CN111426840A - 一种新型冠状病毒检测试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新型冠状病毒检测试纸条及其制备方法和应用，该试纸条包括结合垫和分析膜，所述结合垫上包被发光物质标记的2019‑nCoV重组抗原和鼠抗人HCG单克隆抗体；沿层析方向在所述分析膜上依次设有T2检测线、T1检测线及质控线，所述T2检测线处包被小鼠抗人IgG单克隆抗体，所述T1检测线处包被小鼠抗人IgA单克隆抗体及小鼠抗人IgM单克隆抗体，所述质控线处包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗体。该试纸卡同时测定患者血清中IgA抗体、IgM抗体及IgG抗体的阳性情况，能够更准确的检测出患者体内早期抗体水平情况，辅助判断患者所处于新型冠状病毒感染的不同时期，提高了新型冠状病毒检测的灵敏度和特异性。

Description

一种新型冠状病毒检测试纸条及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒检测试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒（2019-nCoV，SARS-CoV-2）是人类分离的第七类冠状病毒。该病毒属于β属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别。目前研究显示其与蝙蝠SARS样冠状病毒（Bat-SL-CoV ZC45）同源性达 85%以上。
SARS-CoV-2基本结构为基因组RNA和磷酸化核衣壳蛋白（N蛋白）组成的包膜结构，包膜结构嵌合4种蛋白：刺突糖蛋白(S蛋白)、小包膜糖蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)和血凝素糖蛋白(HE蛋白)。N蛋白被埋在磷脂双层中被两种不同类型的刺突蛋白覆盖，负责营养物质运输的膜蛋白（M蛋白，属于Ⅲ型跨膜糖蛋白）和包膜蛋白（E蛋白）位于病毒包膜的S蛋白之间。
现有的冠状病毒核酸检测方法包括全基因组测序、RT-PCR法、CRISPR、逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP)和实时RT-LAMP等。针对SARS-CoV-2核酸的检测，当前最为普遍适用的方法是实时荧光定量PCR法，即通过对标本中的病毒RNA进行提取、逆转录、PCR扩增特定保守序列后，通过荧光等常规方法进行显示。依赖于SARS-CoV-2与SARS-CoV的密切遗传相关性，临床上对SARS-CoV-2的核酸检测所选用的引物设计靶点和SARS-CoV一致，通过扩增RNA依赖性的RNA聚合酶（RdRp）基因、E蛋白基因和N蛋白基因序列来检测SARS-CoV-2是否存在。
免疫检测利用抗原与抗体特异性结合的原理，新型冠状病毒表面存在多种结构蛋白，包括多个抗原表位，以此来制备抗体检测抗原的存在，可直接证明样本中含有新型冠状病毒。
但是，免疫法检测灵敏度和特异性与相应制备的抗体、抗原特异性密切相关，同时几乎无法检测潜伏期和感染初期的病人，此时人体内无抗体产生。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种新型冠状病毒检测试纸条及其制备方法和应用，以对新型冠状病毒进行灵敏度更高的检测。
