CN104155457B

CN104155457B - 一种结直肠癌相关“多肽-蛋白组合式标志物”检测试剂盒

Info

Publication number: CN104155457B
Application number: CN201410418610.3A
Authority: CN
Inventors: 魏开华; 侯利平; 孙云波; 宋纯艳; 杨保安; 周婷婷; 甄蓓; 刘曙晨; 郑俊杰
Original assignee: BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER; Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER; Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2014-08-22
Filing date: 2014-08-22
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2034-08-22
Also published as: CN104155457A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种结直肠癌相关“多肽‑蛋白组合式标志物”检测试剂盒。该试剂盒含有捕获抗体和检测抗体，捕获抗体与蛋白HKa特异性结合，检测抗体与多肽HKP15或多肽HKP09特异性结合。本发明所提供的试剂盒，对HKP09/HKP15‑HKa组合式标志物的线性检测范围为6ng/mL～120ng/mL，最低检测限为1.7ng/mL，区分结直肠癌样本和正常人样本的检测灵敏度为93.7％，特异性为92.7％。本发明所提供的试剂盒所检全新组合式标志物与结直肠癌密切相关，且检测技术具有很高的准确度和灵敏度，操作简便快捷，利于高通量地临床检测，并能降低检测成本。

Description

一种结直肠癌相关“多肽-蛋白组合式标志物”检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种结直肠癌相关“多肽-蛋白组合式标志物”检测试剂盒。

背景技术

结直肠癌，即大肠癌(Colorectal Carcinoma，简称CRC)，包括结肠癌和直肠癌，是消化道常见恶性肿瘤，在经济发达的国家如北美、西欧、澳大利亚、新西兰等国发病率较高，而在经济迅速崛起的国家和地区发病率也在迅速上升。因此，结直肠癌的早期诊断及相关诊断标志物的发掘是目前亟待解决的问题。

结直肠癌常用的筛查手段包括大便潜血试验、乙状结肠镜检查、全结肠镜检查和钡灌肠检查等。目前主要的诊断方式为结肠镜，CT仿真扫描，和病理学切片，这些方法存在对受检人群带来创伤、受检耐受性差及成本较高等问题。随着研究的深入和相关检查技术的发展，血清中的某些生物标志物，如蛋白、多肽、核酸等，不断发掘出可作为结直肠癌早期诊断的潜在标志物。目前已报道的结直肠癌血清标志物多为蛋白类，且逐渐暴露出一些弊端，如CEA检测试剂盒作为参考诊断试剂盒，敏感性约60％，特异性只有近20％左右，并且只对结直肠癌的复发及转移有参考价值，主要作为临床观察结直肠癌疗效的指标之一。因此，开发特异性和灵敏度更高的血清标志物及相关检测产品，无疑具有积极的创新价值和实用价值。

近年来，生物标志物联检在肿瘤的早期诊断中的应用研究得到很大重视。目前，被人们所认可的生物标志物多为血清蛋白标志物，也有少量解离的多肽标志物。如通过联检甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清铁蛋白(SF)等可显著提高肝癌诊断的阳性率。但是，蛋白标志物普遍存在疾病敏感性不强的问题。而由于解离的多肽标志物分子量小、抗原表位少，免疫原性低，存在着检测成本高、操作复杂的问题，难以单独开发成高特异性的检测标志物。值得注意的是，随着肿瘤的发生发展，会直接影响到机体某些代谢功能的絮乱，从而打破某些代谢通路中的蛋白和多肽的降解平衡，势必影响到蛋白和多肽在血清、血浆、淋巴液、尿液等体液中的存在形势和含量关系等，由此，尝试将多肽与其前体蛋白联合起来，建立一种全新的标志物联检模式，或许可以成为获取高特异性和高灵敏度肿瘤标志物的突破口。

