CN105203766A - 一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条制备方法 - Google Patents

一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条制备方法，有效解决现有检测方法费时、繁琐、特异性差的问题，取小鼠腹水和醋酸盐缓冲液，加入正辛酸，混匀，离心，上清液调pH值，加入硫酸铵，离心，沉淀物用PBS溶液溶解，透析，成单克隆抗体；用碳化二亚胺分别活化携带有羧基基团的红色、蓝色、黄色的乳胶颗粒，成悬液状的活化乳胶颗粒；将待标记抗体透析，加入单克隆抗体，滴加入活化乳胶颗粒中，用NaH2PO4漂洗，沉淀悬浮于牛血清白蛋白的缓冲液中，用玻璃纤维吸附标记物并干燥，取抗鼠IgG抗体固化到纤维膜上形成质控区，本发明将免疫反应的特异性、层析方法的快速性及彩色乳胶颗粒作为示踪物的直观性等优点结合在一起，简便、特异、灵敏。

Description

一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条制备方法。
背景技术
小肠结肠炎耶尔森氏菌是引起人类严重小肠结肠炎的病原菌，该菌广泛存在于自然界如湖泊、土壤和植被及家禽、家畜和其他动物身体上。猪、牛、狗、猫、鸡等是储存宿主，人类主要通过污染的食物而感染，临床表现类型为胃肠炎型、阑尾炎和肠系膜淋巴结炎型、结节性红斑与关节炎型、败血症型。已知小肠结肠炎耶尔森氏菌有54个血清型，与人类关系密切的是Ｏ:3、Ｏ:9、Ｏ:8血清型。在中国，对人致病的主要是Ｏ:3、Ｏ:9血清型菌株，Ｏ:8血清型是美国、加拿大等国家的主要致病菌株，由于进口冷冻食品贸易的增加，Ｏ:8也是一个值得重视的血清型。由于本菌在低温中能生长，所以保存在4℃冰箱中的食品更具传染性，因此被称之为“冰箱病”。
目前，常用分离培养、生化鉴定的方法和聚合酶链式反应法（PCR法）确认病原菌。分离培养、生化鉴定法整个过程约需8~10天，不利于小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速诊断和传染源的尽早隔离。PCR方法需要专业技术人员使用专业仪器设备在实验室完成，基层单位无法进行检测，因此市场迫切需要一种快速、简便、特异、灵敏的检测试剂制成的试纸条。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条制备方法，可有效解决现有检测方法费时、繁琐、特异性差的问题。
本发明解决的技术方案是，一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条，包括基材PVC板和玻璃纤维膜，基材PVC板1上依次固定有引水玻璃纤维3、载体玻璃纤维4、硝酸纤维膜2和吸水棉浆板5，所述的硝酸纤维膜2上包被有检测区8和质检区9，所述的引水玻璃纤维3和载体玻璃纤维4上覆盖有第一覆膜7，所述的吸水棉浆板5上覆盖有第二覆膜6，由以下方法实现：
（1）制备纯化的单克隆抗体：
取1份小鼠腹水和3份pH4.4的醋酸盐缓冲液，按每毫升腹水加100μl滴加正辛酸，混匀，18-25℃室温放置25-35分钟，4℃下15000转/分钟离心15-25分钟，弃去沉淀，上清液用NaOH调节pH值至7.2，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每毫升上清液中加入0.277g，18-25℃室温搅拌25-35分钟，15000转/分、4℃离心15-25分钟，弃上清液，沉淀物用所取小鼠腹水1/2倍体积pH7.2的PBS溶液溶解后，再放入作为透析液的pH7.2的PBS缓冲液中，4℃透析45-50小时，每9-10小时换一次透析液，制成纯化的单克隆抗体；
所述的小鼠腹水是指将液体石蜡注射于Balb/c小鼠腹腔内，注射量为300-500μl/只小鼠，10天后，分别将分泌抗Ｏ:3血清型、抗Ｏ:9血清型、抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，注射杂交瘤细胞的数量为2×106/只小鼠，小鼠腹部隆起后用无菌注射器注射于小鼠腹腔采集腹水，即为抗Ｏ:3血清型、抗Ｏ:9血清型、抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体的小鼠腹水；
（2）制备活化乳胶颗粒：