基于上述目的，本发明第一方面提供了一种新型冠状病毒检测试纸条，包括结合垫和分析膜，所述结合垫上包被发光物质标记的2019-nCoV重组抗原和鼠抗人HCG单克隆抗体；沿层析方向在所述分析膜上依次设有T2检测线、T1检测线及质控线，所述T2检测线处包被小鼠抗人IgG单克隆抗体，所述T1检测线处包被小鼠抗人IgA单克隆抗体及小鼠抗人IgM单克隆抗体，所述质控线处包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗体。
在2019-nCoV中，S蛋白是糖蛋白，其功能上可分为两个亚基，分别为S1和S2，分别负责病毒与细胞膜的结合和融合。S1又分为氨基末端域(S1-NTD)和羧基末端域(S1-CTD)，其中 S1-CTD起着受体结合域（receptor- binding domain, RBD)的作用，负责结合ACE2并进入细胞，2019-nCoV受体结合域与人类 ACE2的晶体结构表明，2019-nCoV的受体结合域包含一个核心结构和一个受体结合基序。
经研究，本发明申请人发现，在新型冠状病毒患者感染早期阶段（2~3）天有部分患者血液中可检测到S蛋白的IgA抗体，可以推断IgA抗体可和IgM抗体一起作为早期感染的指标。
IgM抗体是免疫应答中首先分泌的抗体, 是病毒感染自体免疫过程中最早出现的抗体，可作为近期急性感染的标志。在通常情况下，IgM抗体产生早，一经感染，快速产生，多在3~5天后开始出现阳性，维持时间短，消失快，血液中IgM抗体检测阳性可作为早期感染的指标。
IgG抗体产生晚，维持时间长，消失慢，滴度恢复期较急性期有4倍及以上增高，血液中IgG抗体检测阳性可作为感染和既往感染的指标。
因此，通过检测患者血清中IgA抗体、IgM抗体及IgG抗体的阳性情况，将有助于判断患者所处新型冠状病毒感染的不同时期。
采用该新型冠状病毒检测试纸条进行新型冠状病毒检测时可能出现如图1所示的三种结果，结果判断方法如下：
1、T1检测线阳性：检测窗T1检测线和质控线显色，则表明该样本检测出新型冠状病毒IgM抗体和/或新型冠状病毒IgA抗体，可能处于早期感染或现症感染，可以结合临床症状进行最终的确认以提高准确率。
2、T2检测线阳性：检测窗T2检测线和质控线显色，则表明该样本检测出新型冠状病毒IgG抗体，可能处于现症感染或既往感染，可以结合临床症状进行最终的确认以提高准确率。
3、阴性：检测窗仅质控线显色，则表明该样本未检测出新型冠状病毒IgM抗体或IgA抗体或IgG抗体。
4、无效：检测窗质控线未显色，则表明该新型冠状病毒检测试纸条无效，该样本检测结果亦无效。
在本发明中，可选地，所述T2检测线、所述T1检测线及所述质控线之间相互保持相对平行状态。
本发明中，可选地，所述2019-nCoV重组抗原携带His-Tag。
His-Tag即His-tag单抗，又叫6*His-tag单抗或6*His单克隆抗体；采用His-Tag对2019-nCoV重组抗原进行标记，具有下述优势：
（1） N-端的 His-Tag 与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；
（2）采用固定化金属离子亲合层析纯化 His-Tag 融合蛋白操作更加简便；
（3）His-Tag对2019-nCoV重组抗原本身特性几乎没有影响，不会改变2019-nCoV重组抗原本身的可溶性和生物学功能；
（4）His-Tag非常小，一般不影响蛋白质的功能，且在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；
（5）His-Tag 的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；
