CN101055274B

CN101055274B - 动物布鲁氏菌抗原胶体金试纸膜检测试剂盒

Info

Publication number: CN101055274B
Application number: CN200710055741XA
Authority: CN
Inventors: 王兴龙; 李晓艳; 唐景峰; 梅建军
Original assignee: Institute of Military Veterinary Academy of Military Medical Sciences PLA
Current assignee: Institute of Military Veterinary Academy of Military Medical Sciences PLA
Priority date: 2007-06-08
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2027-06-08
Also published as: CN101055274A

Abstract

本发明公开一种动物布鲁氏菌抗原胶体金试纸膜检测试剂盒，根据抗原抗体能特异结合的免疫学基本原理，利用胶体金免疫层析技术和银染加强技术，以重组的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)作为金标抗体，以高纯度的布鲁氏菌LPS作为包被抗原，利用羊抗牛IgG为质控线制备胶体金试纸条。本发明能够准确区分动物布鲁氏菌病种型，可同时检测牛、羊、猪种动物布鲁氏菌病，且不发生交叉反应，假阳性率低，与常规分离培养的阴、阳性符合率为100％。检测快捷，5分钟内便可得出结果，不需要复杂的检测仪器为辅助，解决基层单位和普通兽医工作者对动物布鲁氏菌病的普查和病例检测难的问题，特别适合基层医务和兽医工作者使用。

Description

动物布鲁氏菌抗原胶体金试纸膜检测试剂盒

技术领域

本发明公开一种动物布鲁氏菌抗原胶体金试纸膜检测试剂盒，用于布鲁氏菌病的诊断，属于动物疫病诊断技术领域。

背景技术

布鲁氏菌是一种革兰氏阴性、特异性胞内寄生菌，能感染许多种动物和人。目前，根据致病性及宿主的不同将布鲁氏菌分成6个种，即羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、沙林鼠布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌、犬布鲁氏菌。其中在世界范围内广泛流行的是牛、羊、猪布鲁氏菌，对畜牧业危害巨大，更重要的是它们均能引起人的感染，威胁着公众健康。所以对布鲁氏菌病诊断方面的研究一直受到世界各国的关注。传统的诊断动物布鲁氏菌病的血清学诊断方法包括：快速滑动凝集试验(RSAT)、标准试管凝集试验(SAT)、2-巯基乙醇试管凝集试验(2ME)、补体结合试验(CFT)等。它们都存在着以下不足，首先，动物布鲁氏菌和其它细菌(如：耶尔森氏菌O9、大肠杆菌O157)间发生交叉反应现象很难避免；第二，传统检测方法检测费时、费力且易出现假阳性；第三，传统的诊断方法不能区分布鲁氏菌病的种型。因此，建立一种简便、快速、特异的诊断方法，对于动物布鲁氏菌病的诊断、检疫和流行病学调查具有重要的意义。

发明内容

本发明公开一种动物布鲁氏菌抗原胶体金试纸膜检测试剂盒。该试剂盒可以检测牛、羊、猪布鲁氏菌病抗原，与传统的常规分离培养方法比，更简便、快速、特异。适用于动物布鲁氏菌病的诊断、检疫和流行病学调查。

本发明的解决方案是根据抗原、抗体能特异结合的免疫学基本原理，利用单克隆抗体技术和胶体金免疫层析技术，以动物布鲁氏菌单克隆抗体IgG作为金标抗体，以动物布鲁氏菌多克隆抗体IgG为检测线、羊抗鼠IgG为质控线制备成了分别检测牛、羊布鲁氏菌抗原的胶体金试纸膜，并组装成了试剂盒。试剂盒包括胶体金试纸膜，阴、阳性试剂，塑料吸管，离心管以及说明书。本发明能够准确区分动物布鲁氏菌病种型，可同时检测牛、羊、猪种动物布鲁氏菌病。牛、羊胶体金试纸膜可分别检测牛、羊布鲁氏菌病的抗原，与牛、羊试纸膜均发生反应的为猪布鲁氏菌病抗原。

试剂盒的具体制作方法如下：

将B.abortus544A和B.melitensis16M布鲁氏菌单克隆抗体株4B8、2D10进行亲和纯化IgG，纯化后效价为1×10⁶以上，单抗亚型为IgG1、IgG3和IgG2b，亲和常数为1×10⁷～2.7×10⁸M^-1，抗体IgG含量为6.12mg/mL～8.45mg/mL，纯度为97.3％～99.5％，以此作为金标抗体。用纯化的B.abortus544A和B.melitensis16M制备多克隆抗体，经亲和层析柱纯化抗体IgG，纯化后IgG含量为13.12mg/mL～18.96mg/mL，纯度达到98.5％～99.1％，多抗效价为1×10⁶以上，以此作为检测线包被抗体。采用胶体金免疫层析法，制备布鲁氏菌抗原胶体金试纸膜，结果该试纸膜最低检测限为3×10³～5×10³CFU之间，与耶尔森菌O9、大肠杆菌O157、沙门氏菌和胸膜肺炎放线杆菌不发生交叉反应；模拟样本水样的最低检测限为3×10³CFU，土样、奶样为5×10³CFU，4℃保质期为12个月。

