CN101887061A - 一种用于检测大肠杆菌f5菌毛的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，它涉及一种检测大肠杆菌菌毛的试纸条及其制备方法。本发明提供了一种用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。试纸条由PVC背衬、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。方法：制免疫原；抗F5菌毛多克隆抗体和羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上；制抗F5菌毛单克隆抗体；抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫上；五、在PVC背衬上依次连续粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，切成试纸条即完成。本发明试纸条具有良好的特异性、稳定性和敏感性，可以用来对产肠毒素大肠杆菌F5菌毛进行鉴定，具有检测结果直观，便于保存。

Description

一种用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测大肠杆菌菌毛的试纸条及其制备方法。

背景技术

统计表明我国由大肠杆菌引起的动物腹泻的发病率和死亡率分别占整个腹泻发病率和死亡率的56.2%和24.7%，给养猪业生产造成了巨大经济损失。产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪腹泻的重要病原之一，但其他的病原，如猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒等也均能引起仔猪严重的腹泻，因此，灵敏、准确地鉴定病原是诊断和防治猪腹泻病的重要前提。

大肠杆菌菌毛抗原在ETEC引起的腹泻上起着先导和加剧的作用，F5（K99）阳性菌在引起仔猪腹泻的ETEC中最为常见，目前检测该菌的方法有凝集试验、ELISA、核酸检测、小肠上皮细胞粘附试验，以及MRHA和在此基础上的血凝抑制反应（HI）。传统F5⁺ETEC分离鉴定方法特异性强，但费时费力，不适应临床检测的需要；凝集试验操作简便，快捷适于现场检测，但单因子血清不易购买，且反复使用易被污染；小肠上皮细胞粘附试验需要的小肠片段不易获得和保存；MRHA和HI用于凝集的红细胞不宜长期保存；核酸检测和ELISA方法灵敏度高，但因使用特定仪器局只限于实验室操作，难以推广。因此，急需建立一种特异、准确、操作简便、适合现地应用的F5菌毛检测方法。

发明内容

本发明目的是提供一种用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。

用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条，由PVC背衬、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成，在PVC背衬上依次连续粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫与所述硝酸纤维素膜之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫之间有搭接；所述结合垫上包被有抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上分别包被有抗F5菌毛多克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。

用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的制备方法按以下步骤实现：一、诱导原核表达F5菌毛蛋白，纯化该融合蛋白，即免疫原；二、制备抗F5菌毛多克隆抗体，然后包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，再将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上构成质控线；三、制备抗F5菌毛单克隆抗体；四、采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，然后将抗F5菌毛单克隆抗体加入胶体金溶液中，制得抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物，然后包被在结合垫上；五、在PVC背衬上依次连续粘附样品垫、步骤四所得结合垫、步骤二所得硝酸纤维素膜和吸水垫，然后切成6mm×3mm宽的试纸条，即完成用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的制备。

本发明用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条，选用抗F5菌毛多克隆抗体作为检测线，抗F5菌毛单克隆抗体为胶体金标记的抗体，利用夹心法来检测待测样品中是否含有F5菌毛。本发明用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条具有良好的特异性、稳定性和敏感性，可以用来对产肠毒素大肠杆菌F5菌毛进行鉴定，具有检测结果直观，便于保存，单次使用成本较低等优点，适合于临床诊断和基层推广应用。

本发明的原理：若待检液中含F5菌毛，当待测液进入样品垫时，由于毛细效应向前移动，F5菌毛与结合垫上的抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物(简称为免疫金)形成Au-Ab-F5菌毛二联复合物，复合物在硝酸纤维素膜上继续层析泳动，与检测线上的抗F5菌毛多克隆抗体结合形成McAb-F5菌毛-Au-Ab三联复合物，并被固定在检测线的抗F5菌毛多克隆抗体截留下来，形成可见的红色条带；未结合的Au-Ab-F5菌毛复合物由于层析作用，继续迁移向前，与固定在质控线上的羊抗鼠IgG结合而被截留下来，形成可见的红色条带，即阳性结果是在检测线和质控线上均呈现红色条带；

