CN101539574B - Survivin抗体的应用及以其制备的食管癌免疫层析检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明提供了Survivin抗体的应用，具体是其在制备食管癌免疫层析检测试纸条中的应用。本发明还提供了一种食管癌免疫层析检测试纸条，该试纸条包含硝酸纤维素膜层以及玻璃纤维膜层，所述硝酸纤维素膜层上设置T测试区和C质控区，测试区包被Survivin单克隆抗体或多克隆抗体，质控区包被二抗IgG；所述玻璃纤维膜层固定有胶体金标记的Survivin多克隆抗体或单克隆抗体。本发明同时提供应用所述试纸条进行食管癌免疫层析检测的方法。应用本单克隆抗体多克隆抗体发明的试纸条进行食管癌免疫层析检测具有无创性、操作简单、灵敏和取样容易等优点，可快速、直接、定性地检测样品中Survivin，可用于高发区人群食管癌的筛查。

Description

Survivin抗体的应用及以其制备的食管癌免疫层析检测试纸条

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及Survivin(存活素)抗体的应用，具体地说，是关于Survivin抗体在制备食管癌免疫层析检测试纸条中的应用以及所制备的食管癌免疫层析检测试纸条。

背景技术

食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，食管癌的发生与亚硝胺类化合物慢性刺激，炎症与创伤，遗传因素以及饮水、粮食和蔬菜中的微量元素含量有关。我国食管癌发病率很高，仅次于胃癌。在我国农村，食管癌是发病率最高的肿瘤。现已证实食管癌早期发现手术治疗切除率可达100％，5年生存率可达90％以上，但是目前就诊患者多数已达中晚期，远期疗效尚欠满意。因此，治疗食管癌的关键在于早期发现、早期诊断和早期治疗。早期发现、早期诊断食管癌主要依靠定期健康普查。

现有的对食管癌的检测、诊断方法主要包括食管拉网细胞学检查、内镜检查(例如消化内镜检查、食管腔内镜超声、色素内镜检查、荧光内镜检查)、影像学检查(例如计算机体层摄影术(CT)、磁共振成像(MRI))以及基于分子生物学标志物进行检测等。

目前在食管癌标志物的研究中，应用较多的方法为免疫组化和放射免疫测定。虽然食管癌肿瘤标志物的研究和报道较多，但是目前真正具有临床应用价值的标志物甚少。其中，肿瘤标志物CEA、CA199和CYFRA21-1等在食管癌的诊断、治疗效果预测和追踪复查具有一定的临床应用价值，但这些肿瘤标志物的敏感性不是很高(参见“食管癌肿瘤标志物检测的临床应用”，王永兴，苏伟，许建林，刘锦程，施常备，《现代肿瘤医学》2006年5月第14卷第5期；“五项肿瘤标志物联合检测对食管癌诊治的临床评价”，张爱敏，焦晓青，张鹏，《标记免疫分析与临床》2008年4月第15卷第2期)；近年来，一些文献研究报道了凋亡抑制基因Survivin(存活素)(Survivin最早是Ambrosini等(Nature Med.，1997，3(8)：917-921)在人类基因组库的杂交筛选中分离出来的，由约1.5×10³个碱基对组成，有4个外显子和3个内含子，定位于人染色体17q25。Survivin基因表达的蛋白是由142个氨基酸组成的胞质蛋白，分子质量16.5kD)的表达与食管癌之间的关联性(参见“食管癌组织中Survivin、P53、Ki-67和PCNA的表达及临床病理学意义”，戴天阳等，《中华现代外科学杂志》2008-6-13)，但目前并未见将Survivin基因作为食管癌肿瘤标志物临床应用于食管癌的检测技术；关于其他食管癌肿瘤标志物尚需更多的病例研究来证实和进一步寻找。另外，蛋白质组学实验技术结合计算机生物信息学分析及处理技术应用于食管癌特异相关蛋白的研究近期已初见报道，预计不久的将来可能会寻找到与食管癌相关的特异血清蛋白标志物，为食管癌的诊断、治疗和追踪复查提供简便快速和有价值的检查方法。