激酶通路已广泛报道与肿瘤的代谢异常有密切关联性。激酶通路中的高分子量激肽原(High Molecular Weight Kininogen.缩写为HWMK或HK)是血浆中的一种糖蛋白，分子量120 kDa，其分子可划分为6个结构域，其中D1、D2和D3组成分子的重链，D4含有缓激肽肽段，D5和D6区组成分子的轻链。HK被激肽释放酶活化，释放D4区的缓激肽并产生双链高分子激肽原(HKa)。HKa的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。HK转变为HKa后，发生较大的构像变化，使D5区暴露更加明显，D5是HKa的活性中心，发挥HKa的主要作用，如介导炎症反应、抑制血管内皮细胞增殖及转移、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的生长与转移等。目前，有研究报道HKa蛋白可用于肿瘤早期诊断。

但是，目前对于新型的“多肽-蛋白组合式标志物”仍鲜有研究，因此，研制一种能够用于多肿瘤检测的组合式标志物检测试剂盒是十分必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种结直肠癌相关“多肽-蛋白组合式标志物”检测试剂盒，该试剂盒能够实现对结直肠癌患者血清中HKP09/HKP15-HKa的灵敏和准确检测。

蛋白HKa和多肽HKP09、多肽HKP15同属于激肽释放酶—激肽系统(Kallikrein—Kinin system，KKS)代谢通路。本发明通过实验发现，多肽标志物HKP15和HKP09由HKa代谢产生。具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽标志物位于HKa蛋白的D4区，具体位于HKa蛋白的381～389位氨基酸，命名为HKP09。具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽标志物位于HKa蛋白的D5区，具体位于497～511位氨基酸，命名为HKP15。HKP09和HKP15即为HKa降解，多肽HKP09和HKP15以未完全解离的形式存在于HKa表面。采用多肽及其前体蛋白两种特异性抗体，对HKP15/HKP09-HKa标志物进行定量检测，或许可以更精确的反映样品中标志物的表达情况，更加精确的区分肠癌样品与正常人样品。

本发明提供的“多肽-蛋白组合式标志物”的关键是前体蛋白结构中的特定多肽与对应的游离型的特定多肽序列结构完全一致、免疫特性一致，多肽自然存在于前体蛋白表面，是前体蛋白的一个重要结构域，多肽和蛋白互不干扰各自的免疫学特异性结合位点。本发明提供的“多肽-蛋白组合式标志物”首次将激酶降解的多肽HKP09及HKP15与其前体蛋白HKa进行优化组合，在检测时可同时分析紧密联系的多肽和前体蛋白，而不是完全孤立的去分析蛋白或者多肽。突破“混合式”或单一标志物的局限，最终实现该新型标志物与疾病之间的内在联系。所述组合式标志物不同于单一蛋白标志物或者单一多肽标志物，也不能理解为单一多肽和蛋白的简单混合。

本发明提供了一种结直肠癌相关“多肽-蛋白组合式标志物”检测试剂盒，包括捕获抗体和检测抗体；

捕获抗体与蛋白HKa特异性结合；

检测抗体与多肽HKP15、多肽HKP09或蛋白HKa均特异性结合；

多肽HKP09的全长氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

多肽HKP15的全长氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

蛋白HKa的全长氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明中通过对比结直肠癌、结直肠息肉和正常人血清差异谱，筛选出在结直肠癌和结直肠息肉中异常表达的多肽标志物HKP09和HKP15，再利用数据库和免疫共沉淀技术，查找出HKP09和HKP15的前体蛋白为HKa，并验证出共同存在于激肽释放酶—激肽系统(Kallikrein—Kinin system，KKS)代谢通路，该代谢通路与结直肠癌和结直肠息肉的发生发展有着一定相关性。该组合式标志物中的多肽HKP09和HKP15通过酰胺键或二硫键等化学键形式存在于HKa表面，该组合式标志物可作为结直肠癌检测标志物。

作为优选，捕获抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

优选的，捕获抗体为单克隆抗体。

作为优选，检测抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

优选的，检测抗体为单克隆抗体。

作为优选，捕获抗体由保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆细胞株2G6分泌。

作为优选，检测抗体由保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆细胞株3D11分泌。

其中，捕获抗体与蛋白HKa特异性结合；检测抗体与多肽HKP09和HKP15特异性结合；同时，捕获抗体与检测抗体的抗原结合表位不同，进一步理解为捕获抗体不与多肽HKP09或多肽HKP15特异性结合。

