CN111948388A - 一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条及其制备方法和应用，所述胶体金试纸条包括PVC底板，依次搭接固定于PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述结合垫是结合有胶体金颗粒标记抗腐败梭菌抗原的多克隆抗体的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被腐败梭菌抗体，所述质控线包被羊抗兔IgG抗体。采用该胶体金试纸条能够实现腐败梭菌的即时检测，检测时间缩短至5‑10分钟，且不需要大型仪器设备以及复杂的实验步骤。可通过对比反应前后体系的胶体金试纸条的颜色变化对腐败梭菌进行定性识别，结果易判断，适用性强，非常适合于基层养殖场中羊快疫等腐败梭菌引起的相关疾病的检测。

Description

一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及腐败梭菌检测技术领域，具体涉及一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条及其制备方法和应用。

背景技术

腐败梭菌感染人和家畜引起恶性水肿，因此曾被称为恶性水肿病。并且该菌常以芽孢体形式散布于自然界中，易被免疫力低的家禽(如鸡)、家畜(羊、鹿等)动物感染，可引起传染性法氏囊病、腺病毒感染、呼肠孤病毒感染及鸡贫血,对于家畜可引起羊快疫等疾病。腐败梭菌引起的畜禽疾病不仅发病率高，而且病程短促，死亡率高，是严重危害养殖业的重要疾病，给各国畜牧业发展带来巨大经济损失。快速、准确、简便的检测出腐败梭菌，对人类健康和畜牧业生产具有重要意义。

目前，已有的腐败梭菌检测方法主要包括传统分离鉴定法、以聚合酶链反应(PCR)分析为主的分子生物学诊断方法。虽然已有的检测方法结合使用可以检测腐败梭菌，但具有耗时长，需要专业知识和设备等局限性，且多在动物已经发病或者死亡的状态下进行诊断，无法对疑似病例进行有效诊治，均不适合现场快速检测。而对于牧区和部分养殖场而言，往往缺乏专业技术人员和专业仪器设备，且送检过程需要时间和样品保存方法，因此需要一种更加高效的方法应用于实际生产，从而便于操作，加速疾病的诊断，以便对其余未死亡病例做出紧急治疗措施。

胶体金免疫层析技术是将胶体金标记技术与免疫层析等技术进行结合的新型技术，这种技术具有胶体金试剂稳定，且储存方便、操作简单、检测所需时间短、所得结果容易判断等优点，能够被广泛应用于流行病学调查、动物医院、牧场家畜群和动物及其产品的检验检疫。但目前还未见有用于检测腐败梭菌的胶体金试纸条的相关报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条及其制备方法。采用该胶体金试纸条能够实现腐败梭菌的即时检测，检测时间缩短至5-10分钟，且不需要大型仪器设备以及复杂的实验步骤。可通过对比反应前后体系的胶体金试纸条的颜色变化对腐败梭菌进行定性识别，结果易判断，适用性强，非常适合于基层养殖场中羊快疫等腐败梭菌引起的相关疾病的检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括PVC底板，依次搭接固定于PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；

所述结合垫是结合有胶体金颗粒标记腐败梭菌抗体的玻璃纤维膜；

所述硝酸纤维素膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被腐败梭菌抗体，所述质控线包被羊抗兔IgG抗体。

优选的，所述样品垫上设有样品孔。

优选的，所述硝酸纤维素膜为赛多利斯CN140。

优选的，所述检测线包被腐败梭菌抗体的浓度为1.5mg/ml，所述质控线包被羊抗兔IgG抗体的浓度为1mg/ml。

本发明的第二方面，提供上述胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)调节胶体金溶液的pH为8.0，向胶体金溶液中加入腐败梭菌抗体，在室温下搅拌20-40min，制得胶体金-抗体结合物溶液；向胶体金-抗体结合物溶液中加入牛血清蛋白(BSA)或聚乙二醇，室温搅拌5-15min，离心，弃去上清，沉淀溶于胶体金-抗体保存液中，过滤，得到胶体金-抗体结合物原液；