用碳化二亚胺分别活化携带有羧基基团的红色、蓝色、黄色的乳胶颗粒，方法是①将碳化二亚胺加入到pH6.0的NaH2PO4溶液中，配制成体积浓度为20mg/ml的碳化二亚胺溶液；②用pH6.0的NaH2PO4溶液将乳胶液稀释至乳胶质量浓度为2%的乳胶悬液；③取240-260μl碳化二亚胺溶液加入到1200-1300μ1乳胶悬液混匀，即成悬液状的活化乳胶颗粒；
（3）制备标记物：
不同颜色的乳胶颗粒标记不同的单克隆抗体，红色乳胶颗粒标记抗Ｏ:3血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体、蓝色乳胶颗粒标记抗Ｏ:9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体和黄色乳胶颗粒标记抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体；制备方法是：①将待标记抗体于pH6.0的NaH2PO4透析0.5-1.5h；②再按每毫升活化的乳胶颗粒加入20~200μg单克隆抗体，滴加入悬液状的活化乳胶颗粒中，4℃过夜；③用pH6.0的NaH2PO4漂洗1-3次，沉淀重新悬浮于含有体积浓度为1%牛血清白蛋白的缓冲液中，得标记物；④用玻璃纤维吸附标记物并干燥；
（4）包被纤维膜：
取抗鼠IgG抗体以划线的方式固化到纤维膜上形成质控区9；抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体按体积1:1:1比例混合，以划线的方式固化到纤维膜上形成检测区8；检测区和质控区的包被划线相距5mm，抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5~5mg/ml，抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的包被浓度为0.05~2mg/ml；
（5）测试条组装：
取基材PVC板1，将引水玻璃纤维3、含有乳胶颗粒标记单克隆抗体的载体玻璃纤维4、硝酸纤维膜2，吸水棉浆板5固定粘贴于基材PVC板1上，所述的硝酸纤维膜2上包被有抗鼠IgG抗体的质检区9和抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的检测区8，检测区8和质控区9暴露在覆膜外形成检测窗，引水玻璃纤维3和载体玻璃纤维4上覆盖有第一覆膜7，吸水棉浆板5上覆盖有第二覆膜6，切割成长条即可。
本发明采用彩色乳胶免疫层析检测法，将免疫反应的特异性、层析方法的快速性、以及彩色乳胶颗粒作为示踪物的直观性等诸多优点结合在一起，实现小肠结肠炎耶尔森氏菌简便、特异、灵敏的快速分型检测。
附图说明
图1为本发明中小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条的立体结构图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，是由以下实施例实现。
由以下步骤实现：
实施例1
本发明在具体实施中，由以下步骤实现：
（1）制备纯化的单克隆抗体：
取1份小鼠腹水和3份pH4.4的醋酸盐缓冲液，按每毫升腹水加100μl滴加正辛酸，混匀，18-25℃室温放置30分钟，4℃下15000转/分钟离心20分钟，弃去沉淀，上清液用NaOH调节pH值至7.2，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每毫升上清液中加入0.277g，18-25℃室温搅拌30分钟，15000转/分、4℃离心20分钟，弃上清液，沉淀物用所取小鼠腹水1/2倍体积的pH7.2的PBS溶液溶解后，再放入作为透析液的pH7.2的PBS缓冲液中，4℃透析48小时，每9-10小时换一次透析液，制成纯化的单克隆抗体；
（2）制备活化乳胶颗粒：
用碳化二亚胺分别活化携带有羧基基团的红色、蓝色、黄色的乳胶颗粒，方法是①将碳化二亚胺加入到pH6.0的NaH2PO4溶液中，配制成体积浓度为20mg/ml的碳化二亚胺溶液；②用pH6.0的NaH2PO4溶液将乳胶液稀释至乳胶质量浓度为2%的乳胶悬液；③取250μl碳化二亚胺溶液加入到1250μ1乳胶悬液混匀，即成悬液状的活化乳胶颗粒；
（3）制备标记物：
不同颜色的乳胶颗粒标记不同的单克隆抗体，红色乳胶颗粒标记抗Ｏ:3血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体、蓝色乳胶颗粒标记抗Ｏ:9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体和黄色乳胶颗粒标记抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体；制备方法是：①将待标记抗体于pH6.0的NaH2PO4透析1h；②再按每毫升活化的乳胶颗粒加入50μg单克隆抗体，滴加入悬液状的活化乳胶颗粒中，4℃过夜；③用pH6.0的NaH2PO4漂洗2次，沉淀重新悬浮于含有体积浓度为1%牛血清白蛋白的缓冲液中，得标记物；④用玻璃纤维吸附标记物并干燥；
