CN102181401B - 存活素酶联免疫试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种杂交瘤细胞株BCHJYS10，其保藏号为CGMCC No.4574。本发明还提供了由所述的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，以及含有所述单克隆抗体或生物素标记的所述单克隆抗体的存活素(Survivin)酶联免疫试剂盒。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测存活素的方法。本发明提供的检测膀胱癌患者尿中的存活素的酶联免疫试剂盒的方法操作简便，费用低廉，诊断灵敏，可直接定量且方便地检测膀胱癌中存活素，适合于具有无痛性血尿症状，膀胱癌人群的辅助诊断及膀胱癌术后复发的监测。

Description

存活素酶联免疫试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种Survivin酶联免疫试剂盒及其在膀胱癌患者尿Survivin检测中的应用。

背景技术

膀胱癌是国内泌尿系统中最常见恶性肿瘤，90％以上为移行上皮癌，其中约70％为表浅性，20％为浸润性，早期诊断较困难，5％确诊时已发生转移。膀胱癌诊治后容易复发，且复发肿瘤恶性度增加，故治疗后需终身严密的随访。

目前膀胱镜检查及可疑病变处活检仍是膀胱癌诊断和随访的金标准。但是膀胱镜检查会带给患者创伤且检测费用昂贵，同时细胞学检查敏感性低，尽管其特异性能到达94％而相应的敏感性只有35％。细胞学检测的低灵敏性与膀胱镜检的侵入性使得人们对一些非浸入性诊断方法产生了较大兴趣。在过去的的几十年，生物标志物的发展给我们带来了一些新的膀胱癌检测与随访的方法。

Survivin是1997年Altieri等在研究效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell protease receptor-1，EPR-1)cDNA，在人类基因组库中筛选克隆时首先被发现，因其具有强大的抗细胞凋亡功能，被命名为“存活素或生存素”。

Survivin作为一种新型的肿瘤标志物，有报道在膀胱癌的诊断中有比较好的敏感性与特异性，但未完全证实。

目前对Survivin检测方法主要有RT-PCR，Real-time PCR及酶联免疫(ELISA)。RT-PCR虽然灵敏，但容易污染。它只是一种定性的检测，且操作繁琐。Real-time PCR采用独特封闭反应，减少了污染，可靠性高，且操作时间短，但该检测的设备与试剂昂贵限制了它的使用与普及。ELISA以抗体包被微孔板的形式，具有灵敏度高，费用低，大通量，在肿瘤标志物的检测中使用比较常见。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种存活素(Survivin)单克隆抗体，酶联免疫试剂盒及其在膀胱癌尿检中的应用。

本发明提供的存活素单克隆抗体是由杂交瘤细胞株BCHJYS10产生的，是通过大肠杆菌制备的Survivin蛋白，再用纯化的蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠，然后筛选出的杂交瘤细胞株。本发明提供的杂交瘤细胞株BCHJYS10，已于2011年01月29号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号为CGMCCNo.4574。

本发明还提供含有所述的杂交瘤细胞株BCHJYS10产生的单克隆抗体或生物素标记的所述的单克隆抗体的Survivin酶联免疫试剂盒。

本发明提供的Survivin的酶联免疫试剂盒，它还包括：酶标板、存活素标准品、酶标二抗或酶标亲和素、存活素多克隆抗体或生物素标记的多克隆抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、稀释液；其中，包被酶标板所用的缓冲液为0.02～0.05mol/L的碳酸缓冲液，pH值为9.1～9.9；所用的封闭液为含有1～100mg/ml脱脂奶粉的PBS溶液。

本发明所述的试剂盒中特异性抗体为Survivin单克隆抗体或多克隆抗体，浓度为0.1～20μg/ml，优选为1～5μg/ml；生物素标记的Survivin单克隆抗体或多克隆抗体的浓度为0.1～20μg/ml，优选为1～5μg/ml。

本发明所述的试剂盒中，用于标记的生物素与单克隆抗体或多克隆抗体按质量比1∶1～4结合，优选为1∶2。

本发明所述的试剂盒中生物素标记的抗体是按照如下方式制备的：

1)将NHS-Biotin(N-羟基丁二酰亚胺酯化生物素)5mg溶于0.5ml DMSO中，最终浓度为10mg/ml；

2)浓度在1mg/ml以上的单抗或多抗，标记前在碳酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH8.2-8.6)中充分透析。4℃1-2h，1L碳酸缓冲液，可搅拌；