(2)将步骤(1)制备的胶体金-抗体结合物原液稀释后涂在玻璃纤维膜上，干燥，得到结合垫；

(3)将腐败梭菌抗体稀释为1.5mg/ml，羊抗兔IgG抗体稀释为1mg/ml，并分别在硝酸纤维素膜上点膜，形成含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；

(4)在PVC底板上依次搭接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，即制备得到胶体金试纸条。

优选的，步骤(1)中，所述胶体金溶液中的胶体金的粒径为40-60nm。

优选的，步骤(1)中，离心转速为9000-11000r/min离心时间40-60min。

优选的，步骤(1)中，所述胶体金-抗体保存液为添加有0.5％(质量分数)BSA的PBS。

优选的，步骤(1)和步骤(3)中，所述腐败梭菌抗体由如下步骤制备而成：

以甲醛灭活后的腐败梭菌菌体蛋白作为抗原，将抗原与弗氏佐剂混合后，通过皮下注射的方式免疫兔，取四免后的血清，采用亲和层析柱进行亲和纯化，制成多克隆抗体，作为腐败梭菌抗体。

优选的，步骤(3)中，稀释后的腐败梭菌抗体和羊抗兔IgG抗体均以1μl/cm的剂量进行点膜。

本发明的有益效果：

本发明的胶体金试纸条能够实现腐败梭菌的即时检测，检测时间缩短至5-10分钟，且不需要大型仪器设备以及复杂的实验步骤。可通过对比反应前后体系的胶体金试纸条的颜色变化对腐败梭菌进行定性识别；适用于腐败梭菌的现场检测，尤其适用于基层单位或个人的现场快速检测。

附图说明

图1：本发明的检测腐败梭菌的胶体金试纸条的结构示意图；其中，1-PVC底板，2-样品垫，3-结合垫，4-硝酸纤维素膜，5-吸水纸，6-检测线(T线)，7-质控线(C线)。

图2：本发明的胶体金试纸条的灵敏性检测结果图；图中，“原”表示菌量为4.7×10⁸CFU/mL的腐败梭菌菌液，“10^-1”表示腐败梭菌菌液的10倍稀释液，“10^-2”表示腐败梭菌菌液的100倍稀释液，“10^-3”表示腐败梭菌菌液的1000倍稀释液。

图3：本发明的胶体金试纸条的特异性检测结果图；图中，“原”表示腐败梭菌，“诺维氏”表示诺维氏梭菌，“大肠”表示大肠杆菌，“沙门”表示沙门氏菌，“产气”表示产气荚膜梭菌，“阴”表示PBS阴性对照。

图4：豚鼠临床样本的检测结果；由上到下、由左到右依次为肠、肝脏、后腿肌肉、腹水、胶冻物和阴性对照。

图5：羊临床样本的检测结果；共有12个阳性样本和1个阴性样本。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，对于腐败梭菌的检测方法而言，分子生物学检测具有检测特异性好、检测灵敏度高等优点，但是耗时长，需要特殊的仪器设备，不适合基层检测；血清学检测方法较分子生物学检测耗时较短，操作较为简便，但存在较大的非特异性而容易存在假阳性问题；所以亟需建立快速、敏感、特异并能用于腐败梭菌基层养殖场直接检验的方法。基于此，本发明的目的是提供一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条。

胶体金试纸条是利用免疫胶体金技术开发的检测产品，该技术是以胶体金为信号标志，根据抗体可和对应的抗原发生特异而敏感的结合反应，于硝酸纤维素膜载体上短时间内呈现具有明确信号标志的快速检测技术。与ELISA法相较，相同点为特异性和敏感性都较强，比之更胜一筹的是操作上具有简便快速的特点，而且无需任何复杂仪器设备，结果可肉眼观察，极易判断。