（4）包被纤维膜：
取抗鼠IgG抗体以划线的方式固化到纤维膜上形成质控区9；抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体按体积1:1:1比例混合，以划线的方式固化到纤维膜上形成检测区8；检测区和质控区的包被划线相距5mm，抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5mg/ml，抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的包被浓度为2mg/ml；
（5）测试条组装：
取基材PVC板1，将引水玻璃纤维3、含有乳胶颗粒标记单克隆抗体的载体玻璃纤维4、硝酸纤维膜2，吸水棉浆板5固定粘贴于基材PVC板1上，所述的硝酸纤维膜2上包被有抗鼠IgG抗体的质检区9和抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的检测区8，检测区8和质控区9暴露在覆膜外形成检测窗，引水玻璃纤维3和载体玻璃纤维4上覆盖有第一覆膜7，吸水棉浆板5上覆盖有第二覆膜6，切割成长条即可。
实施例2
本发明在具体实施中，由以下步骤实现：
（1）制备纯化的单克隆抗体：
取1份小鼠腹水和3份pH4.4的醋酸盐缓冲液，按每毫升腹水加100μl滴加正辛酸，混匀，18-25℃室温放置25分钟，4℃下15000转/分钟离心15分钟，弃去沉淀，上清液用NaOH调节pH值至7.2，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每毫升上清液中加入0.277g，18-25℃室温搅拌25分钟，15000转/分、4℃离心15分钟，弃上清液，沉淀物用所取小鼠腹水1/2倍体积pH7.2的PBS溶液溶解后，再放入作为透析液的pH7.2的PBS缓冲液中，4℃透析45小时，每9-10小时换一次透析液，制成纯化的单克隆抗体；
（2）制备活化乳胶颗粒：
用碳化二亚胺分别活化携带有羧基基团的红色、蓝色、黄色的乳胶颗粒，方法是①将碳化二亚胺加入到pH6.0的NaH2PO4溶液中，配制成体积浓度为20mg/ml的碳化二亚胺溶液；②用pH6.0的NaH2PO4溶液将乳胶液稀释至乳胶质量浓度为2%的乳胶悬液；③取250μl碳化二亚胺溶液加入到1250μ1乳胶悬液混匀，即成悬液状的活化乳胶颗粒；
（3）制备标记物：
不同颜色的乳胶颗粒标记不同的单克隆抗体，红色乳胶颗粒标记抗Ｏ:3血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体、蓝色乳胶颗粒标记抗Ｏ:9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体和黄色乳胶颗粒标记抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体；制备方法是：①将待标记抗体于pH6.0的NaH2PO4透析0.5h；②再按每毫升活化的乳胶颗粒加入100μg单克隆抗体，滴加入悬液状的活化乳胶颗粒中，4℃过夜；③用pH6.0的NaH2PO4漂洗1次，沉淀重新悬浮于含有体积浓度为1%牛血清白蛋白的缓冲液中，得标记物；④用玻璃纤维吸附标记物并干燥；
（4）包被纤维膜：
取抗鼠IgG抗体以划线的方式固化到纤维膜上形成质控区9；抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体按体积1:1:1比例混合，以划线的方式固化到纤维膜上形成检测区8；检测区和质控区的包被划线相距5mm，抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5mg/ml，抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的包被浓度为1mg/ml；
（5）测试条组装：
取基材PVC板1，将引水玻璃纤维3、含有乳胶颗粒标记单克隆抗体的载体玻璃纤维4、硝酸纤维膜2，吸水棉浆板5固定粘贴于基材PVC板1上，所述的硝酸纤维膜2上包被有抗鼠IgG抗体的质检区9和抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的检测区8，检测区8和质控区9暴露在覆膜外形成检测窗，引水玻璃纤维3和载体玻璃纤维4上覆盖有第一覆膜7，吸水棉浆板5上覆盖有第二覆膜6，切割成长条即可。