检测试剂盒由以下结构组成：

(1)试纸膜：

①样品垫：紧密连接于试纸的金标垫；是试纸膜进行检测的部分。主要接触样品液，利用样品垫的吸附使液体前进，但液面不能超过样品垫的MAX线。

②玻璃纤维膜：位于样品垫的上部，是金标蛋白固定的材料。布鲁氏菌病抗原试纸的玻璃纤维吸附有金标探针，即所谓的金标垫。金标探针是由特异性单克隆抗体IgG结合胶体金而成，可特异性的吸附样品液中的样本。

③硝酸纤维膜(NC)：位于玻璃纤维膜的上部，膜上喷有间隔的检测线(T)和质控线(C)。布鲁氏菌胶体金试纸的T线包被为特异的单克隆抗体IgG，C线分别包被为羊抗鼠IgG。

④吸水纸：位于试纸的最上部，紧连着NC膜。试纸吸附样品液的动力主要靠吸水纸和样品垫。

⑤塑料垫板：主要起支撑试纸的作用，为硬质塑料板。

(2)阴、阳性试剂：

①阴性试剂：试剂盒使用时，作为阴性对照。

②阳性试剂：试剂盒使用时，作为阳性对照。

(3)塑料吸管：主要用于布鲁氏菌病样本的采集。

(4)离心管：主要用于分离样本时离心使用。

(5)说明书：主要介绍试剂盒的使用方法。

以下是抗原试纸膜的使用方法：

[原理]当样品到达金标垫时，与胶体金标记的动物布鲁氏菌单克隆抗体IgG进行特异结合，由于毛细管作用样品将沿着该膜继续向前移动，至固定有动物布鲁氏菌多克隆抗体IgG的检测线(T)区域时，与样品中相应的抗原发生特异性结合，然后样品继续移动与控制线(C)上的羊抗鼠抗体IgG反应，由于标记物胶体金的作用使T、C线区均显示红色即阳性反应，从而实现特异性的免疫诊断。如果是阴性反应，只有C线显色，T线不显色。

[使用方法]将1mL被检样本液(样本液的制备按常规)加入2mL试管中，把试纸条垂直插入液体中，使液体不超过试纸条下端的MAX控制线，5分钟内可读取结果。

[结果判断]阳性：白色显示区上下呈现两条红线。

阴性：白色显示区上下呈现一条红色控制线C。

无效：5min内无控制线C出现。

本发明的优点在于：本发明利用免疫学技术和胶体金标记技术相结合，不仅能有效检测动物布鲁氏菌的抗原，而且能区分所感染病原体的种类(牛、羊、猪种)，不发生种内交叉反应，与耶尔森菌O9、大肠杆菌O157、沙门氏菌和胸膜肺炎放线杆菌等相近细菌也不发生交叉反应。与常规细菌分离培养方法相比，阴、阳性符合率均为100％。检测快捷，5分钟内可报告结果。不需要特殊的仪器设备。

附图说明

图1为本发明胶体金试纸结构组装模式图。

图2为本发明检测试纸膜图。B：检测阳性结果；C：检测阴性结果

具体实施例

为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

实施例1

1、动物布鲁氏菌LPS和O链的提取与鉴定

选取B.abortus544A和B.melitensis16M两株光滑型布鲁氏菌，分别用热酚法和冷酚法提取了上述两株菌的LPS和O链，经SephadexG-50层析柱纯化后，含量为1.21～2.31mg/mL，纯度为96.3％～97.2％。并对提纯的LPS和O链做了鉴定，检测了两株光滑型布鲁氏菌的LPS和O链的抗原性。

2、布鲁氏菌种特异性单克隆抗体的制备与鉴定

B.melitensis16M和B.abortus544A菌体免疫Balb/C小鼠，用提纯的LPS和O链抗原作为检测抗原，制出了针对A和M抗原的种特异性单克隆抗体4B8、2D10，纯化后效价为1×10⁶以上，单抗亚型为IgG1、IgG3和IgG2b，亲和常数为1×10⁷～2.7×10⁸M^-1，抗体IgG含量为6.12mg/mL～8.45mg/mL，纯度为97.3％～99.5％。