然而，以上对食管癌的检测中，各方法的检测操作均需要专业技术人员在专业的实验室进行，技术要求高，且设备比较昂贵，单个样品处理所需要的时间长，无法达到快速筛查的目的；另外，上述常用的食管癌检测方法包括基于分子生物学标志物的免疫组化和放射免疫等在取样时，病人或高发人群需要忍受一定的痛苦，不易顺从。上述关于食管癌的检测方法均不适合在普通人群中推广，更不利于在我国发病率高、患者人数多的广大的农村及偏远地区推广应用。

因此，目前迫切需要有新的低成本检测技术和设备来满足在全国尤其是食管癌高发区的普查。

发明内容

本发明的一个目的在于提供Survivin抗体在制备食管癌免疫层析检测试纸条中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种食管癌免疫层析检测试纸条。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述食管癌免疫层析检测试纸条进行食管癌免疫层析检测的方法。

一方面，本发明提供了Survivin抗体的新应用，具体是其在制备食管癌免疫层析检测试纸条中的应用。

胶体金技术在免疫层析快速诊断技术中已应用成熟，然而，目前并未见胶体金技术在食管癌的检测和诊断中的相关应用。本发明首次提出了Survivin抗体可用于制备一种食管癌免疫层析检测试纸条，并用于食管癌的早期筛查和疗效监测。

根据本发明的具体实施方案，所述Survivin抗体为抗人Survivin单克隆抗体和/或抗人Survivin多克隆抗体。本发明中，所述抗体可以商购获得，也可以按照现有技术中的记载方法(包括所属领域的常规操作，例如参见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor Lab(CSHL)Press，2001)中所述的方法)自行制备。例如，制备本发明的单克隆抗体的方法可以是：以蛋白或其片段作为抗原免疫动物(例如小鼠、豚鼠、鸡、兔、山羊、绵羊等动物)，取免疫动物的脾细胞作为能够产生抗体的浆细胞(免疫细胞)，与同系动物的骨髓瘤细胞进行融合。筛选能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，并进行单克隆化。根据本发明的优选具体实施方案，所述Survivin单克隆抗体为按照王友等人在“人Survivin基因克隆和单克隆抗体的研制及在肝癌中的表达”(中华检验医学杂志2006年3月第29卷第3期)中记载的方法制备得到。制备本发明的多克隆抗体的方法可以是：纯化Survivin蛋白或具有抗原性的片段，可被施用于动物(例如小鼠、豚鼠、鸡、兔、山羊、绵羊等动物)以诱导含有多克隆抗体的抗血清的产生，必要时在免疫时可加入佐剂，以增强免疫效果。为了使实验结果真实可靠，需要对抗血清进行纯化。抗血清纯化可使用常用的蛋白A/G结合法和抗原亲和纯化法。本发明在一具体实施例中制备和纯化了抗Survivin多克隆抗体，经证明纯化后的抗体具有很好的活性以及特异性。

根据本发明的具体实施方案，所述食管癌免疫层析检测试纸条是用于对待测样品中的Survivin进行检测。优选地，所述待测样品为血清或血浆。

另一方面，本发明提供了一种食管癌免疫层析检测试纸条，该试纸条包含硝酸纤维素膜层以及玻璃纤维膜层，其中，所述硝酸纤维素膜层上设置T测试区和C质控区，测试区包被Survivin单克隆抗体或多克隆抗体，质控区包被二抗IgG；所述玻璃纤维膜层固定有胶体金标记的Survivin多克隆抗体或单克隆抗体。

根据本发明的具体实施方案，所述试纸条还包括一些常规的设置部件，例如在试纸条两端分别设有作为加样区的玻璃纤维膜层、以及吸水滤纸，并可设置底板以支撑其上所设置的硝酸纤维素膜层、玻璃纤维膜层及吸水滤纸，所述底板例如可为硬纸底板。

根据本发明的具体实施方案，在本发明的食管癌免疫层析检测试纸条中，所述胶体金颗粒直径范围优选为10～35nm，更优选为15～35nm；所述Survivin多克隆抗体的标记浓度优选为10～35μg/ml，更优选为15～35μg/ml。