实施例3
本发明在具体实施中，由以下步骤实现：
（1）制备纯化的单克隆抗体：
取1份小鼠腹水和3份pH4.4的醋酸盐缓冲液，按每毫升腹水加100μl滴加正辛酸，混匀，18-25℃室温放置35分钟，4℃下15000转/分钟离心25分钟，弃去沉淀，上清液用NaOH调节pH值至7.2，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每毫升上清液中加入0.277g，18-25℃室温搅拌35分钟，15000转/分、4℃离心25分钟，弃上清液，沉淀物用所取小鼠腹水1/2倍体积pH7.2的PBS溶液溶解后，再放入作为透析液的pH7.2的PBS缓冲液中，4℃透析50小时，每9-10小时换一次透析液，制成纯化的单克隆抗体；
（2）制备活化乳胶颗粒：
用碳化二亚胺分别活化携带有羧基基团的红色、蓝色、黄色的乳胶颗粒，方法是①将碳化二亚胺加入到pH6.0的NaH2PO4溶液中，配制成体积浓度为20mg/ml的碳化二亚胺溶液；②用pH6.0的NaH2PO4溶液将乳胶液稀释至乳胶质量浓度为2%的乳胶悬液；③取250μl碳化二亚胺溶液加入到1250μ1乳胶悬液混匀，即成悬液状的活化乳胶颗粒；
（3）制备标记物：
不同颜色的乳胶颗粒标记不同的单克隆抗体，红色乳胶颗粒标记抗Ｏ:3血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体、蓝色乳胶颗粒标记抗Ｏ:9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体和黄色乳胶颗粒标记抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体；制备方法是：①将待标记抗体于pH6.0的NaH2PO4透析1.5h；②再按每毫升活化的乳胶颗粒加入200μg单克隆抗体，滴加入悬液状的活化乳胶颗粒中，4℃过夜；③用pH6.0的NaH2PO4漂洗3次，沉淀重新悬浮于含有体积浓度为1%牛血清白蛋白的缓冲液中，得标记物；④用玻璃纤维吸附标记物并干燥；
（4）包被纤维膜：
取抗鼠IgG抗体以划线的方式固化到纤维膜上形成质控区9；抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体按体积1:1:1比例混合，以划线的方式固化到纤维膜上形成检测区8；检测区和质控区的包被划线相距5mm，抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5mg/ml，抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的包被浓度为0.5mg/ml；
（5）测试条组装：
取基材PVC板1，将引水玻璃纤维3、含有乳胶颗粒标记单克隆抗体的载体玻璃纤维4、硝酸纤维膜2，吸水棉浆板5固定粘贴于基材PVC板1上，所述的硝酸纤维膜2上包被有抗鼠IgG抗体的质检区9和抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的检测区8，检测区8和质控区9暴露在覆膜外形成检测窗，引水玻璃纤维3和载体玻璃纤维4上覆盖有第一覆膜7，吸水棉浆板5上覆盖有第二覆膜6，切割成长条即可。
本发明致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条，包括基材、覆盖于基材前部的引水玻璃纤维、载体玻璃纤维以及覆盖于这两种材料之上的覆膜；粘贴于基材中部的硝酸纤维膜；覆盖于基材后部的吸水材料及其上面的覆膜。测试条前部载体玻璃纤维上吸附有红色乳胶颗粒标记的抗Ｏ:3血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体、蓝色乳胶颗粒标记的抗Ｏ:9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体、黄色乳胶颗粒标记的抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体。中部纤维膜上自前往后分布有一条包被有抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体混合物的检测区，一条包被有抗鼠IgG抗体的质控区。