目前虽有许多关于检测不同细菌或病毒的胶体金试纸条的产品或报道，但是，用于检测腐败梭菌的胶体金试纸条却一直未见有报道。分析原因可能为：(1)腐败梭菌増菌培养困难，不易进行研究考察，其技术成熟度比较低；(2)腐败梭菌抗体难以获得，腐败梭菌能够产生α毒素、β毒素、γ毒素和δ毒素四种外毒素，这四种毒素是独立的实体，目前仅有关于腐败梭菌α毒素单抗、多抗制备的报道，但仅通过腐败梭菌α毒素抗体无法全面准确的对腐败梭菌抗原进行识别。

本发明首次开发设计了一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条，在本发明的一种实施方案中，给出的检测腐败梭菌的胶体金试纸条，其结构包括：

PVC底板，依次搭接固定于PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；

所述结合垫是结合有胶体金颗粒标记腐败梭菌抗体的玻璃纤维膜；

所述硝酸纤维素膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被腐败梭菌抗体，所述质控线包被羊抗兔IgG抗体。

所述样品垫上设有样品孔。

在本发明的另一种实施方案中，给出了上述胶体金试纸条的制备方法，具体如下：

(1)调节胶体金溶液的pH为8.0，向胶体金溶液中加入腐败梭菌抗体，在室温下搅拌20-40min，制得胶体金-抗体结合物溶液；向胶体金-抗体结合物溶液中加入牛血清蛋白(BSA)或聚乙二醇，室温搅拌5-15min，离心，弃去上清，沉淀溶于胶体金-抗体保存液中，过滤，得到胶体金-抗体结合物原液；

(2)将步骤(1)制备的胶体金-抗体结合物原液稀释后涂在玻璃纤维膜上，干燥，得到结合垫；

(3)将腐败梭菌抗体稀释为1.5mg/ml，羊抗兔IgG抗体稀释为1mg/ml，并分别在硝酸纤维素膜上点膜，形成含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；

(4)在PVC底板上依次搭接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，即制备得到胶体金试纸条。

在检测腐败梭菌的胶体金试纸条的制备过程中，影响试纸条质量的因素有很多，其中，腐败梭菌抗体的制备是关键，在前期研究的基础上，本发明先对腐败梭菌进行増菌培养，然后以甲醛灭活后的腐败梭菌菌体蛋白作为抗原，将抗原与弗氏佐剂混合后，通过皮下注射的方式免疫日本大耳白兔，取四免后的血清，采用亲和层析柱进行亲和纯化，制成多克隆抗体，作为腐败梭菌抗体。

采用本发明方法制备的腐败梭菌抗体的浓度达10mg/ml，抗体效价达1:1024000。采用本发明的腐败梭菌抗体制备胶体金试纸条，能够与腐败梭菌抗原进行全面、准确的识别，特异性强。

除此之外，胶体金颗粒的大小、硝酸纤维素膜种类的选择等因素也影响制备的胶体金试纸条的质量。胶体金颗粒太小不足以产生明显的颜色信号，会导致目测效果较差；若颗粒较大，又可能出现空间位阻的问题，将阻止小分子蛋白与金颗粒zeta电位接近。综合考虑颜色信号以及胶体金颗粒与腐败梭菌抗体的结合效果，本发明优选40-60nm的胶体金颗粒。

上述胶体金试纸条中，硝酸纤维素膜又称为NC膜，在胶体金试纸条中用作检测线和质控线的承载体，同时也是免疫反应的发生处，所以硝酸纤维素膜的种类对于检测结果的特异性、灵敏度、显色及背景颜色等方面均有显著的影响，为提升检测的特异性、灵敏度并便于观察，本发明对多种不同种类的硝酸纤维素膜进行了优化考察，结果发现，型号为赛多利斯CN140的NC膜与其他种类的硝酸纤维素膜相比，具有层析速度快、无背景显色、检测线显色深、无非特异性显色等优势，所以本发明选择赛多利斯CN140NC膜作为制备胶体金试纸条的硝酸纤维素膜。