3)biotin与单抗或多抗的质量比为1∶2，即1mg单抗或多抗加入500μg的生物素酯(NHS-Biotin-DMSO液50μl)混匀后，室温避光旋转混匀4小时；

4)以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。

本发明所述的试剂盒，当Survivin单抗作为包被抗体时，Survivin多抗或生物素标记的Survivin多抗作为捕获抗体；当Survivin多抗作为包被抗体时，Survivin单抗或生物素标记的Survivin单抗作为捕获抗体。

本发明所述的试剂盒中，当捕获抗体为存活素单克隆抗体或多克隆抗体时含有酶标二抗；当捕获抗体为生物素标记的存活素单克隆抗体或多克隆抗体时含有酶标亲和素。

本发明所述试剂盒中所用稀释液为含有50mg/ml脱脂奶粉和0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液，所用洗涤液为含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液。其中的脱脂奶粉和Tween-20能减少非特异性吸附，同时Tween-20能增加抗原抗体的相互作用而增加灵敏性。

本发明酶标板的制备过程：用包被液将Survivin的单克隆抗体或多克隆抗体稀释到1～5μg/ml，每孔加入100μl。置于4℃16小时后再倾去包被液体，用洗涤液体洗涤三次，每次1分钟，拍干。然后每孔加入200ul的封闭液37℃温育1小时，倾去孔内液体拍干备用。

在本发明的一个实施方案中，当所述的酶标二抗或酶标生物素所用的酶为辣根过氧化物酶时，所述的显色液为含有四甲基联苯胺(TMB)的pH为5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液。优选按如下配方配制：10mgTMB+1ml DMSO+99ml 0.1M pH5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液+11μl 30％(v/v)双氧水比例配制。

本发明所述试剂盒的终止液为12.5％(v/v)的硫酸。

本发明中单克隆抗制备的过程为：

用上述免疫原免疫Balb/c雌性小鼠，再将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤融合，经过多次亚克隆，筛选到能稳定分泌Survivin单克隆抗体的杂交瘤细胞。选择其中一株较好的交瘤细胞株BCHJYS10，采用体内诱生腹水法，挑选经产Balb/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油，向预处理后的小鼠腹腔注射阳性克隆杂交瘤细胞，待7-10天后，小鼠腹部明显增大，刺穿腹腔，采集腹水。将腹水离心，弃脂肪层和细胞层，收集中间的澄清层，-70℃保存备用。用质量分数为35％的饱和硫酸铵盐析法粗提细胞培养上清和腹水，最后用HiTrap Protein G HP免疫层析法进一步纯化，获得纯化的Survivin单克隆抗体。

使用本发明的试剂盒检测的一种实施方式为：包被抗体为Survivin单克隆抗体，加入待测尿标本(膀胱癌患者或正常人的尿)或标准Survivin蛋白，温育，洗涤后加入Survivin多抗。再温育，洗涤后再加入辣根过氧化酶标记的二抗。再温育，洗涤液洗涤后加入底物液显色，终止然后用酶标仪检测OD₄₅₀的读数。

使用本发明的试剂盒检测的另一种实施方式为：包被抗体为Survivin单克隆抗体，加入待测尿标本(膀胱癌患者或正常人的尿)或标准Survivin蛋白，温育，洗涤后加入生物素标记的Survivin多抗。再温育，洗涤后再加入辣根过氧化酶标记的亲和素。再温育，洗涤液洗涤后加入底物液显色，终止然后用酶标仪检测OD₄₅₀的读数。

使用本发明的试剂盒检测的另一种实施方式为：包被抗体为Survivin多克隆抗体，加入待测尿标本(膀胱癌患者或正常人的尿)或标准Survivin蛋白，温育，洗涤后加入Survivin单抗。再温育，洗涤后再加入辣根过氧化酶标记的二抗。再温育，洗涤液洗涤后加入底物液显色，终止然后用酶标仪检测OD₄₅₀的读数。