若待测液不含F5菌毛，固定于结合垫上的免疫金因毛细效应随待测液体向前移动，不能与检测线上的抗F5菌毛多克隆抗体结合，只与固定在质控线上的羊抗鼠IgG结合形成二联复合物被截留下来，形成可见的红色条带，即阴性结果只在质控线上形成红色条带；如果质控线上没有红色条带出现，则该试纸条无效。

本发明的优势在于：

1、制备了抗大肠杆菌F5菌毛的抗体（单克隆抗体和多克隆抗体）：本发明诱导原核表达的大肠杆菌F5菌毛蛋白纯化后作为免疫原，制备的抗体与天然大肠杆菌F5菌毛有很好的结合能力且特异性良好、抗体效价较高，为试纸条的制备奠定了良好的基础；

2、试纸条组装材料的选择和各种缓冲溶液的配方：尽管胶体金试纸条检测方法在检测领域有着广泛的应用，但由于制备试纸条针对的抗体不同、实验条件的限制导致其他人制备试纸条所用的组装材料和缓冲溶液对本发明无参考价值；本发明结合理论用排列组合的方法对组装材料和缓冲溶液进行了大量的筛选，克服了实验过程中遇到的检测线出现假阳性、免疫金探针死金、免疫金探针层析过程中亲水分离、试纸条检测线和质控线颜色浅等问题，筛选出针对本发明特定抗体的组装材料和各种缓冲溶液。

附图说明

图1为具体实施方式一中用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的示意图，其中1为PVC背衬，2为样品垫，3为结合垫，4为硝酸纤维素膜，5为吸水垫，T为检测线，C为质控线。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：结合图1说明本实施方式，本实施方式用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条，由PVC背衬1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5组成，在PVC背衬1上依次连续粘附有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，所述结合垫3与所述硝酸纤维素膜4之间有搭接，所述硝酸纤维素膜4与所述吸水垫5之间有搭接；所述结合垫3上包被有抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜4上分别包被有抗F5菌毛多克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。

本实施方式中的PVC背衬1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5均购自上海金标生物科技有限公司。

本实施方式用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条，在使用时，对待测样品进行处理后将之滴入样品垫2上即可，样品垫2上可制作出加样孔。

具体实施方式二：本实施方式用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的制备方法按以下步骤实现：一、诱导原核表达F5菌毛蛋白，纯化该融合蛋白，即免疫原；二、制备抗F5菌毛多克隆抗体，然后包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，再将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜4上构成质控线；三、制备抗F5菌毛单克隆抗体；四、采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，然后将抗F5菌毛单克隆抗体加入胶体金溶液中，制得抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物，然后包被在结合垫3上；五、在PVC背衬1上依次连续粘附样品垫2、步骤四所得结合垫3、步骤二所得硝酸纤维素膜4和吸水垫5，然后切成6mm×3mm宽的试纸条，即完成用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的制备。

本实施方式步骤五中在PVC背衬1上依次连续粘附样品垫2、步骤四所得结合垫3、步骤二所得硝酸纤维素膜4和吸水垫5的具体过程是：将结合垫连接在靠近硝酸纤维素膜检测线的一端，边缘附着在硝酸纤维素膜上，样品垫附着在结合垫的另一端上；吸水垫连接在硝酸纤维素膜的另一端，与硝酸纤维素膜的质控线相接近。

本实施方式所得用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的应用评价：

1、特异性试验

将提纯的F5、F4、F6、F41、F18ab菌毛过滤除菌后稀释成0.5mg/ml进行检测，只有F5菌毛检出结果为阳性，而提纯的大肠杆菌F4、F6、F41、F18ab菌毛检测结果为阴性，说明试纸条具有良好的特异性；

2、敏感性检测

当试纸条检测菌毛蛋白浓度为1.492mg/ml、596.8μg/ml、238.7μg/ml、95.5μg/ml、38.2μg/ml时，试纸条的反应呈阳性，而检测菌毛蛋白浓度为15.2μg/ml和6.1μg/ml时，试纸条呈阴性反应，该试纸条最低检出量为38.2μg/ml；

