ⅱ型的试剂盒有胶体金法。传统的胶体金法只能定性分析阳性与阴性问题，而无法做到精确定量，且检测灵敏度低。因此，建立一种可以定量检测CAV-Ⅱ型的鉴别与诊断方法具有很高的实用性和现实意义，以便尽快采取有效的治疗和防控措施，减少这些疾病对养犬业造成的危害。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒，采用本发明的试剂盒和检测方法能定量检测犬腺病毒抗原浓度变化，可对CAV的病程、治疗、预后起一个动态监测的作用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：

在第一个方面，本发明提供了一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒，包括抗犬腺病毒Ⅱ型的单克隆抗体E1和E2、Tris-HCl缓冲液、包被板条、层析柱、铕标记试剂、分析缓冲液和标准品。需要说明的是，单克隆抗体E1和E2均靶向抗犬腺病毒Ⅱ型的核衣壳蛋白，但是，本发明的试剂盒中采用的单克隆抗体包括但不限于E1和E2，还可以是其它能靶向结合犬腺病毒Ⅱ型核衣壳蛋白的单克隆抗体，只要该单克隆抗体具有足够的特异性和亲和力即可。其中，单克隆抗体E1和E2的亲和力可以相同，也可以有差异，但是对核衣壳蛋白的亲和力差异不得超过10％，以免导致检测误差。

优选地，所述铕标记试剂为Eu³⁺标记试剂盒。

优选地，所述层析柱为Sephadex G-50层析柱。

优选地，所述分析缓冲液为Tris-HCl、NaCl、BSA、Tween-20和NaN₃的混合溶液；更优选地，所述分析缓冲液为50mmol/L的Tris-HCl，每升分析缓冲液中还含有0.09％(W/V)的NaCl，0.02％(W/V)BSA，0.05％(W/V)Tween-20以及0.05％(W/V)的NaN₃；优选地，所述分析缓冲液的pH值为7.8。

优选地，所述标准品的制备方法为：用50mmol/L的Tris-HCl(pH 7.8)的标准品缓冲液将犬腺病毒抗原准确稀释成0，5，10，20，50，100ng/mL 6个浓度，即得，其中，所述标准品缓冲液含有0.2％(W/V)BSA和0.1％(W/V)NaN₃。

在第二个方面，本发明提供了一种犬腺病毒Ⅱ型的检测方法，包括如下步骤：

(1)向包被有抗犬腺病毒抗体E1的酶联板上加入犬腺病毒抗原标准品和待测样本；

(2)向步骤(1)所得酶联板加入分析缓冲液，震荡温育，洗涤液洗涤，再加入以分析缓冲液稀释的Eu³⁺-E2标记抗体，震荡温育，洗涤液洗涤；

(3)最后加入增强液震荡后，在时间分辨荧光检测仪上进行检测。

优选地，所述检测方法包括如下步骤：

(1)向包被有抗犬腺病毒抗体E1的酶联板上加入25μL犬腺病毒抗原标准品和待测样本；

(2)向步骤(1)所得酶联板加入200μL分析缓冲液，震荡温育1h，洗涤液洗涤4次，再加入以分析缓冲液1：50～100倍稀释的Eu³⁺-E2标记抗体200μL/孔，震荡温育1h，洗涤液洗涤6次；

(3)最后加入增强液200μL/孔，震荡5min后，在时间分辨荧光检测仪上进行检测。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明采用时间分辨荧光微球作为标记物，提高了对犬腺病毒的检测灵敏度和准确度；本发明的试剂盒可以动态观察疗效和病情监测：定量检测犬腺病毒抗原浓度变化，可对CAV的病程、治疗、预后起一个动态监测的作用；本发明的试剂盒检测的批间和批内差异小，性能稳定；其中的单克隆抗体与犬瘟热、犬细小、犬流感、狂犬等抗体没有明显交叉反应。

附图说明

图1为标准曲线。

具体实施方式

本发明采用时间分辨荧光微球作为标记物，采用双抗体夹心法检测犬腺病毒抗原，可以实现定量检测，提高了检测的灵敏度和准确性。

在本发明中，采用时间分辨荧光微球作为标记物，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度和抗干扰能力；同时，本发明的试剂盒操作方便，检测速度快，具有较高的稳定性和重显性。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本申请中试剂的浓度均为质量浓度；本申请中试剂均可从市场或其它公开渠道获得；本申请中的实验方法均为常规方法。

实施例1

本发明的犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒的一种实施例，包括抗犬腺病毒Ⅱ型的单克隆抗体E1和E2、Tris-HCl缓冲液、包被板条、Sephadex G-50层析柱、Eu³⁺标记试剂盒、分析缓冲液和标准品。

其中，各成分分别采用如下方法制备：

1、抗犬腺病毒抗体的制备

用犬腺病毒Ⅱ型(CAV-Ⅱ)进行BALB/c小鼠免疫。通过细胞融合技术进行单克隆抗体制备，筛选特异性强、亲和力高的抗犬腺病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体E1、E2。

2、包被板制备

将纯化的抗CAV-Ⅱ单克隆抗体E1用Tris-HCl缓冲液稀释，稀释成3μg/mL，100μL/孔加入包被板条孔内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后获得抗CAV-Ⅱ单克隆抗体包被板条。

3、Eu³⁺标记抗体的制备

将待标记抗体E2加入Millipore公司的带有滤膜的离心管中离心，用标记缓冲液重复洗涤数次。再将200μL标记抗体E2和铕标记试剂充分混匀，室温震荡过夜。标记完成后用Sephadex G-50层析柱分离纯化，洗脱液洗脱，同时收集流岀液，逐管测量吸光度，合并峰管，测定蛋白含量，根据Eu³⁺标记试剂盒说明书所提供的公式测定标记率和蛋白回收率。