所述基材为PVC板，前部引水材料为玻璃纤维，载体纤维为玻璃纤维，覆膜为不干胶膜。中部纤维膜为硝酸纤维膜。后部吸水材料为棉浆板，覆膜为不干胶膜。引水玻璃纤维、载体玻璃纤维、硝酸纤维膜、棉浆板依次搭接并粘附于PVC板上，搭接方式为后一材料的上端面与前一材料的下端面衔接。其制备方法是，由以下步骤实现：首先制备用于标记乳胶颗粒和包被硝酸纤维膜的单克隆抗体、活化乳胶颗粒、乳胶颗粒标记物、固化标记物、包被纤维膜，再将上述制备好的包被膜、固化标记物、引水玻璃纤维、吸水棉浆板固定粘结于基材PVC板上，覆盖上覆膜，切割成4mm宽的长条即可。
本发明可有效用于同时检测Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌。本发明测试条在使用时，将引水玻璃纤维一端竖向插入标本样品中，或将标本样品滴至引水玻璃纤维上，样品在毛细管力作用下，沿测试条向吸水棉浆板方向泳动，当标本样品中含有Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌任何一种，它们与相应的乳胶颗粒标记抗体结合，形成抗体+抗原复合物。当样品泳动至包被有抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体混合物的检测区时，与相应的包被单克隆抗体结合而被截留，形成肉眼可见的相应颜色的检测线，剩余标记单克隆抗体继续向前移动，到达包被有抗鼠IgG抗体区域即质控区，与抗鼠抗体结合形成质控线。检测区出现红色检测线，表明样品中含有Ｏ:3血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌；出现蓝色检测线表明样品中含有Ｏ:9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌；出现黄色检测线表明样品中含有Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌；检测区无检测线出现，表明样品中不含有上述任何一种血清型的小肠结肠炎耶尔森氏菌。无论检测区有无检测线出现，质控区均有质控线出现，当不出现质控线，表明测试条失效。因此，利用本测试条，只需一次加样，5～10分钟即可对三种血清型的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行检测，并能明确获知样品中含有哪一血清型的细菌。该方法简单、方便、快捷、结果准确。
本发明经试验取得了非常满意的有益技术效果，用本测试条检测经过国标法验证的小肠结肠炎耶尔森氏菌样品用126份（Ｏ:3血清型59份；Ｏ:9血清型54份；Ｏ:8血清型13份），当细菌浓度大于104个/毫升时，符合率为100%；检测非耶尔森氏菌样品142份，未出现假阳性，也就是说在现有的试验中，准确率为100%，非常稳定、可靠，而且，每一样品检测只需5~10分钟，与现有的分离培养法需8~10天相比，节约时间，速度之快、效率之高是现有技术无法相比的，具有很高的实用价值。
本发明采用彩色乳胶免疫层析检测法，将免疫反应的特异性、层析方法的快速性、以及彩色乳胶颗粒作为示踪物的直观性等诸多优点结合在一起，实现小肠结肠炎耶尔森氏菌简便、特异、快捷、准确、灵敏的快速分型检测，是小肠结肠炎耶尔森氏菌检测技术上的一大创新，经济和社会效益巨大。

Claims (4)

1.一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条的制备方法，其特征在于，该测试条为，基材PVC板（1）上依次固定有引水玻璃纤维（3）、载体玻璃纤维（4）、硝酸纤维膜（2）和吸水棉浆板（5），所述的硝酸纤维膜（2）上包被有检测区（8）和质检区（9），所述的引水玻璃纤维（3）和载体玻璃纤维（4）上覆盖有第一覆膜（7），所述的吸水棉浆板（5）上覆盖有第二覆膜（6），由以下方法实现：
1）制备纯化的单克隆抗体：
取1份小鼠腹水和3份pH4.4的醋酸盐缓冲液，按每毫升腹水加100μl滴加正辛酸，混匀，18-25℃室温放置25-35分钟，4℃下15000转/分钟离心15-25分钟，弃去沉淀，上清液用NaOH调节pH值至7.2，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每毫升上清液中加入0.277g，18-25℃室温搅拌25-35分钟，15000转/分、4℃离心15-25分钟，弃上清液，沉淀物用所取小鼠腹水1/2倍体积pH7.2的PBS溶液溶解后，再放入作为透析液的pH7.2的PBS缓冲液中，4℃透析45-50小时，每9-10小时换一次透析液，制成纯化的单克隆抗体；