根据本发明的具体实施方案，在本发明的食管癌免疫层析检测试纸条中，所述硝酸纤维素膜上抗人Survivin单克隆抗体或多克隆抗体的浓度优选为0.4～1.5mg/ml，所述二抗IgG浓度优选为1～3mg/ml。

根据本发明的具体实施方案，在本发明的食管癌免疫层析检测试纸条中，所述二抗IgG优选为羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。

根据本发明的具体实施方案，在标记后胶体金应用时应调OD280值到0.40～1.00，30～70μl/cm。

另一方面，本发明还提供了应用所述食管癌免疫层析检测试纸条进行食管癌免疫层析检测的方法，该方法包括步骤：

1)取20～150μl、最优选100μl待检样品，将试纸条的底端(加样区)插入该管中；

2)在30分钟以内观察并记录实验结果，优选的观察时间为5～15min以内。

本发明是采用胶体金免疫层析技术双抗体夹心法原理检测样品中的Survivin，从待测样品中检测出是否存在Survivin，以便作为筛查和诊断食管癌的辅助参考参数。应用本发明的方法，在将试纸条插入待测样品如血浆或血清中，液体流向吸水滤纸的方向，当流到金标记物处时，金标抗体溶解，并与血浆或血清中的Survivin结合形成复合物。当金标抗Survivin抗体-抗原复合物继续前移时，在检测线与包被抗体结合，形成金标抗Survivin多克隆抗体-抗原-包被Survivin单克隆抗体复合物而凝聚显色，在质控线处形成金标抗Survivin多克隆抗体-包被二抗复合物而显色，如质控线未显色则表明该试剂无效。

应用本发明的食管癌免疫层析检测试纸条进行检测时，检测结果的判定如下：

阳性结果：在试纸条的测试区和质控区位置上各出现一条紫红色条带。

阴性结果：仅试纸条的质控区位置上出现一条紫红色条带。

无效结果：在试纸条的检测线和质控线位置上均未出现紫红色条带。

应用本发明的食管癌免疫层析检测试纸条进行食管癌免疫层析检测，操作简单，诊断速度快，取样容易，可快速、直接、定性地检测待测样品中Survivin，本发明的技术作为一种无创简易检测手段，适合于地方特别是高发区人群的筛查。本发明具有如下突出优点：

(1)敏感性好，特异性高而又无创伤性，可检测待测样品如血清或血浆中的Survivin，标本用量只需100μl，可以检测到纳克级Survivin，适用于多种场合检测，发明人通过利用本发明的试纸条对大量食管癌患者及健康人群的血清样品进行实际应用检测，在具有统计学意义的条件下，食管癌患者的检出率可达到51％以上，尤其在对69岁以上老年人进行检测时，阳性率可达到63.9％以上。

(2)检测速度快，成本低，可在5分钟内出结果，操作简便快捷，适用于食管癌肿瘤的流行病学调查辅助检测、筛选食管癌检查适合人群(即用该试纸条找出高度可疑的食管癌患者)和疗效监测。

本发明的食管癌免疫层析检测试纸条对于在全国特别是广大农村基层或食管癌高发区推广健康普查具有重大意义。

附图说明

图1为本发明一具体实施例的食管癌胶体金免疫层析检测试纸条的结构示意图。

图2为本发明一具体实施例中应用本发明的食管癌胶体金免疫层析检测试纸条对血清的测试结果。图中，从左至右分别显示对食管癌病人1、食管癌病人2、健康人3、健康人4的血清的检测结果。

图3为本发明另一具体实施例中应用本发明的另一食管癌胶体金免疫层析检测试纸条对血清的测试结果。图中，从左至右分别显示对食管癌病人5、食管癌病人6、健康人7、健康人8的血清的检测结果。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

实施例1

本实施例中提供了一种Survivin胶体金免疫层析检测试纸条，请参见图1所示，本实施例的试纸条设有硬纸底板5，在底板5上从左到右依次设有吸血清玻璃纤维膜层4(作为加样区)、固定有抗人Survivin多克隆抗体的玻璃纤维膜层3、硝酸纤维素膜2和吸水滤纸1。各层被依次交错粘贴在硬纸底板5上组装而成本实施例的Survivin胶体金免疫层析检测试纸条。