作为优选，检测抗体结合有标记物质。

优选的，标记物质为酶。

更优选的，酶为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶ALP。

最优选的，检测抗体上标记HRP酶。

作为优选，本发明所提供的试剂盒还包括HKa标准品、碳酸盐包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、卵清蛋白封闭剂、底物液、硫酸终止液和96孔酶标板。

本发明提供的试剂盒中捕获抗体可以为独立分装，也可包被于酶标板，本发明对此不作限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。

在本发明的实施例中，HKa标准品的浓度为0ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL、120ng/mL、150ng/mL。

底物液以酶催化显色或发光，优选的，底物液为OPD显色液、TMB显色液或NBT/BCIP显色液。

更优选的，底物液为TMB显色液。

优选的，包被缓冲液为0.1mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液。

优选的，洗涤缓冲液为20mmol/L，pH7.4的PBST缓冲液。

优选的，卵清蛋白封闭剂的质量分数为2％。

优选的，终止液为2mol/L的硫酸水溶液。

本发明提供的检测试剂盒在制备结直肠癌相关ELISA检测产品中的应用。

本发明还提供了试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

步骤1：以捕获抗体捕获待测样品中的组合式标志物中的蛋白HKa；

步骤2：以检测抗体检测上述已捕获的蛋白HKa的表位多肽HKP09或多肽HKP15；

步骤3：根据检测值绘制标准曲线，获得待测样品中“多肽-蛋白组合式标志物”的含量。

本发明提供的试剂盒的使用方法中，标准曲线以HKa标准品溶液的浓度为横坐标，以相应浓度孔中的OD₄₅₀值的平均值为纵坐标。

作为优选，试剂盒中捕获抗体由保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆细胞株2G6分泌。

作为优选，试剂盒中检测抗体由保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆细胞株3D11分泌。

作为优选，试剂盒中的捕获抗体包被于固相载体。

优选的，固相载体为酶标板。

作为优选，试剂盒中的检测抗体上含有标记物质。

优选的，标记物质为辣根过氧化物酶HRP。

作为优选，捕获抗体的包被浓度为1000ng/mL。

作为优选，检测抗体的检测滴度为1：2000。

本发明提供的试剂盒可用于结直肠癌相关“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的检测，具体的，该检测方法为双抗体夹心检测，采用本发明提供的试剂盒检测“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”具有良好的准确性和灵敏性。

作为优选，本发明提供的双抗体夹心ELISA试剂盒的具体使用方法包括以下步骤：

步骤1：取试剂盒中包被有捕获抗体的酶标板，分别加入0ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL、120ng/mL、150ng/mL的HKa标准品或以1:20稀释的待测血清样本，每孔100μL。37℃静置孵育1.5小时；

步骤2：弃溶液，各孔用300μL PBST洗涤缓冲液清洗5次，拍干；

步骤3：各孔加入100μL经HRP标记的检测抗体，37℃静置孵育40分钟；

步骤4：弃溶液，各孔用300μL PBST洗涤缓冲液清洗5次，拍干；

步骤5：各孔加入100μL与HRP相作用的TMB底物显色液，37℃避光显色15分钟；

步骤6：各孔加入50μL,2mol/L的硫酸终止液，用酶联检测仪测定OD₄₅₀值；

步骤7：平行测量3次，以HKa标准品的浓度为横坐标，以相应浓度孔中的OD₄₅₀值的平均值为纵坐标，绘制标准曲线和线性方程，将待测样本的OD₄₅₀值带入线性方程，计算得到样本中的标志物含量。

本发明提供了一种试剂盒及其应用，该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体；其中，捕获抗体与蛋白HKa特异性结合；检测抗体与多肽HKP09、多肽HKP15或蛋白HKa均特异性结合。采用本发明提供的试剂盒检测结直肠癌相关的“多肽-蛋白组合式标志物”具有良好的准确性和灵敏性。实验表明，本发明所提供试剂盒的检测范围为6ng/mL～120ng/mL，最低检测限为1.7ng/mL，血清样本的较优检测稀释度为1:20。其中，检测并统计得出108例正常人血清中的“HKP15/HKP09-HKa组合式标志物”的界定值(平均值+2SD)不高于28.4ng/mL，与临床阴性符合率为95.37％。此外，本发明通过比较32例临床病理学确诊的结直肠癌血清样本和108例正常人血清样本，并结合ROC曲线统计表明，本发明提供的试剂盒检测结直肠癌和正常样本的灵敏度为93.7％，特异性为92.7％。