所述的小鼠腹水是指将液体石蜡注射于Balb/c小鼠腹腔内，注射量为300-500μl/只小鼠，10天后，分别将分泌抗Ｏ:3血清型、抗Ｏ:9血清型、抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，注射杂交瘤细胞的数量为2×106/只小鼠，小鼠腹部隆起后用无菌注射器注射于小鼠腹腔采集腹水，即为抗Ｏ:3血清型、抗Ｏ:9血清型、抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体的小鼠腹水；
2）制备活化乳胶颗粒：
用碳化二亚胺分别活化携带有羧基基团的红色、蓝色、黄色的乳胶颗粒，方法是①将碳化二亚胺加入到pH6.0的NaH2PO4溶液中，配制成体积浓度为20mg/ml的碳化二亚胺溶液；②用pH6.0的NaH2PO4溶液将乳胶液稀释至乳胶质量浓度为2%的乳胶悬液；③取240-260μl碳化二亚胺溶液加入到1200-1300μ1乳胶悬液混匀，即成悬液状的活化乳胶颗粒；
3）制备标记物：
不同颜色的乳胶颗粒标记不同的单克隆抗体，红色乳胶颗粒标记抗Ｏ:3血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体、蓝色乳胶颗粒标记抗Ｏ:9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体和黄色乳胶颗粒标记抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体；制备方法是：①将待标记抗体于pH6.0的NaH2PO4透析0.5-1.5h；②再按每毫升活化的乳胶颗粒加入20~200μg单克隆抗体，滴加入悬液状的活化乳胶颗粒中，4℃过夜；③用pH6.0的NaH2PO4漂洗1-3次，沉淀重新悬浮于含有体积浓度为1%牛血清白蛋白的缓冲液中，得标记物；④用玻璃纤维吸附标记物并干燥；
4）包被纤维膜：
取抗鼠IgG抗体以划线的方式固化到纤维膜上形成质控区（9）；抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体按体积1:1:1比例混合，以划线的方式固化到纤维膜上形成检测区（8）；检测区和质控区的包被划线相距5mm，抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5~5mg/ml，抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的包被浓度为0.05~2mg/ml；
5）测试条组装：
取基材PVC板（1），将引水玻璃纤维（3）、含有乳胶颗粒标记单克隆抗体的载体玻璃纤维（4）、硝酸纤维膜（2），吸水棉浆板（5）固定粘贴于基材PVC板（1）上，所述的硝酸纤维膜（2）上包被有抗鼠IgG抗体的质检区（9）和抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的检测区（8），检测区（8）和质控区（9）暴露在覆膜外形成检测窗，引水玻璃纤维（3）和载体玻璃纤维（4）上覆盖有第一覆膜（7），吸水棉浆板（5）上覆盖有第二覆膜（6），切割成长条即可。
2.根据权利要求1所述的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
1）制备纯化的单克隆抗体：
取1份小鼠腹水和3份pH4.4的醋酸盐缓冲液，按每毫升腹水加100μl滴加正辛酸，混匀，18-25℃室温放置30分钟，4℃下15000转/分钟离心20分钟，弃去沉淀，上清液用NaOH调节pH值至7.2，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每毫升上清液中加入0.277g，18-25℃室温搅拌30分钟，15000转/分、4℃离心20分钟，弃上清液，沉淀物用所取小鼠腹水1/2倍体积的pH7.2的PBS溶液溶解后，再放入作为透析液的pH7.2的PBS缓冲液中，4℃透析48小时，每9-10小时换一次透析液，制成纯化的单克隆抗体；
2）制备活化乳胶颗粒：
用碳化二亚胺分别活化携带有羧基基团的红色、蓝色、黄色的乳胶颗粒，方法是①将碳化二亚胺加入到pH6.0的NaH2PO4溶液中，配制成体积浓度为20mg/ml的碳化二亚胺溶液；②用pH6.0的NaH2PO4溶液将乳胶液稀释至乳胶质量浓度为2%的乳胶悬液；③取250μl碳化二亚胺溶液加入到1250μ1乳胶悬液混匀，即成悬液状的活化乳胶颗粒；
3）制备标记物：