（6）与其它亲和标签构建成双亲和标签，并可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；His-Tag 融合蛋白的适用范围也较广，既可以在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化，通常用来纯化疏水性强的目的蛋白；也可以在变性条件下进行纯化，通常用来纯化包涵体蛋白。
在本发明中，可选地，所述发光物质为胶体金，所述结合垫为胶体金垫，所述分析膜为硝酸纤维素膜。
在本发明中，可选地，所述检测试纸条还包括PVC底板、样品垫和吸水滤纸，沿层析方向在所述PVC底板上依次铺设有样品垫、结合垫、分析膜及吸水滤纸，所述样品垫部分搭接在所述结合垫上，所述结合垫部分搭接在所述分析膜的一侧，所述吸水滤纸部分搭接在所述分析膜的另一侧；所述样品垫上设有加样孔。
基于相同的目的，本发明第二个方面提供了一种新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，所述方法包括：
（1）准备2019-nCoV重组抗原；
（2）制备结合垫：制备胶体金，通过调节胶体金的pH值将胶体金分别与2019-nCoV重组抗原及鼠抗人HCG单克隆抗体结合得胶体金标记的2019-nCoV重组抗原及胶体金标记的鼠抗人HCG单克隆抗体，然后分别采用胶体金标记的2019-nCoV重组抗原及胶体金标记的鼠抗人HCG单克隆抗体包被结合垫；
（3）制备分析膜：在硝酸纤维素膜上采用0.1uL/mm的喷点量喷涂小鼠抗人IgG单克隆抗体制备T2检测线，在硝酸纤维素膜上采用0.1uL/mm的喷点量喷涂小鼠抗人IgA单克隆抗体及小鼠抗人IgM单克隆抗体制备T1检测线，在硝酸纤维素膜上采用0.1uL/mm的喷点量喷涂山羊抗小鼠IgG多克隆抗体制备质控线；
（4）试剂条的组装：在PVC底板上沿层析方法依次铺设样品垫、结合垫、分析膜及吸水滤纸，并且样品垫部分搭接在结合垫上，结合垫部分搭接在分析膜的一侧，吸水滤纸部分搭接在分析膜的另一侧，得试剂条。
本发明中，可选地，采用100ml1/万氯金酸及1.8ml1%柠檬酸三钠制备胶体金；胶体金分别与2019-nCoV重组抗原及鼠抗人HCG单克隆抗体结合的条件为：每毫升胶体金中加入20μL的0.1M的碳酸钾溶液，将胶体金的pH值调节为8.3~8.7，然后分别将15μg/mL的鼠抗人HCG单克隆抗体及15μg/mL的2019-nCoV重组抗原与胶体金结合。
本发明中，可选地，采用的小鼠抗人IgA单克隆抗体的浓度为0.1-0.3mg/ml，采用的小鼠抗人IgM单克隆抗体的浓度为0.3-0.6mg/ml，采用的小鼠抗人IgG单克隆抗体的浓度为1-3mg/ml，采用的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体的浓度为2.0mg/mL。
本发明中制备的新型冠状病毒检测试纸条的宽度范围为3.4～4.0 mm，T1检测线处包被小鼠抗人IgA单克隆抗体的量由小鼠抗人IgA单克隆抗体的浓度和小鼠抗人IgA单克隆抗体的喷点量共同决定，T1检测线处包被小鼠抗人IgM单克隆抗体的量由小鼠抗人IgM单克隆抗体的浓度和小鼠抗人IgM单克隆抗体喷点量共同决定，T2检测线处包被小鼠抗人IgG单克隆抗体的量由小鼠抗人IgG单克隆抗体的浓度和小鼠抗人IgG单克隆抗体喷点量共同决定、质控线处包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗体的量由山羊抗小鼠IgG多克隆抗体的浓度和山羊抗小鼠IgG多克隆抗体喷点量共同决定。