3、稳定性检测

4℃条件下，保存的试纸条至120d时检测线和质控线仍很清晰；在室温条件下，保存的试纸条至90d时检测线和质控线仍很清晰；在37℃条件下，保存的试纸条至20d后检测线和质控线变得模糊；结果说明试纸条具有很好的稳定性；

4、重复性检测

取不同批次的试纸条检测不同批次F5菌毛蛋白，每个样品重复检测10次，结果显示批内、批间试纸条检测F5菌毛蛋白结果没有差别且检测线明显；结果显示试纸条具有良好的重复性。

本实施方式用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的使用方法：

1、样品的预处理

将待检样品（如：粪便、奶样等）在伊红美兰琼脂培养基上划线培养，分离单个菌落，挑取紫黑色孤立菌落接种到5ml改良明卡培养基内，振摇培养；将培养好的细菌用含2M尿素的0.01mol/L、pH值为7.2的PBS洗涤，离心后称取细菌细胞湿重，以0.1g/ml湿重菌量悬浮于0.01mol/L、pH值为7.2的PBS缓冲液中；采用60℃水浴振摇30min的方法提取菌毛，在4℃下以10000r/min离心15min，吸取上清液，并用0.22μm滤膜过滤后，得到待检液，备用；

2、检测

将待检液取50μL加入试纸条加样孔中，5～10min后观察结果；

3、结果判定

从待检液在硝酸纤维素膜4上层析算起，待结合垫完全释放，硝酸纤维素膜4上检测线T和质控线C显色清晰，到硝酸纤维素膜4上没有免疫金(抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物)扩散为止；检测线T和质控线C均为红色判定为阳性；检测线T不显色，质控线C为红色判定为阴性；质控线C不显色为试纸条失效。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤二中制备抗F5菌毛多克隆抗体的具体步骤：a、将免疫浓度为1mg/mL的免疫原，按体积比1:1加入弗氏完全佐剂混合乳化，然后在家兔背部多点皮下注射，注射量为0.2mL/只；b、两周后，改用弗氏不完全佐剂乳化免疫原，以同样方法进行第二次免疫，并且每隔三周加强免疫，每周进行耳缘静脉采血，用间接ELISA方法检测抗体效价，待效价达到6.4×10⁴后，心脏采血分离血清，然后用辛酸硫酸铵粗提结合ProteinG亲和层析进行纯化，获得抗F5菌毛多克隆抗体。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤三中制备抗F5菌毛单克隆抗体的具体步骤：a、将免疫浓度为1mg/mL的免疫原，按体积比1:1加入弗氏完全佐剂混合乳化，然后腹腔注射BALB/C小鼠，注射量为0.2mL/只；b、两周后，改用弗氏不完全佐剂乳化免疫原，以同样方法进行第二次免疫；c、两周后，断尾采血检测抗体效价，若ELISA效价达到2¹⁰以上，腹腔注射0.2ml免疫原加强免疫，三天后处死小鼠，取其脾脏，用于细胞融合，用间接酶联免疫吸附试验筛选阳性杂交瘤细胞，筛选获得一株稳定分泌抗F5菌毛蛋白基因的单克隆抗体，命名为F5-1，抗体亚类为IgG1，并为κ链抗体；d、采用分泌抗F5菌毛的单克隆抗体的杂交瘤细胞株以体内诱生腹水法制备抗体，用辛酸-硫酸铵粗提结合ProteinG亲和层析进行纯化，获得抗F5菌毛单克隆抗体。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤四中采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液的具体步骤：a、向250ml的三角瓶中加入50ml质量浓度为0.01%的氯金酸水溶液，搅拌加热至沸腾；b、向沸腾的溶液中加入500μl质量浓度为1%柠檬酸三钠水溶液，继续加热保持沸腾15min；c、关掉热源继续搅拌15min，冷却后用0.22μm滤膜过滤至去离子水恢复到原体积，即完成胶体金溶液制备。其它与具体实施方式一相同。