使用本发明的试剂盒检测的又一种实施方式为：包被抗体为Survivin多克隆抗体，加入待测尿标本(膀胱癌患者或正常人的尿)或标准Survivin蛋白，温育，洗涤后加入生物素标记的Survivin单抗。再温育，洗涤后再加入辣根过氧化酶标记的亲和素。再温育，洗涤液洗涤后加入底物液显色，终止然后用酶标仪检测OD₄₅₀的读数。

本发明的结果分析：设立标准品浓度为0μg/ml为阴性对照，最后只有显色底物与终止液，而无其它抗原抗体成份的孔作为空白凋零孔。读数时以空白调零孔进行调零，读数。健康人群尿标本测试读数的均值的加上二倍的标准差作为阈值(cutoff值)，当大于其值定义为阳性，而小于其值则判为阴性。同时通过标准蛋白可算出所测标本中Survivin蛋白的含量。整个过程半天可以完成，最低检测限为0.0625ng/ml。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的试剂盒具备较好的敏感性及特异性，可以检测到皮克级Survivin。所用设备简单，可适合基层医院的使用。其膀胱癌患者的检出率可达到70.6％，特异性达到89.2％。

(2)本发明的试剂盒为无创检测且性能较稳定，另外所用标本用量少，只需100μl。

(3)检测灵敏，成本低，可在半天内出结果，操作简便且同时对几十例标本同时检测。适用于具有无痛性血尿患者的辅助诊断，筛选膀胱癌人群，及治疗后的动态监测。

附图说明

图1为Survivin酶联免疫反应的结构示意图。

图2为实施例8绘制的Survivin蛋白标准曲线。

图3为Survivin对患者与正常人尿ELISA检测OD₄₅₀读数的受试特征曲线图。

图4为在OD₄₅₀的cutoff值＝0.091对应的敏感性与1-特异性。

图5为膀胱癌与正常人群尿标本中Survivin检测读数。其中，0组代表正常人群的OD₄₅₀，1组代表膀胱癌人群OD₄₅₀。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

实施例1Survivin抗原的合成

首先利用Survivin特异引物(上游引物为5’-AAAGAATTCGGCATGGGTGCCCCGACGT-3’下游引物为5’-AAATCTAGATCAATCCATGGCAGCCAGCT-3’)，通过RT-PCR从人乳腺癌细胞株MCF-7中扩增人Survivin分子的cDNA全长。将Survivin基因定向克隆于原核高效表达载体Pms-31b，转化大肠杆菌POP2136经过42℃热诱导获得MS₂-Survivin融合蛋白。然后电泳，切胶回收，透析得到纯化的蛋白。

实施例2Survivin单克隆抗体制备

将实施例1纯化的MS₂-Survivin融合蛋白，每次50μg(1μg/μl)MS₂-Survivin抗原和等体积完全弗氏佐剂混合，充分乳化后200μl/只腹部注射Balb/c雌性小鼠，此后抗原浓度为0.5μg/μl与不完全弗氏佐剂混匀乳化，按200μl/只小鼠背部多点注射。三周后进行第一次加强，以后每隔2周加强免疫一次，每次免疫后第7天取尾血，用ELISA法检测抗体效价。当抗体效价达到10^-4左右时，3周后腹腔注射抗原加强免疫，注射量为200μl/只(抗原浓度为0.4μg/μl)，但不加佐剂，连续注射三天，于第四天取脾细胞与SP2/0骨髓瘤融合，再经过4次亚克隆，筛选到能稳定分泌Survivin单克隆抗体的杂交瘤细胞BCHJYS10。通过体外培养法，收集细胞培养上清，经离心后去除细胞碎片，上清液-20℃保存备用。体内诱生腹水法，挑选经产Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷0.5mL/只。一周后，腹腔注射杂交瘤细胞，2.5×10⁶细胞/只小鼠，7-10天后小鼠腹部显著膨隆后，收集腹水。将腹水离心，弃脂肪层和细胞层，收集中间的澄清层，-20℃保存备用。用质量分数为35％的饱和硫酸铵盐析法粗提细胞培养上清和腹水，最后用HiTrap Protein G HP免疫层析法进一步纯化，获得较纯的Survivin单克隆抗体。

实施例3Survivin多克隆抗体制备

将实施例1纯化的MS₂-Survivin融合蛋白免疫新西兰白兔，2个月后处死后取其血，通过质量分数为35％的硫酸铵沉淀法得到初步纯化多抗，然后通过免疫层析的方法得到高纯度的多抗。