3、布鲁氏菌多克隆抗体的制备与鉴定

B.melitensis16M和B.abortus544A菌56℃～60℃灭活1小时，然后用差速离心法浓缩和提纯。按常规方法制备多克隆抗体，经亲和层析柱纯化抗体IgG，纯化后IgG含量为13.12mg/mL～18.96mg/mL，纯度达到98.5％～99.1％，多抗效价为1×10⁶以上。

实施例2

1、胶体金的制备与最适粒径的选择

利用柠檬酸钠还原法和鞣酸—枸橼酸钠还原法制备20nm、25nm、30nm、40nm胶体金颗粒，电镜下观察其分散度和均匀度，选择最适胶体金30nm、40nm粒径进行标记。

2、动物布鲁氏菌金标探针最佳标记pH的确定

利用胶体金梯度法和O值曲线法，确定胶体金标记单抗IgG的最佳pH。本试验最佳标pH为8.2～9.0。

3、动物布鲁氏菌金标探针最佳标记量的确定

利用胶体金梯度法和O值曲线法，确定胶体金标记单抗IgG的最佳量。本试验最佳标记量为20～60μg/mL。

4、金标探针的制备与纯化

取两个5mL试管，分别加入5mL30nm、40nm胶体金；加入80μl～90μl0.2mol/L K₂CO₃把pH调整为8.2～9.0；根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量60μg/ml～90μg/ml，将单克隆抗体IgG加入胶体金溶液中，时应逐滴加入，整个过程大约5min加完。摇匀15min～20min，室温放置10～15min；分别加入10％BSA至终浓度为1～5％，防止抗体蛋白和胶体金聚合和沉淀。采用差速离心法和凝胶过滤法对标记好的探针进行纯化，电镜下观察金标探针的质量与分散度。

5、金标探针稳定性试验

影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。选择不同的稳定剂如BSA、脱脂奶粉、PEG20000以及pH、温度、适度等因素，得出保持胶体金稳定性的最佳条件。结果选择最佳稳定剂为BSA，温度为37℃，pH为8.2～9.0。

6、包被抗体最佳喷膜浓度的选择

对NC膜上T线及C线设置几个抗体浓度梯度选择出最优的一组作为金标浓度(T线)和包被浓度(C线)。对包被的条件进行优化，如缓冲液、T及C线宽度、喷膜速度。结果缓冲液选择Tris碱，喷膜浓度为0.8～1.0mg/ml，喷膜速度为0.75μl/cm。

7、试纸膜的组装

参见图1所示，戴上手套，将包被抗体的硝酸纤维膜(NC)组装到塑料垫板上，要求其下边缘一定要对齐模具上的黑色标记线，并小心抹平膜面。将3.5cm宽的吸水纸紧靠模具上边缘组装到塑料垫板上，并小心抹平。将5mm×31cm的金标玻璃纤维膜紧靠标尺下边缘组装到塑料垫板上，并小心抹平。将1.9cm宽的样品垫紧靠模具下边缘组装到粘性底板上，并小心抹平。用切条机切成4.0mm宽的试纸，在装配区将切好的试纸合并0.5g干燥剂一包放入包装袋内。

测试例

图2为本发明检测试纸膜图，经对20份布鲁氏菌样本血清，分别用本发明试纸进行检测，结果阴性、阳性符合率均为100％。B：检测阳性结果；C：检测阴性结果。

Claims

1.一种动物布鲁氏菌抗原胶体金试纸膜检测试剂盒的制作方法，以动物布鲁氏菌单克隆抗体IgG作为金标抗体，以动物布鲁氏菌多克隆抗体IgG为检测线、羊抗鼠IgG为质控线制备胶体金试纸膜；

将B.abortus 544A和B.melitensis 16M布鲁氏菌单克隆抗体株4B8、2D10进行亲和纯化IgG，纯化后效价为1×10⁶以上，单抗亚型为IgG1、IgG3和IgG2b，亲和常数为1×10⁷～2.7×10⁸M^-1，抗体IgG含量为6.12mg/mL～8.45mg/mL，纯度为97.3％～99.5％，以此作为金标抗体；用纯化的B.abortus 544A和B.melitensis 16M制备多克隆抗体，经亲和层析柱纯化抗体IgG，纯化后IgG含量为13.12mg/mL～18.96mg/mL，且纯度达到98.5％～99.1％，多抗效价为1×10⁶以上，以此作为检测线包被抗体；利用羊抗鼠IgG为质控线抗体，组装成试纸膜。