本发明的胶体金试纸条的结果判定方法：

取100μL待检样品，滴加于加样孔中，若样品中包含腐败梭菌抗原，则抗原就会与金标垫上的金标抗体结合，到达检测线(T线)时，抗原就会被检测线上的腐败梭菌抗体捕获，从而显现出红色条带，剩余没有被结合的金标抗体继续层析至质控线(C线)，并与质控线上的羊抗兔IgG结合，显示出红色条带。所以，当检测线和质控线均显示红色条带，即为阳性。而当样品中不含有腐败梭菌时，检测线不显示红色，仅有质控线显示红色，此时即为阴性。质控线必须显色，否则说明该检测卡无效。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：检测腐败梭菌的胶体金试纸条的制备

如图1所示，一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条包括PVC底板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水纸5；

将所述硝酸纤维素膜4粘结在所述PVC底板1的中部；将结合垫3和吸水纸5分别粘贴在所述硝酸纤维素膜4的前、后两端，在所述样品垫2的正上方设有样品孔。

所述硝酸纤维素膜4上自靠近结合垫3端依次设有检测线6、质控线7，所述检测线6上包被有腐败梭菌多克隆抗体。所述质控线7上固载有羊抗兔IgG抗体。

所述样品垫2与结合垫3的前端搭接；所述结合垫3的后端与所述硝酸纤维素膜4的前端搭接；所述吸水纸5与硝酸纤维素膜4的后端搭接，所述搭接的覆盖部分宽度为1-2mm。

该检测腐败梭菌的胶体金试纸条的制备方法，包括步骤：

1)腐败梭菌抗体的制备：

甲醛灭活后的腐败梭菌菌体蛋白作为抗原，将抗原与弗氏佐剂混合后，通过皮下注射的方式免疫日本大耳白兔。取四免后的血清，采用亲和层析柱进行亲和纯化，制成多克隆抗体。

1-1)腐败梭菌抗原的获取：腐败梭菌用专利CN110055190A公开的腐败梭菌培养基37℃震荡培养24h后，向培养后的菌液中加入甲醛，使甲醛的终浓度为0.4％，37℃震荡48h，取出后8000rpm离心20min，弃去上清，将沉淀用100mL PBS充分旋起，重复离心，去除外毒素成分，将最终得到的沉淀溶解于30mL PBS中，把得到的菌体超声破碎，得到破碎产物从而获得灭活后的抗原，抗原通过SDS-PAGE质控分析鉴定合格，即制备得到腐败梭菌抗原。

1-2)多克隆抗体的制备及检测：将上述抗原通过皮下注射的方式免疫日本大耳白兔。免疫过程分四个阶段。一免将抗原与弗氏完全佐剂混合，每只兔抗原含量约500mg，反应时间为2-3周；二免将抗原与弗氏不完全佐剂混合，每只兔抗原含量约300mg，反应时间为2周；三免将抗原与弗氏不完全佐剂混合，每只兔抗原含量约300mg，反应时间为2周；四免将抗原与弗氏不完全佐剂混合，皮下注射上述两只日本大耳白兔子，每只抗原含量约300mg，反应时间为1周。取四免后的血清，经间接ELISA检测抗血清中腐败梭菌抗体效价为1:1024000，可用于胶体金试纸条的制备。采用亲和层析柱进行抗体亲和纯化，通过SDS-PAGE质控分析纯化后抗体浓度为10mg/mL，结果显示制成的多克隆抗体灵敏度良好。以上述制备的多克隆抗体作为腐败梭菌抗体。

2)胶体金标记抗体的制备：

2-1)胶体金溶液的制备：按柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。将98mL双蒸水加热至65℃，磁力搅拌下准确加入新鲜制备的质量分数为1％的氯金酸水溶液1mL，继续加热至95℃，迅速加入质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液1mL，不断搅拌煮沸15min，待溶液颜色由黑—紫变浅酒红色时，停止加热，冷却至室温，获得胶体金溶液。