其中，硝酸纤维素膜2的尺寸为：长10cm，宽2.5cm。在硝酸纤维素膜2上设有T测试区和C质控区，所述测试区T是标有抗人Survivin单克隆抗体的区带，Survivin单克隆抗体浓度约1.0mg/ml；所述质控区C是标有羊抗兔二抗IgG的区带，二抗浓度2mg/ml。

玻璃纤维膜层3上固定有胶体金标记的抗人Survivin多克隆抗体，所述胶体金颗粒直径20nm，所述抗体的标记浓度15μg/ml。胶体金标记抗人Survivin多克隆抗体的操作参照所属领域的常规技术进行，其中，在标记后胶体金应用到玻璃纤维磨层上时应调OD280值到0.625，其在玻璃纤维磨层上的应用量为50μl/cm。

该Survivin胶体金免疫层析检测试纸条在制备过程中所用的抗Survivin单克隆抗体为发明人按照王友等人在“人Survivin基因克隆和单克隆抗体的研制及在肝癌中的表达”(中华检验医学杂志2006年3月第29卷第3期)中记载的方法制备得到，其中所用各实验材料均可商购获得，在此通过引证的方式将该文献的全部内容合并于此，而不再对具体的制备方法进行赘述；该单克隆抗体效价1∶12800；

抗Survivin多克隆抗体：按照以下方法制备：由北京大学医学部第一附属医院实验动物室购得1只新西兰雌兔，2.5KG，第一次用弗氏完全佐剂等体积混合约1mg PMS-Survivin融合蛋白，选取背部五点注射，第一次免疫前耳缘静脉取血作为阴性对照。两周后第二次免疫，1mg PMS-Survivin融合蛋白等体积弗氏不完全佐剂混合，背部五点注射。四周后进行第三次免疫，第三次免疫时0.5mg PMS-Survivin融合蛋白等体积弗氏不完全佐剂混匀，背部五点注射。一周后静脉插管取血并分离血清，分装后-80℃保存。使用前用ProteinA-Sepharose-4B纯化柱(购自GE公司)纯化。该多克隆抗体效价1∶6400；

二抗：羊抗兔干粉，购自鼎国生物技术有限公司，按2mg/ml稀释使用，效价约1∶2000；

其他材料和试剂如所用的底板、硝酸纤维素膜(NC膜)、玻璃纤维和金子稀释液干粉、氯金酸等均商购获得。

应用本实施例的试纸条进行食管癌免疫层析检测时，可按照以下操作进行：

先取100μl待检样品于EP管中，将试纸条的底端(吸血清玻璃纤维膜层4)插入EP管中，在30分钟内通常在15分钟内甚至更短时间即可观察并记录实验结果。

检测结果的判定如下：

阳性结果：在试纸条的测试区和质控区位置上各出现一条紫红色条带。

阴性结果：仅试纸条的质控区位置上出现一条紫红色条带。

无效结果：在试纸条的检测线和质控线位置上均未出现紫红色条带。

在检测时应注意以下事项：

1)被检样品在室温(20℃左右)平衡并在该条件下检测。要求被检样品为新鲜样品。样品收集后应1小时测定保证结果的可靠性。

2)本试纸条仅供体外检测粗筛，不能作为确认试剂，阳性结果必须进行确证实验。

3)30分钟后观察结果无效。

4)试纸条应避光保存。

实施例2

从北京肿瘤医院检验科取2例经病理确诊的食管癌患者血清各100μl，另取2例体检健康血清各100μl作为对照，取血后马上应用实施例1的Survivin胶体金免疫层析检测试纸条进行检测。其中，2例食管癌患者血清的检测中，在将试纸条的底端(吸血清玻璃纤维膜层4)插入EP管中的待测血清中后，约1.5分钟在质控线和检测线处都各出现了紫红色条带；而2例健康人血清的检测中，在将试纸条的底端(吸血清玻璃纤维膜层4)插入EP管中的待测血清中后，约1.5分钟在质控线出现了紫红色条带，而在检测线处30分钟内仍无反应(结果请参见图2所示)。说明本发明的试纸条具有敏感性好、检测速度快的特点。