基于相同的目的，本发明第三方面提供了本发明第一方面提供的新型冠状病毒检测试纸条在制备检测新型冠状病毒试剂中的应用。
本发明提供的新型冠状病毒检测试纸条的检测原理为：在分析膜上检测区T1包被小鼠抗人IgA单克隆抗体和小鼠抗人IgM单克隆抗体，检测区T2包被小鼠抗人IgG单克隆抗体，在质控线处包被羊抗鼠多克隆抗体；在结合垫上包被胶体金标记的重组新型冠状病毒抗原和鼠抗人HCG单克隆抗体。小鼠抗人IgA单克隆抗体与阳性样本中的人新型冠状病毒抗体(2019-nCoV)-IgA具有结构互补性和亲和性、小鼠抗人IgM单克隆抗体与阳性样本中的人新型冠状病毒抗体(2019-nCoV)-IgM具有结构互补性和亲和性、小鼠抗人IgG单克隆抗体与人新型冠状病毒抗体(2019-nCoV)-IgG具有结构互补性和亲和性，故而，能够分别相互特异性结合；羊抗鼠多克隆抗体与鼠抗人HCG单克隆抗体具有结构互补性和亲和性，能够相互特异性结合。
检测阳性样本时，样本中的人新型冠状病毒抗体[(2019-nCoV)-IgG或(2019-nCoV)-IgM或(2019-nCoV)-IgA]与胶体金（Au）标记重组抗原[(2019-nCoV)-Ag]结合形成[Au-(2019-nCoV)-Ag]-[(2019-nCoV)-IgG]或[Au-(2019-nCoV)-Ag]-[(2019-nCoV)-IgM]或[Au-(2019-nCoV)-Ag]-[(2019-nCoV)-IgM]免疫复合物，由于层析作用复合物在分析膜内部向前流动，经过检测区时与包被的小鼠抗人IgA单克隆抗体、小鼠抗人IgM单克隆抗体结合、小鼠抗人IgG单克隆抗体，形成“[Au-(2019-nCoV)-Ag]-[(2019-nCoV)-IgG]－小鼠抗人IgG单克隆抗体”或“[Au-(2019-nCoV)-Ag]-[(2019-nCoV)-IgM]－小鼠抗人IgM单克隆抗体”或“[Au-(2019-nCoV)-Ag]-[(2019-nCoV)-IgA]－小鼠抗人IgA单克隆抗体”而凝集显色。胶体金标记鼠抗人HCG单克隆抗体与质控线处包被的羊抗鼠多克隆抗体结合而凝集显色。检测阴性样本时，样本中不含人新型冠状病毒抗体，致使不能形成免疫复合物，则只有质控线显色。
本发明提供的新型冠状病毒检测试纸条通过检测患者血清中IgA抗体、IgM抗体及IgG抗体的阳性情况，辅助判断患者所处于新型冠状病毒感染的不同时期，提高了新型冠状病毒检测的灵敏度和特异性。
对本发明的新型冠状病毒检测试纸条进行灵敏度试验，使用本发明的新型冠状病毒检测试纸条对112份临床确诊新型冠状病毒患者血清样本进行检测，患者发病7天内抗体检出比例为89.1%，7天后抗体检出比例上升为97%，112例患者总检出率为93.7%，该试纸条的灵敏度为93.7%。对本发明的新型冠状病毒检测试纸条进行特异性试验，使用本发明的新型冠状病毒检测试纸条对200例正常人血清标本进行检测，T1检测阳性率为2%，T2检测阳性率为3.5%，未出现T1和T2同阳性标本；即正常人群总检出比例为5.5%，该试纸条的特异性为94.5%。同时，采用肺炎支原体抗体阳性血清、甲型/乙型流感抗体阳性血清肺炎链球菌抗体、梅毒螺旋体阳性抗体、丙型肝炎病毒阳性抗体对本发明的新型冠状病毒检测试纸条进行交叉干扰试验，结果证明肺炎支原体抗体阳性血清、甲型/乙型流感抗体阳性血清肺炎链球菌抗体、梅毒螺旋体阳性抗体、丙型肝炎病毒阳性抗体对本发明的新型冠状病毒检测试纸条均无交叉干扰，该试纸条特异性强。
本发明的新型冠状病毒检测试纸条检测系列稀释的新型冠状病毒(COVID-19)T1检出限参考品和新型冠状病毒(COVID-19)T2检出限参考品最低检出限企业参考品各4份，最低检出限不低于1:8。