本实施方式中所得胶体金溶液为30nm胶体金溶液。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤四中制得抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物(简称为免疫金)的具体步骤：a、将pH值为7.2的胶体金溶液置于磁力搅拌器上，在5min内以结合量54μg/ml，逐滴将抗F5菌毛单克隆抗体加入胶体金溶液中，继续搅拌30min，加入体积浓度为5.0%的BSA至终浓度为1.0%，继续摇匀30min；b、利用低温高速离心法纯化免疫金：将免疫金于4℃下，1500r/min离心30min，吸取上清；然后在4℃下将上清以14000r/min的速度继续离心30min，吸出弃掉上清；用1/10原体积的0.01M、pH值为7.2的PB溶液将纯化好的胶体金沉淀重悬，置4℃避光保存；所述PB溶液中含有质量浓度为0.5%的BSA(牛血清白蛋白)和质量浓度为1%的海藻糖。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤四中抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫3上的具体步骤：将结合垫浸泡于质量浓度为5%的海藻糖中30min，置于37℃下烘干，然后用Biodot点膜仪将制备好的抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫上，再置于37℃下烘干；所述海藻糖中含有质量浓度为0.2%的吐温-20。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤五中样品垫2的处理：将样品垫2浸泡于0.02M、pH值为7.2的Tris-HCl中30min，置于37℃下烘干；所述Tris-HCl中含有质量浓度为0.1%的吐温-20。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤五中硝酸纤维素膜4的处理：a、将硝酸纤维素膜4浸泡于包被液0.01M、pH值为7.2的Tris-cl缓冲液(TBS)中30min，置于37℃下烘干；b、用PBS(磷酸盐缓冲液)将抗F5菌毛多克隆抗体和羊抗鼠IgG的浓度分别稀释为1.5mg/ml与0.8mg/ml，以1.2μl/cm的抗体喷膜速度将其喷涂于硝酸纤维素膜4上作为检测线T和质控线C，检测线T靠近结合垫3端，质控线C靠近吸水垫5端，检测线T与质控线C间距为0.5mm；c、将喷有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜4用0.01M、pH值为7.2的Tris-cl封闭30min，置于37℃下烘干；所述Tris-cl中含有质量浓度为2%的BSA和质量浓度为0.2%的吐温-20。其它与具体实施方式一相同。

Claims (9)

1.一种用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条，由PVC背衬(1)、样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)组成，在PVC背衬(1)上依次连续粘附有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)，所述结合垫(3)与所述硝酸纤维素膜(4)之间有搭接，所述硝酸纤维素膜(4)与所述吸水垫(5)之间有搭接；所述结合垫(3)上包被有抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜(4)上分别包被有抗F5菌毛多克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。

2.制备权利要求1所述用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的方法，其特征在于用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的制备方法按以下步骤实现：一、诱导原核表达F5菌毛蛋白，纯化该融合蛋白，即免疫原；二、制备抗F5菌毛多克隆抗体，然后包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，再将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(4)上构成质控线；三、制备抗F5菌毛单克隆抗体；四、采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，然后将抗F5菌毛单克隆抗体加入胶体金溶液中，制得抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物，然后包被在结合垫(3)上；五、在PVC背衬(1)上依次连续粘附样品垫(2)、步骤四所得结合垫(3)、步骤二所得硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)，然后切成6mm×3mm宽的试纸条，即完成用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的制备。

3.根据权利要求2所述的用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于步骤二中制备抗F5菌毛多克隆抗体的具体步骤：a、将免疫浓度为1mg/mL的免疫原，按体积比1:1加入弗氏完全佐剂混合乳化，然后在家兔背部多点皮下注射，注射量为0.2mL/只；b、两周后，改用弗氏不完全佐剂乳化免疫原，以同样方法进行第二次免疫，并且每隔三周加强免疫，每周进行耳缘静脉采血，用间接ELISA方法检测抗体效价，待效价达到6.4×10⁴后，心脏采血分离血清，然后用辛酸硫酸铵粗提结合ProteinG亲和层析进行纯化，获得抗F5菌毛多克隆抗体。