实施例3

本实施例的Survivin胶体金免疫层析检测试纸条中，所述测试区T是标有抗人Survivin单克隆抗体的区带，Survivin单克隆抗体的浓度0.6mg/ml；所述质控区C是标有羊抗兔二抗IgG的区带，二抗浓度2mg/ml；玻璃纤维膜层3上固定的胶体金标记的抗人Survivin多克隆抗体中，抗体的标记浓度为15μg/ml，所述胶体金颗粒直径20nm，在标记后胶体金应用时调OD280值到0.8，应用浓度50μl/cm。该试纸条的其他参数和结构以及制备方法同实施例1。

应用本实施例的Survivin胶体金免疫层析检测试纸条，从北京肿瘤医院检验科取2例经病理确诊的食管癌患者血清各100μl，另取2例体检健康血清各100μl作为对照，取血后马上应用本实施例的Survivin胶体金免疫层析检测试纸条进行检测。其中，2例食管癌患者血清的检测中，在将试纸条的底端(吸血清玻璃纤维膜层4)插入EP管中的待测血清中后，约1.5分钟在质控线和检测线处都各出现了紫红色条带(结果请参见图3所示，其中检测线处的紫红色条带虽不如图2中清晰，但仍能辨识)；而2例健康人血清的检测中，在将试纸条的底端(吸血清玻璃纤维膜层4)插入EP管中的待测血清中后，约1.5分钟在质控线出现了紫红色条带，而在检测线处30分钟内仍无任何反应。说明本发明的试纸条具有敏感性好、检测速度快的特点。

Claims (4)

1.Survivin抗体在制备用于对血清或血浆中的Survivin进行检测的食管癌免疫层析检测试纸条中的应用；其中：

所述试纸条包含硝酸纤维素膜层以及玻璃纤维膜层；

所述硝酸纤维素膜层上设置T测试区和C质控区，测试区包被Survivin单克隆抗体或多克隆抗体，质控区包被二抗IgG，所述硝酸纤维素膜上Survivin单克隆抗体或多克隆抗体的浓度为0.4～1.5mg/ml，所述二抗IgG浓度为1～3mg/ml；

所述玻璃纤维膜层固定有胶体金标记的Survivin多克隆抗体或单克隆抗体；所述玻璃纤维膜层中，胶体金颗粒直径范围10～35nm，所述Survivin多克隆抗体或单克隆抗体的标记浓度为10～35μg/ml；玻璃纤维膜层上的标记Survivin多克隆抗体或单克隆抗体的胶体金OD280值为0.40～1.00，用量为30～70μl/cm。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述Survivin抗体为抗人Survivin单克隆抗体和/或抗人Survivin多克隆抗体。

3.一种用于对血清或血浆中的Survivin进行检测的食管癌免疫层析检测试纸条，该试纸条包含硝酸纤维素膜层以及玻璃纤维膜层，其中，

所述硝酸纤维素膜层上设置T测试区和C质控区，测试区包被Survivin单克隆抗体或多克隆抗体，质控区包被二抗IgG，所述硝酸纤维素膜上Survivin单克隆抗体或多克隆抗体的浓度为0.4～1.5mg/ml，所述二抗IgG浓度为1～3mg/ml；

所述玻璃纤维膜层固定有胶体金标记的Survivin多克隆抗体或单克隆抗体；所述玻璃纤维膜层中，胶体金颗粒直径范围10～35nm，所述Survivin多克隆抗体或单克隆抗体的标记浓度为10～35μg/ml；玻璃纤维膜层上的标记Survivin多克隆抗体或单克隆抗体的胶体金OD280值为0.40～1.00，用量为30～70μl/cm。

4.根据权利要求3所述的食管癌免疫层析检测试纸条，其中，所述二抗IgG为羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。

Images