因此，本发明的新型冠状病毒检测试纸条灵敏度高、特异性强。
从上面所述可以看出，本发明提供的新型冠状病毒检测试纸条及其制备方法和应用，同时测定患者血清中IgA抗体、IgM抗体及IgG抗体的阳性情况，能够更准确的检测出患者体内早期抗体水平情况，辅助判断患者所处于新型冠状病毒感染的不同时期，提高了新型冠状病毒检测的灵敏度和特异性。并且该新型冠状病毒检测试纸条为单通道三线试剂，操作更为简单方便。
附图说明
为了更清楚地说明本说明书一个或多个实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书一个或多个实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的采用新型冠状病毒检测试纸条进行新型冠状病毒检测时可能出现的结果示意图；
图2为本发明提供的新型冠状病毒检测试纸条的结构示意图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本说明书一个或多个实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
实施例1 新型冠状病毒检测试纸条的组成
图2 为本发明提供的新型冠状病毒检测试纸条的结构示意图；如图2所示，该新型冠状病毒检测试纸条包括PVC底板1，沿层析方向在PVC底板1依次铺设的样品垫2、结合垫3、分析膜4和吸水滤纸5；样品垫2部分搭接在结合垫3上，结合垫3部分搭接在分析膜4的一侧，吸水滤纸5部分搭接在分析膜4的另一侧，样品垫2上设置有加样孔21。
结合垫3上包被胶体金标记的2019-nCoV重组抗原和胶体金标记的鼠抗人HCG单克隆抗体；2019-nCoV重组抗原携带His-Tag；结合垫可以为胶体金垫。
沿层析方向在分析膜4上依次设有T2检测线41、T1检测线42及质控线43，T2检测线41处包被小鼠抗人IgG单克隆抗体，T1检测线42处包被小鼠抗人IgA单克隆抗体及小鼠抗人IgM单克隆抗体，质控线43处包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗体。分析膜4上的T2检测线41、T1检测线42及质控线43之间相互保持相对平行状态。分析膜4可以是硝酸纤维素膜。
该新型冠状病毒检测试纸条的制备方法如下：
步骤1、准备2019- nCoV重组抗原；
步骤2、制备结合垫3；其制备方法为：采用100ml的1/万氯金酸及1.8ml的1%柠檬酸三钠制备胶体金，然后将胶体金的pH值调节为8.3~8.7，每毫升胶体金中加入20μL的0.1M的碳酸钾溶液，然后分别将15μg/mL的鼠抗人HCG单克隆抗体及15μg/mL的2019-nCoV重组抗原与胶体金结合，得到胶体金标记的2019-nCoV重组抗原及胶体金标记的鼠抗人HCG单克隆抗体，最后分别采用胶体金标记的2019-nCoV重组抗原及胶体金标记的鼠抗人HCG单克隆抗体包被结合垫3，即得。
步骤3，制备分析膜4；其制备方法为：在在硝酸纤维素膜上采用0.1uL/mm的喷点量喷涂1-3mg/ml的小鼠抗人IgG单克隆抗体制备T2检测线41，在硝酸纤维素膜上采用0.1uL/mm的喷点量喷涂0.1-0.3mg/ml的小鼠抗人IgA单克隆抗体及0.3-0.6mg/ml的小鼠抗人IgM单克隆抗体制备T1检测线42，在硝酸纤维素膜上采用0.1uL/mm的喷点量喷涂2.0mg/mL山羊抗小鼠IgG多克隆抗体制备质控线43。