2-2)胶体金标记的最适pH确定：用0.2mol/L碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH，通过胶体金梯度法确定抗体与胶体金结合的最适pH值为8.0。

2-3)抗体最适标记量的确定：采用蛋白梯度法确定腐败梭菌抗体稳定1ml胶体金所需的最小抗体量为10μg/ml，实际胶体金探针制备工作中，加入的抗体量往往为最小蛋白量的120％-130％所以最终抗体浓度约为12μg/ml-13μg/ml。

2-4)胶体金-抗体结合物原液的制备和纯化：将最适pH胶体金溶液20ml加入腐败梭菌抗体中，使抗体浓度为12μg/ml-13μg/ml，并在室温下搅拌30min，制得胶体金-抗体结合物溶液；将10％BSA 2ml加入制得的胶体金-抗体结合物溶液中(终浓度0.4％)，室温搅拌10min，或者加入10％聚乙二醇(MW20000)0.2ml，室温搅拌10min，9000-11000r/min离心40-60min，弃去上清，沉淀溶于2ml胶体金-抗体保存液(PBS+0.5％BSA)中，用0.45μm滤膜过滤，所得即为胶体金-抗体结合物原液。在1ml胶体金-抗体结合物原液中加入10％NaCl水溶液1ml后，溶液仍为无沉淀的紫红色液体，说明制得的胶体金-抗体结合物原液具有良好的稳定性。

2-5)胶体金-抗体结合物原液工作浓度的确定：该原液经二倍倍比稀释试验测试，结果显示当胶体金-抗体结合物原液的工作浓度为1:4时，检测效果最佳。

3)结合垫的制备：

用工作液(工作液为100ml体系：Tris-HCl 1.2114g，Triton X-100 1ml，氯化钠0.5884g，2g蔗糖，0.02％叠氮钠，溶于100ml超纯水中，调pH8.0)将胶体金-抗体结合物原液按体积比1:4进行稀释，取1.4ml胶体金-抗体结合物稀释液，均匀地加在玻璃纤维膜上，置37℃烤干，制成结合垫。

4)设置检测线和对照线的硝酸纤维素膜的制备：

4-1)NC膜型号的选择：通过跑板功能测试、层析性能测试和重新选择试验，综合评定后，NC膜型号为赛多利斯CN140。

4-2)检测线(T线)及质控线(C线)条件的建立和优化：将NC膜上T线及C线的包被抗体设置如下几个浓度梯度：1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml，选择显色效果最优的一组作为腐败梭菌抗体使用浓度(T线)和羊抗兔IgG抗体使用浓度(C线)。结果表明，检测显色效果最优的一组浓度：腐败梭菌抗体(T线上)工作浓度为1.5mg/ml，羊抗兔IgG抗体(C线上)工作浓度为1mg/ml。

4-3)T线及C线的点膜：用0.01mol/L pH8.0的PBS将腐败梭菌抗体和羊抗兔IgG抗体分别稀释至所需浓度，用划膜机在NC膜上点膜。T线与C线的距离为0.5cm，参数均为1ul/cm，喷好的NC膜置37-45℃烤干干燥8h以上。

5)胶体金试纸条组装：

将PVC底板切成宽2.8mm×长6cm的条；在PVC底板中间粘设置检测线和质控线的硝酸纤维素膜，距离上段1.5cm；在PVC底板下端(即靠近NC膜的T线端)粘贴结合垫，并与硝酸纤维素膜重叠0.1cm，然后在下端粘贴1.7cm宽的样品垫(玻璃纤维膜)，样品垫与结合垫重叠0.1-0.2cm；在PVC底板上端(即靠近NC膜的C线端)粘贴1.7cm宽的吸水纸，并与硝酸纤维素膜重叠0.1-0.2cm；切成2.8mm宽的检测卡。