实施例4含生物素标记的多抗的Survivin酶联免疫试剂盒的组建

组建Survivin酶联免疫试剂盒，其包含下述组分：

(1)包被实施例2制备的Survivin单克隆抗体的酶标板，其中Survivin单克隆抗体的浓度为2.5μg/ml

(2)Survivin标准品，浓度分别为0ng/ml，0.0625ng/ml，0.125ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml，2.0ng/ml，4.0ng/ml。

(3)生物素标记的抗Survivin的兔多抗(浓度为5ug/ml)

(4)用辣根过氧化酶标记亲和素(购自北京西美杰公司)

(5)底物显色液，10mgTMB+1ml DMSO+99ml 0.1M pH5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液+11μl 30％(v/v)双氧水比例配制。

(6)终止液为12.5％(v/v)的硫酸。

(7)洗涤液为含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液。

(8)稀释液为含有50mg/ml脱脂奶粉及0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液。

实施例5含生物素标记的单抗的Survivin酶联免疫试剂盒的组建

组建Survivin酶联免疫试剂盒，其包含下述组分：

(1)包被实施例3制备的Survivin多克隆抗体的酶标板，其中多克隆抗体的浓度为5μg/ml

(2)Survivin标准品，浓度分别为0ng/ml，0.0625ng/ml，0.125ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml，2.0ng/ml，4.0ng/ml。

(3)生物素标记的抗Survivin的单抗(浓度为2.5μg/ml)

(4)用辣根过氧化酶标记亲和素(购自北京西美杰公司)

(5)底物显色液，10mgTMB+1ml DMSO+99ml 0.1M pH5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液+11μl 30％(v/v)双氧水比例配制。

(6)终止液为12.5％(v/v)的硫酸。

(7)洗涤液为含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液。

(8)稀释液为含有50mg/ml脱脂奶粉及0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液。

实施例6含辣根过氧化酶标记二抗，单抗包被Survivin酶联免疫试剂盒的组建

组建Survivin酶联免疫试剂盒，其包含下述组分：

(1)包被实施例2制备的Survivin单克隆抗体的酶标板，其中Survivin单克隆抗体的浓度为2.5μg/ml。

(2)Survivin标准品，浓度分别为0ng/ml，0.0625ng/ml，0.125ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml，2.0ng/ml，4.0ng/ml。

(3)实施例3制备的抗Survivin的兔多抗(浓度为5μg/ml)

(4)用辣根过氧化酶标羊抗兔的二抗(购自北京西美杰公司)

(5)底物显色液，10mgTMB+1ml DMSO+99ml 0.1M pH5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液+11μl 30％(v/v)双氧水比例配制。

(6)终止液为12.5％(v/v)的硫酸。

(7)洗涤液为含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液。

(8)稀释液为含有50mg/ml脱脂奶粉及0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液。

实施例7含辣根过氧化酶标记二抗，多抗包被Survivin酶联免疫试剂盒的组建

组建Survivin酶联免疫试剂盒，其包含下述组分：

(1)包被实施例3制备的Survivin多克隆抗体的酶标板，其中Survivin多克隆抗体的浓度为5μg/ml。

(2)Survivin标准品，浓度分别为0ng/ml，0.0625ng/ml，0.125ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml，2.0ng/ml，4.0ng/ml。

(3)实施例2制备的Survivin单克隆抗体(2.5μg/ml)

(4)用辣根过氧化酶标羊抗兔的二抗(购自北京西美杰公司)

(5)底物显色液，10mgTMB+1ml DMSO+99ml 0.1M pH5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液+11μl 30％(v/v)双氧水比例配制。