步骤4，试剂条的组装：在PVC底板1上沿层析方向依次铺设样品垫2、结合垫3、分析膜4及吸水滤纸5，并且样品垫2部分搭接在结合垫3上，结合垫3部分搭接在分析膜4的一侧，吸水滤纸5部分搭接在分析膜4的另一侧，即得。
本实施例中，2019-nCoV重组抗原购自厦门万泰沧海生物技术有限公司；小鼠抗人IgM单克隆抗体购自北京万域美澜科技有限公司，为无色透明液体；小鼠抗人IgA单克隆抗体购自北京万域美澜科技有限公司，为无色透明液体；小鼠抗人IgG单克隆抗体购自北京万域美澜科技有限公司，为无色透明液体；山羊抗小鼠IgG多克隆抗体购自北京万域美澜科技有限公司，为无色透明液体；鼠抗人HCG单克隆抗体购自北京万域美澜科技有限公司，为无色透明液体。
硝酸纤维素膜购自赛多利斯公司，外感为白色、质地均匀、膜表面平整无瑕疵、膜边缘整齐无扭曲变形，液体移行速度为135S±35S/4cm,爬上过程中无倾斜、无润湿现象。
金标垫购自上海金标生物科技有限公司，其纤维结构分布均匀、致密、平直、周围边缘无脏痕、污垢、灰尘，吸水性为63.1mg/cm2 ±2mg/cm2 。
本实施例制备的新型冠状病毒检测试纸条宽度范围为3.4～4.0 mm，液体移行速度应不低于10mm/min。
实施例2 新型冠状病毒检测试纸条的使用方法
步骤a、将新型冠状病毒检测试纸条、样本稀释液和样本恢复至18～30℃；样本稀释液为磷酸盐缓冲液，样本为血清、血浆或全血。
步骤b、取10µL血清、血浆或20µL全血样本直接加入到加样孔中；
步骤c、像加样孔中加入100µL样本稀释液；
步骤d、15~20min内判读结果，20分钟后检验结果无效。
检验结果的解释如下：
1、T1检测线阳性：检测窗T1检测线和质控线显色，则表明该样本检测出新型冠状病毒IgM抗体和/或新型冠状病毒IgA抗体，可能处于早期感染或现症感染，可以结合临床症状进行最终的确认以提高准确率。
2、T2检测线阳性：检测窗T2检测线和质控线显色，则表明该样本检测出新型冠状病毒IgG抗体，可能处于现症感染或既往感染，可以结合临床症状进行最终的确认以提高准确率。
3、阴性：检测窗仅质控线显色，则表明该样本未检测出新型冠状病毒IgM抗体或IgA抗体或IgG抗体。
4、无效：检测窗质控线未显色，则表明该新型冠状病毒检测试纸条无效，该样本检测结果亦无效。
在实际应用中，可以将新型冠状病毒检测试纸条与样本稀释液共同组成新型冠状病毒检测试剂盒用于新型冠状病毒抗体检测。
实施例3 新型冠状病毒检测试纸条的验证
1、试纸条性能评估试验
临床评估30例新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者血清样本，分别采用本发明的新型冠状病毒检测试纸条检测新型冠状病毒（2019-nCoV）IgA、IgM和IgG抗体，获得如下表1结果：
Figure 897213DEST_PATH_IMAGE001
由表1可以看出，IgA和IgM的阳性结果不完全重合，IgA和IgM共检出阳性数15例，IgA抗体阳性数11例，IgM抗体阳性数12例，IgA抗体阳性且IgM抗体阴性数3例，IgM抗体阳性且IgA抗体阴性数4例, IgA抗体阳性且IgM抗体和IgG抗体阴性数1例。
2019-nCoV IgA抗体检测可提高2019-nCoV早期抗体的检出率；并且2019-nCoVIgA抗体检测可提高患者总检出率。
2、试纸条灵敏度试验
采用本发明的新型冠状病毒检测试纸条临床评估112份新型冠状病毒患者血清样本，按照取样时间分组A组为46例发病1-7天内样本，B组为7-14天内样本，对于A组的检测结果如表2所示，对于B组的检测结果如表3所示.