实施例2：检测腐败梭菌的胶体金试纸条的灵敏性检测

腐败梭菌用专利CN110055190A公开的腐败梭菌培养基在37℃条件下增菌24h。测得其OD值为2.247，菌量为4.7×10⁸CFU/mL。然后用PBS缓冲液进行梯度稀释，并用PBS做阴性对照。分别向实施例1制备的胶体金试纸条的加样孔中滴加约100μL的原菌液、10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液和PBS阴性对照，室温下反应10min后观察结果。检测结果如图2所示，PBS、1000倍稀释液为阴性，原菌液、10倍稀释液、100倍稀释液均为阳性，检测灵敏性至4.7×10⁶CFU/mL为阳性。说明该是纸条具有较高的灵敏性。

实施例3：检测腐败梭菌的胶体金试纸条的特异性检测

为了考察实施例1制备的胶体金试纸条的特异性，采用浓度相同的腐败梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌、诺维氏梭菌、产气荚膜梭菌菌液，并用PBS作阴性对照，按实施例2所述的方法进行检测，结果如图3所示，除腐败梭菌为阳性外，其余样品均为阴性。说明该试纸条特异性好。

实施例4：临床样品的检测

对实验室保存的感染腐败梭菌的豚鼠组织样品和采集于青海牧区羊快疫发病羊群的羊血清样品采用实施例1制备的胶体金试纸条按实施例2所述的方法进行腐败梭菌检测。图4依次为豚鼠肠、肝脏、后腿肌肉、腹水、胶冻物和阴性样本的检测结果，除胶冻物和阴性样本外，其他组织均呈阳性。图5为13个羊血清样品，12个阳性样本检测结果显示均为阳性，一个阴性样本检测为阴性，检测符合率100％。说明该试纸条临床检测效果良好。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金试纸条包括PVC底板，依次搭接固定于PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；

所述结合垫是结合有胶体金颗粒标记腐败梭菌抗体的玻璃纤维膜；

所述硝酸纤维素膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被腐败梭菌抗体，所述质控线包被羊抗兔IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述样品垫上设有样品孔。

3.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜为赛多利斯CN140。

4.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测线包被腐败梭菌抗体的浓度为1.5mg/ml，所述质控线包被羊抗兔IgG抗体的浓度为1mg/ml。

5.权利要求1-4任一项所述的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)调节胶体金溶液的pH为8.0，向胶体金溶液中加入腐败梭菌抗体，在室温下搅拌20-40min，制得胶体金-抗体结合物溶液；向胶体金-抗体结合物溶液中加入牛血清蛋白或聚乙二醇，室温搅拌5-15min，离心，弃去上清，沉淀溶于胶体金-抗体保存液中，过滤，得到胶体金-抗体结合物原液；

(2)将步骤(1)制备的胶体金-抗体结合物原液稀释后涂在玻璃纤维膜上，干燥，得到结合垫；

(3)将腐败梭菌抗体稀释为1.5mg/ml，羊抗兔IgG抗体稀释为1mg/ml，并分别在硝酸纤维素膜上点膜，形成含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；

(4)在PVC底板上依次搭接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，即制备得到胶体金试纸条。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述胶体金溶液中的胶体金的颗粒平均直径为40-60nm。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，离心转速为9000-11000r/min离心时间40-60min。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述胶体金-抗体保存液为添加有0.5％BSA的PBS。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(3)中，所述腐败梭菌抗体由如下步骤制备而成：

以甲醛灭活后的腐败梭菌菌体蛋白作为抗原，将抗原与弗氏佐剂混合后，通过皮下注射的方式免疫兔，取四免后的血清，采用亲和层析柱进行亲和纯化，制成多克隆抗体，作为腐败梭菌抗体。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，稀释后的腐败梭菌抗体和羊抗兔IgG抗体均以1μl/cm的剂量进行点膜。

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