4.根据权利要求2所述的用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于步骤三中制备抗F5菌毛单克隆抗体的具体步骤：a、将免疫浓度为1mg/mL的免疫原，按体积比1:1加入弗氏完全佐剂混合乳化，然后腹腔注射BALB/C小鼠，注射量为0.2mL/只；b、两周后，改用弗氏不完全佐剂乳化免疫原，以同样方法进行第二次免疫；c、两周后，断尾采血检测抗体效价，若ELISA效价达到2¹⁰以上，腹腔注射0.2ml免疫原加强免疫，三天后处死小鼠，取其脾脏，用于细胞融合，用间接酶联免疫吸附试验筛选阳性杂交瘤细胞，筛选获得一株稳定分泌抗F5菌毛蛋白基因的单克隆抗体，命名为F5-1，抗体亚类为IgG1，并为κ链抗体；d、采用分泌抗F5菌毛的单克隆抗体的杂交瘤细胞株以体内诱生腹水法制备抗体，用辛酸-硫酸铵粗提结合ProteinG亲和层析进行纯化，获得抗F5菌毛单克隆抗体。

5.根据权利要求2所述的用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于步骤四中采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液的具体步骤：a、向250ml的三角瓶中加入50ml质量浓度为0.01%的氯金酸水溶液，搅拌加热至沸腾；b、向沸腾的溶液中加入500μl质量浓度为1%柠檬酸三钠水溶液，继续加热保持沸腾15min；c、关掉热源继续搅拌15min，冷却后用0.22μm滤膜过滤至去离子水恢复到原体积，即完成胶体金溶液制备。

6.根据权利要求2所述的用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于步骤四中制得抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物的具体步骤：a、将pH值为7.2的胶体金溶液置于磁力搅拌器上，在5min内以结合量54μg/ml，逐滴将抗F5菌毛单克隆抗体加入胶体金溶液中，继续搅拌30min，加入体积浓度为5.0%的BSA至终浓度为1.0%，继续摇匀30min；b、利用低温高速离心法纯化免疫金：将免疫金于4℃下，1500r/min离心30min，吸取上清；然后在4℃下将上清以14000r/min的速度继续离心30min，吸出弃掉上清；用1/10原体积的0.01M、pH值为7.2的PB溶液将纯化好的胶体金沉淀重悬，置4℃避光保存；所述PB溶液中含有质量浓度为0.5%的BSA和质量浓度为1%的海藻糖。

7.根据权利要求2所述的用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于步骤四中抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫(3)上的具体步骤：将结合垫浸泡于质量浓度为5%的海藻糖中30min，置于37℃下烘干，然后用Biodot点膜仪将制备好的抗F5菌毛单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫上，再置于37℃下烘干；所述海藻糖中含有质量浓度为0.2%的吐温-20。

8.根据权利要求2所述的用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于步骤五中样品垫(2)的处理：将样品垫(2)浸泡于0.02M、pH值为7.2的Tris-HCl中30min，置于37℃下烘干；所述Tris-HCl中含有质量浓度为0.1%的吐温-20。

9.根据权利要求2所述的用于检测大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于步骤五中硝酸纤维素膜(4)的处理：1、将硝酸纤维素膜(4)浸泡于包被液0.01M、pH值为7.2的Tris-cl缓冲液中30min，置于37℃下烘干；2、用PBS将抗F5菌毛多克隆抗体和羊抗鼠IgG的浓度分别稀释为1.5mg/ml与0.8mg/ml，以1.2μl/cm的抗体喷膜速度将其喷涂于硝酸纤维素膜(4)上作为检测线T和质控线C，检测线T靠近结合垫(3)端，质控线C靠近吸水垫(5)端，检测线T与质控线C间距为0.5mm；3、将喷有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜(4)用0.01M、pH值为7.2的Tris-cl封闭30min，置于37℃下烘干；所述Tris-cl中含有质量浓度为2%的BSA和质量浓度为0.2%的吐温-20。