表2.A组:46例临床确诊新型冠状病毒（COVID-19）患者1-7天检测结果
　项目 T1检出比例 T2检出比例 阳性检测检出率
检出率 80.4% 41.3% 89.1%
由表2可以看出，发病1-7天的新型冠状病毒肺炎患者血清样本中检测T1阳性检出率为80.4%，T2阳性检出率为41.3%，综合新型冠状病毒阳性患者总检出比例为89.1%。
表3 . B组:66例临床确诊新型冠状病毒（COVID-19）患者7-14天检测结果
Figure 407829DEST_PATH_IMAGE002
由表3可以看出，发病7-14天患者血清样本中检测T1阳性检出率84.8%，T2阳性检出率63.6%，综合新型冠状病毒阳性患者总检出比例占95.5%。
由表2和表3结果综合可得，患者发病7天内抗体检出比例为89.1%，7天后抗体检出比例上升为97%。对于临床表现符合新型冠状病毒感染的初诊患者，通过对A和B组中IgA、IgM和IgG抗体检测结果综合统计之后，112例患者总检出率为93.7%。因此，本发明新型冠状病毒检测试纸条的灵敏度为93.7%。
3、试纸条特异性试验
通过采用本发明的新型冠状病毒检测试纸条对随机人群进行筛查以测试该试纸条的特异性，共计检测200例正常人血清标本，检测结果如表4所示。
表4
项目 T1检测阳性率 T2检测阳性率 正常人群总阳性率
检出率 2% 3.5% 5.5%
由表4可以看出，采用本发明试纸条对200例正常人血清标本进行检测后，T1检测阳性率为2%，T2检测阳性率为3.5%，未出现T1和T2同阳性标本；即正常人群总检出比例为5.5%，则本发明新型冠状病毒检测试纸条的特异性为94.5%。
同时，采用肺炎支原体抗体阳性血清、甲型/乙型流感抗体阳性血清肺炎链球菌抗体、梅毒螺旋体阳性抗体、丙型肝炎病毒阳性抗体对本发明的新型冠状病毒检测试纸条进行交叉干扰试验，以验证该试纸条的特异性，结果分别如下表所示。
表5 肺炎支原体抗体阳性患者血清特异性验证
Figure 656408DEST_PATH_IMAGE003
由表5可以看出，检测20例肺炎支原体感染患者血清标本，出现COVID-19试剂检测T2阳性结果1例，检出率为5%，出现比例小于随机人群检测中T2阳性检出率的5.5%，可以判定此阳性结果为临床自然出现比例，非因肺炎支原体抗体对新型冠状病毒抗体检测试剂产生的直接干扰。
表6 甲型/乙型流感病毒抗体阳性特异性验证
Figure 36022DEST_PATH_IMAGE004
由表6结果可以看出，检测共计20例甲型/乙型流感病毒抗体阳性标本，COVID-19试剂均为阴性。即甲型/乙型流感病毒抗体未对新型冠状病毒抗体检测试剂产生特异性干扰。
表7 肺炎链球菌抗体阳性标本特异性验证
Figure 319236DEST_PATH_IMAGE005
由表7结果可以看出，检测共计10例肺炎链球菌抗体阳性标本，COVID-19试剂均为阴性。即肺炎链球菌抗体未对新型冠状病毒抗体检测试剂产生特异性干扰。
表8 梅毒螺旋体抗体阳性标本特异性验证
Figure 938436DEST_PATH_IMAGE006
由表8结果可以看出，检测共计10例梅毒螺旋体抗体阳性标本，COVID-19试剂均为阴性。即梅毒螺旋体抗体未对新型冠状病毒抗体检测试剂产生特异性干扰。
表9 丙型肝炎病毒抗体阳性标本特异性验证
Figure 798945DEST_PATH_IMAGE007
由表9结果可以看出，检测共计10例丙型肝炎抗体阳性标本，COVID-19试剂均为阴性。即丙型肝炎病毒抗体未对新型冠状病毒抗体检测试剂产生特异性干扰。
因此，由表5~表9可以看出，肺炎支原体抗体阳性血清、甲型/乙型流感抗体阳性血清肺炎链球菌抗体、梅毒螺旋体阳性抗体、丙型肝炎病毒阳性抗体对本发明的新型冠状病毒检测试纸条均无交叉干扰，该试纸条特异性强。
3、试纸条最低检出限试验
检测系列稀释的新型冠状病毒(COVID-19)T1检出限参考品和新型冠状病毒(COVID-19)T2检出限参考品最低检出限企业参考品各4份，1:2、1:4、1:8、1:16，最低检出限不低于1:8。
4、试纸条精密度试验
4.1批内精密度
取同一批次的试剂盒，检测新型冠状病毒(COVID-19)抗体精密度企业参考品CV1和CV2，各重复检测10次，检测结果均为阳性，显色度均一。
4.2 批间精密度
取三个批次的试剂盒，分别检测新型冠状病毒(COVID-19)抗体精密度企业参考品，各重复检测10次，检测结果均为阳性，且显色度均一。