不同颜色的乳胶颗粒标记不同的单克隆抗体，红色乳胶颗粒标记抗Ｏ:3血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体、蓝色乳胶颗粒标记抗Ｏ:9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体和黄色乳胶颗粒标记抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体；制备方法是：①将待标记抗体于pH6.0的NaH2PO4透析1h；②再按每毫升活化的乳胶颗粒加入50μg单克隆抗体，滴加入悬液状的活化乳胶颗粒中，4℃过夜；③用pH6.0的NaH2PO4漂洗2次，沉淀重新悬浮于含有体积浓度为1%牛血清白蛋白的缓冲液中，得标记物；④用玻璃纤维吸附标记物并干燥；
4）包被纤维膜：
取抗鼠IgG抗体以划线的方式固化到纤维膜上形成质控区（9）；抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体按体积1:1:1比例混合，以划线的方式固化到纤维膜上形成检测区（8）；检测区和质控区的包被划线相距5mm，抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5mg/ml，抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的包被浓度为2mg/ml；
5）测试条组装：
取基材PVC板（1），将引水玻璃纤维（3）、含有乳胶颗粒标记单克隆抗体的载体玻璃纤维（4）、硝酸纤维膜（2），吸水棉浆板（5）固定粘贴于基材PVC板（1）上，所述的硝酸纤维膜（2）上包被有抗鼠IgG抗体的质检区（9）和抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的检测区（8），检测区（8）和质控区（9）暴露在覆膜外形成检测窗，引水玻璃纤维（3）和载体玻璃纤维（4）上覆盖有第一覆膜（7），吸水棉浆板（5）上覆盖有第二覆膜（6），切割成长条即可。
3.根据权利要求1所述的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
1）制备纯化的单克隆抗体：
取1份小鼠腹水和3份pH4.4的醋酸盐缓冲液，按每毫升腹水加100μl滴加正辛酸，混匀，18-25℃室温放置25分钟，4℃下15000转/分钟离心15分钟，弃去沉淀，上清液用NaOH调节pH值至7.2，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每毫升上清液中加入0.277g，18-25℃室温搅拌25分钟，15000转/分、4℃离心15分钟，弃上清液，沉淀物用所取小鼠腹水1/2倍体积pH7.2的PBS溶液溶解后，再放入作为透析液的pH7.2的PBS缓冲液中，4℃透析45小时，每9-10小时换一次透析液，制成纯化的单克隆抗体；
2）制备活化乳胶颗粒：
用碳化二亚胺分别活化携带有羧基基团的红色、蓝色、黄色的乳胶颗粒，方法是①将碳化二亚胺加入到pH6.0的NaH2PO4溶液中，配制成体积浓度为20mg/ml的碳化二亚胺溶液；②用pH6.0的NaH2PO4溶液将乳胶液稀释至乳胶质量浓度为2%的乳胶悬液；③取250μl碳化二亚胺溶液加入到1250μ1乳胶悬液混匀，即成悬液状的活化乳胶颗粒；
3）制备标记物：
不同颜色的乳胶颗粒标记不同的单克隆抗体，红色乳胶颗粒标记抗Ｏ:3血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体、蓝色乳胶颗粒标记抗Ｏ:9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体和黄色乳胶颗粒标记抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体；制备方法是：①将待标记抗体于pH6.0的NaH2PO4透析0.5h；②再按每毫升活化的乳胶颗粒加入100μg单克隆抗体，滴加入悬液状的活化乳胶颗粒中，4℃过夜；③用pH6.0的NaH2PO4漂洗1次，沉淀重新悬浮于含有体积浓度为1%牛血清白蛋白的缓冲液中，得标记物；④用玻璃纤维吸附标记物并干燥；
4）包被纤维膜：
取抗鼠IgG抗体以划线的方式固化到纤维膜上形成质控区（9）；抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体按体积1:1:1比例混合，以划线的方式固化到纤维膜上形成检测区（8）；检测区和质控区的包被划线相距5mm，抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5mg/ml，抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的包被浓度为1mg/ml；