(6)终止液为12.5％(v/v)的硫酸

(7)洗涤液为含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液。

(8)稀释液为含有50mg/mlm)脱脂奶粉及0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液。

实施例8酶联免疫方法的建立

酶联免疫具体步骤如下，其示意图如图1所示：

(1)用pH 9.6的碳酸缓冲液稀释Survivin鼠单抗到浓度为2.5μg/ml，4℃包被16小时。

(2)洗涤：甩净包被液，用0.05％(v/v)PBST洗涤三次，每次中间静置一分钟后在吸水纸上拍干。

(3)封闭：每孔用封闭液200μl于37℃水浴箱封闭一小时，

(4)洗涤如前。

(5)加样：加入100μl浓度以4ng/ml开始倍比稀释的Survivin蛋白作为标准品，同时设立阴性，空白对照孔。37℃水浴箱1.5小时。

(6)洗涤如前。

(7)加入检测抗体：加入0.05％(v/v)PBST稀释终浓度为2.5μg/ml的的Survivin兔多抗，37℃水浴箱1.5小时

(8)洗涤如前。

(9)加酶标二抗：加入以50mg/ml脱脂奶粉-PBS 1∶3000稀释的酶标羊抗兔100μl，37℃水浴箱1.5小时。

(10)洗涤方法如前，但洗涤次数增加至四次。

(11)加入底物显色，读数：TMB，双氧水，显色缓冲液配制底物后，每孔加入100μl，37℃显色10分钟，再用12.5％(v/v)硫酸终止OD₄₅₀。以空白调零孔作为对照读数。最后根据OD₄₅₀的读数，绘制出Survivin蛋白的标准曲线。

实施例9试剂盒稳定性实验

将实施例6的试剂盒进行稳定性实验

(1)批内差异：从同一板上测定28个孔，标准蛋白浓度都为1ng/ml，最后测定的OD₄₅₀读数在下表中：

表1同一酶标板28个不同孔的检测

表2批内差异

通过上述实验，可以得出试剂盒的批内差异为8.34％，小于15％的规定，批内稳定性比较好。

(2)从不同的批次测定得到批间差异。具体操作同上，最后测定批间蛋白浓度均为4ng/ml的OD₄₅₀读数。

表3对十个批次的酶标板的不同检测

表4批间差异

通过上述实验，可以得出试剂盒的批间差异为14.27％，小于15％的规定，批间稳定性比较好。

同理对实施例4～5以及实施例7的试剂盒也进行稳定性实验，结果表明稳定也很好。

实施例10

2009年3月～2010年7月北京肿瘤医院病理确诊的BTCC(bladder transitional cell carcinoma膀胱移形性细胞癌)患者103例(男64例，女39例，平均年龄62.5岁)102例健康体检者(男64例，女38例，平均年龄54.3岁)

采用实施例6的试剂盒以及实施例8建立的方法进行检测，最后所测标本OD450值读数见图5，0组代表正常人所测读数，1组代表膀胱癌患者所测OD450值。其中在cutoff值为0.091时，膀胱癌患者的检出率可达到70.6％，特异性达到89.2％，图3所示为本实例检测的ROC(受试特征曲线图)，其面积为0.849，反映了本方法有较好的实用意义。通过设置不同的cutoff值，而得到不同检测敏感性与特异性，且最佳cutoff值为0.091(图4)。通过对比试验发现，本发明提供的试剂盒所得结果与其它商品化试剂盒相比，检出率和特异性更好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种杂交瘤细胞株BCHJYS10，其保藏号为CGMCC No.4574。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生的存活素单克隆抗体。

3.含有权利要求2所述的单克隆抗体或生物素标记的权利要求2所述的单克隆抗体的存活素酶联免疫试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶标板、存活素标准品、酶标二抗或酶标亲和素、底物显色液、终止液、洗涤液、稀释液；其中，包被酶标板所用的缓冲液为0.02～0.05mol/L的碳酸缓冲液，pH值为9.1～9.9；所用的封闭液为含有1～100mg/ml脱脂奶粉的PBS溶液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的存活素单克隆抗体的浓度为0.1～20μg/ml；所述的生物素标记的存活素单克隆抗体的浓度为0.1～20μg/ml。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述的稀释液为含有质量体积比1～100mg/ml脱脂奶粉和体积比为0.05%Tween-20的PBS溶液或生理盐水溶液；所述的洗涤液为含有体积比为0.05% Tween-20的PBS溶液；所述的存活素的标准蛋白浓度分别为0ng/ml,0.0625ng/ml,0.125ng/ml,0.25ng/ml,0.5ng/ml,1.0ng/ml,2.0ng/ml,4.0ng/ml；所述的终止液为体积比为12.5%的硫酸。

7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，当所述的酶标二抗或酶标亲和素的酶为辣根过氧化物酶时，显色液为含有四甲基联苯胺的pH为1～9的柠檬酸-磷酸缓冲液。

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