4、分析缓冲液

分析缓冲液为：50mmol/L pH 7.8Tris-HCl，每升含0.09％NaCl，0.02％BSA，0.05％Tween-20，0.05％NaN₃。

5、标准品制备

用含0.2％BSA，0.1％NaN3，50mmol/L的Tris-HCl(pH 7.8)的标准品缓冲液将犬腺病毒抗原准确稀释成0，5，10，20，50，100ng/mL 6个浓度。

实施例2

本发明的犬腺病毒Ⅱ型的检测方法的一种实施例，包括如下步骤：

向包被有抗犬腺病毒抗体E1的酶联板上加入25μL犬腺病毒抗原标准品和待测样本，再加入200μL分析缓冲液，震荡温育1h，洗涤液洗涤4次，再加入以分析缓冲液1：50～100倍稀释的Eu³⁺-E2标记抗体200μL/孔，震荡温育1h，洗涤液洗涤6次，最后加入增强液200μL/孔震荡5min后，在时间分辨荧光检测仪上进行检测。

犬腺病毒时间分辨标准曲线见附图1，标准曲线的相关系数为R²＝0.9920，表明线性相关性良好。该方法的检测灵敏度为0.56ng/mL。

实施例3本发明的试剂盒检测犬腺病毒的特异性

选取几个常见的病毒抗原进行特异性分析，犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬流感病毒、狂犬病毒用实施例1的试剂盒和实施例2的检测方法测定，结果见表1。实施例1的试剂盒测定高浓度犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬流感病毒、狂犬病毒时，测定浓度均远低于理论浓度，说明该方法的特异性较好。

表1特异性实验结果(ng/mL)

实施例4本发明的试剂盒检测犬腺病毒的精密度

(1)采用实施例1的试剂盒和实施例2的检测方法对精确定量的高中低三个标准品(见实施例1中第5点标准品制备)浓度进行测定，各设置10个复孔。实施例1的试剂盒的批内变异系数和批间变异系数均≤10％(见表2)，符合试剂盒规定要求。

表2精密度实验结果

(2)精确度实验(回收实验)按照常规方法进行回收实验。结果见表3，高中低三个浓度的标准品回收率在98.5-100.43％之间。

表3回收实验结果

实施例5本发明的试剂盒检测犬腺病毒的稳定性

实施例1的试剂盒的各组成部分放于37℃加速破坏7d后再对各组分进行检测，发光值均有所降低，但变化幅度均在10％以内，表示本发明的试剂盒及其检测方法比较稳定。

实施例6本发明的试剂盒临床应用

取广州福懋宠物医院经胶体金法(购自上海快灵生物科技有限公司)检测的犬腺病毒Ⅱ型阳性样本40份，阴性样本30份，采用实施例1的试剂盒进行检测。

具体检测步骤：向包被酶联板上加入25μL待测样品，再加入200μL分析缓冲液，震荡温育1h，洗涤液洗涤4次，再加入以分析缓冲液1：50～100倍稀释的标记抗体200μL/孔，震荡温育1h，洗涤液洗涤6次，最后加入增强液200μL/孔震荡5min后在时间分辨荧光检测仪上进行检测。犬瘟热病毒浓度根据标准品和对应的RLU值建立的标准曲线进行定量计算。

实施例1的试剂盒检测阳性为42份，阴性为28份。犬腺病毒用实施例1的试剂盒检测阳性率为60％，胶体金法的检测阳性率57.1％，实施例1的试剂盒检测结果与酶联免疫吸附试验的符合率为95.2％。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒，其特征在于，包括抗犬腺病毒Ⅱ型的单克隆抗体E1和E2、Tris-HCl缓冲液、包被板条、层析柱、铕标记试剂、分析缓冲液和标准品。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述铕标记试剂为Eu³⁺标记试剂盒。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述层析柱为Sephadex G-50层析柱。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述分析缓冲液为Tris-HCl、NaCl、BSA、Tween-20和NaN₃的混合溶液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述分析缓冲液为50mmol/L的Tris-HCl，每升分析缓冲液中还含有0.09％(W/V)的NaCl，0.02％(W/V)BSA，0.05％(W/V)Tween-20以及0.05％(W/V)的NaN₃。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述分析缓冲液的pH值为7.8。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品的制备方法为：用50mmol/L的Tris-HCl(pH 7.8)的标准品缓冲液将犬腺病毒抗原准确稀释成0，5，10，20，50，100ng/mL6个浓度，即得，其中，所述标准品缓冲液含有0.2％(W/V)BSA和0.1％(W/V)NaN₃。

8.一种犬腺病毒Ⅱ型的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)向包被有抗犬腺病毒抗体E1的酶联板上加入犬腺病毒抗原标准品和待测样本；

(2)向步骤(1)所得酶联板加入分析缓冲液，震荡温育，洗涤液洗涤，再加入以分析缓冲液稀释的Eu³⁺-E2标记抗体，震荡温育，洗涤液洗涤；

(3)最后加入增强液震荡后，在时间分辨荧光检测仪上进行检测。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)向包被有抗犬腺病毒抗体E1的酶联板上加入25μL犬腺病毒抗原标准品和待测样本；

(2)向步骤(1)所得酶联板加入200μL分析缓冲液，震荡温育1h，洗涤液洗涤4次，再加入以分析缓冲液1：50～100倍稀释的Eu³⁺-E2标记抗体200μL/孔，震荡温育1h，洗涤液洗涤6次；

(3)最后加入增强液200μL/孔，震荡5min后，在时间分辨荧光检测仪上进行检测。