5）测试条组装：
取基材PVC板（1），将引水玻璃纤维（3）、含有乳胶颗粒标记单克隆抗体的载体玻璃纤维（4）、硝酸纤维膜（2），吸水棉浆板（5）固定粘贴于基材PVC板（1）上，所述的硝酸纤维膜（2）上包被有抗鼠IgG抗体的质检区（9）和抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的检测区（8），检测区（8）和质控区（9）暴露在覆膜外形成检测窗，引水玻璃纤维（3）和载体玻璃纤维（4）上覆盖有第一覆膜（7），吸水棉浆板（5）上覆盖有第二覆膜（6），切割成长条即可。
4.根据权利要求1所述的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
1）制备纯化的单克隆抗体：
取1份小鼠腹水和3份pH4.4的醋酸盐缓冲液，按每毫升腹水加100μl滴加正辛酸，混匀，18-25℃室温放置35分钟，4℃下15000转/分钟离心25分钟，弃去沉淀，上清液用NaOH调节pH值至7.2，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每毫升上清液中加入0.277g，18-25℃室温搅拌35分钟，15000转/分、4℃离心25分钟，弃上清液，沉淀物用所取小鼠腹水1/2倍体积pH7.2的PBS溶液溶解后，再放入作为透析液的pH7.2的PBS缓冲液中，4℃透析50小时，每9-10小时换一次透析液，制成纯化的单克隆抗体；
2）制备活化乳胶颗粒：
用碳化二亚胺分别活化携带有羧基基团的红色、蓝色、黄色的乳胶颗粒，方法是①将碳化二亚胺加入到pH6.0的NaH2PO4溶液中，配制成体积浓度为20mg/ml的碳化二亚胺溶液；②用pH6.0的NaH2PO4溶液将乳胶液稀释至乳胶质量浓度为2%的乳胶悬液；③取250μl碳化二亚胺溶液加入到1250μ1乳胶悬液混匀，即成悬液状的活化乳胶颗粒；
3）制备标记物：
不同颜色的乳胶颗粒标记不同的单克隆抗体，红色乳胶颗粒标记抗Ｏ:3血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体、蓝色乳胶颗粒标记抗Ｏ:9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体和黄色乳胶颗粒标记抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体；制备方法是：①将待标记抗体于pH6.0的NaH2PO4透析1.5h；②再按每毫升活化的乳胶颗粒加入200μg单克隆抗体，滴加入悬液状的活化乳胶颗粒中，4℃过夜；③用pH6.0的NaH2PO4漂洗3次，沉淀重新悬浮于含有体积浓度为1%牛血清白蛋白的缓冲液中，得标记物；④用玻璃纤维吸附标记物并干燥；
4）包被纤维膜：
取抗鼠IgG抗体以划线的方式固化到纤维膜上形成质控区（9）；抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体按体积1:1:1比例混合，以划线的方式固化到纤维膜上形成检测区（8）；检测区和质控区的包被划线相距5mm，抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5mg/ml，抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的包被浓度为0.5mg/ml；
5）测试条组装：
取基材PVC板（1），将引水玻璃纤维（3）、含有乳胶颗粒标记单克隆抗体的载体玻璃纤维（4）、硝酸纤维膜（2），吸水棉浆板（5）固定粘贴于基材PVC板（1）上，所述的硝酸纤维膜（2）上包被有抗鼠IgG抗体的质检区（9）和抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的检测区（8），检测区（8）和质控区（9）暴露在覆膜外形成检测窗，引水玻璃纤维（3）和载体玻璃纤维（4）上覆盖有第一覆膜（7），吸水棉浆板（5）上覆盖有第二覆膜（6），切割成长条即可。
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Granted publication date: 20170111

Termination date: 20180929