本发明的新型冠状病毒检测试纸条同时测定患者血清中IgA抗体、IgM抗体及IgG抗体的阳性情况，能够更准确的检测出患者体内早期抗体水平情况，辅助判断患者所处于新型冠状病毒感染的不同时期，提高了新型冠状病毒检测的灵敏度和特异性。并且该新型冠状病毒检测试纸条为单通道三线试剂，操作更为简单方便。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围（包括权利要求）被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本说明书一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本说明书一个或多个实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本说明书一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，包括结合垫和分析膜，所述结合垫上包被发光物质标记的2019-nCoV重组抗原和鼠抗人HCG单克隆抗体；沿层析方向在所述分析膜上依次设有T2检测线、T1检测线及质控线，所述T2检测线处包被小鼠抗人IgG单克隆抗体，所述T1检测线处包被小鼠抗人IgA单克隆抗体及小鼠抗人IgM单克隆抗体，所述质控线处包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，所述T2检测线、所述T1检测线及所述质控线之间相互保持相对平行状态。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，所述2019-nCoV重组抗原携带His-Tag。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，所述发光物质为胶体金，所述结合垫为胶体金垫，所述分析膜为硝酸纤维素膜。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，所述检测试纸条还包括PVC底板、样品垫和吸水滤纸，沿层析方向在所述PVC底板上依次铺设有样品垫、结合垫、分析膜及吸水滤纸，所述样品垫部分搭接在所述结合垫上，所述结合垫部分搭接在所述分析膜的一侧，所述吸水滤纸部分搭接在所述分析膜的另一侧；所述样品垫上设有加样孔。
6.一种如权利要求1~5任一项所述的新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）准备2019-nCoV重组抗原；
（2）制备结合垫：制备胶体金，通过调节胶体金的pH值将胶体金分别与2019-nCoV重组抗原及鼠抗人HCG单克隆抗体结合得胶体金标记的2019-nCoV重组抗原及胶体金标记的鼠抗人HCG单克隆抗体，然后分别采用胶体金标记的2019-nCoV重组抗原及胶体金标记的鼠抗人HCG单克隆抗体包被结合垫；
（3）制备分析膜：在硝酸纤维素膜上采用0.1uL/mm的喷点量喷涂小鼠抗人IgG单克隆抗体制备T2检测线，在硝酸纤维素膜上采用0.1uL/mm的喷点量喷涂小鼠抗人IgA单克隆抗体及小鼠抗人IgM单克隆抗体制备T1检测线，在硝酸纤维素膜上采用0.1uL/mm的喷点量喷涂山羊抗小鼠IgG多克隆抗体制备质控线；
（4）试剂条的组装：在PVC底板上沿层析方法依次铺设样品垫、结合垫、分析膜及吸水滤纸，并且样品垫部分搭接在结合垫上，结合垫部分搭接在分析膜的一侧，吸水滤纸部分搭接在分析膜的另一侧，得试剂条。
7.根据权利要求6所述的新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，采用100ml1/万氯金酸及1.8ml1%柠檬酸三钠制备胶体金；胶体金分别与2019-nCoV重组抗原及鼠抗人HCG单克隆抗体结合的条件为：每毫升胶体金中加入20μL的0.1M的碳酸钾溶液，将胶体金的pH值调节为8.3~8.7，然后分别将15μg/mL的鼠抗人HCG单克隆抗体及15μg/mL的2019-nCoV重组抗原与胶体金结合。
8.根据权利要求6所述的新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，采用的小鼠抗人IgA单克隆抗体的浓度为0.1-0.3mg/ml，采用的小鼠抗人IgM单克隆抗体的浓度为0.3-0.6mg/ml，采用的小鼠抗人IgG单克隆抗体的浓度为1-3mg/ml，采用的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体的浓度为2.0mg/mL。
9.权利要求1~5任一项所述的新型冠状病毒检测试纸条在制备检测新型冠状病毒试剂中的应用。
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