生物保藏说明

保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆抗体杂交瘤细胞3D11于2014年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆抗体杂交瘤细胞2G6于2014年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1示本发明提供试剂盒捕获抗体与检测抗体的检测条件优化；

图2示本发明提供试剂盒检测HKa标准品的标准曲线；

图3示“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”在结直肠癌患者和正常人血清样品中的含量差异；

图4示本发明提供的试剂盒检测肠癌样品的ROC曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种结直肠癌相关“多肽-蛋白组合式标志物”检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂及材料皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：捕获抗体与检测抗体的检测条件优化

1)将捕获抗体用包被缓冲液分别稀释成50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000 ng/mL和2000 ng/mL，按照100μL/孔，4℃放置过夜。

2)取试剂盒中包被有捕获抗体的酶标板，各孔加入100ng/mL的HKa标准品，每孔100μL。37℃静置孵育1.5小时；

3)弃溶液，各孔用300μL PBST洗涤缓冲液清洗5次，拍干；

4)用PBST将HRP标记的检测抗体分别按照1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000稀释，每孔加入100μL，37℃静置孵育40分钟；

5)弃溶液，各孔用300μL PBST洗涤缓冲液清洗5次，拍干；

6)各孔加入100μL与HRP相作用的TMB底物显色液，37℃避光显色15分钟；

7)各孔加入50μL,2mol/L的硫酸终止液，用酶联检测仪测定OD₄₅₀值。

以不同捕获抗体的包被浓度为横坐标，以不同检测抗体工作滴度所对应的OD₄₅₀值为纵坐标，绘制散点图，以OD₄₅₀值为1.5处的明显拐点所对应的捕获抗体浓度和检测抗体滴度为最佳的抗体工作条件。由图1中的椭圆形虚线框所标示处的拐点，可得捕获抗体的较优包被浓度为1000ng/mL，检测抗体的较优工作滴度为1：2000。

实施例2：试剂盒的制备

1、试剂的配制

碳酸盐包被缓冲液：pH9.6，0.1mol/L，称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g加去离子水至1000ml。

PBST洗涤缓冲液：pH值为7.4，其中包括80mmol/L的Na₂HPO₄、20mmol/L的KH₂PO₄、100mmol/L的KCl、1400mmol/L的NaCl、体积分数为0.5％的Tween-20。

TMB显色液：底物显色A液：醋酸钠13.6g,柠檬酸1.6g,30％双氧水0.3ml,蒸馏水加至500ml；底物显色B液:乙二胺四乙酸二钠0.2g,柠檬酸0.95g,甘油50ml,取0.15g TMB溶于3mlDMSO中，蒸馏水加至500mL。取底物显色A液与底物显色B液等体积混合，即得TMB显色液。

硫酸终止液：配制浓度为2M的硫酸水溶液。

2、捕获抗体的包被

取保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆杂交瘤细胞株2G6，经小鼠体内诱生制得与HKa特异性结合的单克隆抗体，用包被液稀释至浓度为1000ng/mL。取100μL置于96孔酶标板板中，4℃放置过夜；弃包被液，用20mmol/L、pH7.4的PBST缓冲液300μL清洗5次，拍干；加入300μL质量分数为2％的OVA封闭液，37℃静置封闭2小时；弃OVA封闭液用20mmol/L、pH7.4PBST缓冲液300μL清洗5次，拍干。

3、检测抗体的标记

取保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆杂交瘤细胞株3D11，经小鼠体内诱生制得能与多肽HKP15/HKP09特异性结合的单克隆抗体，在抗体上标记HPR酶，以PBST缓冲液稀释，使最终检测滴度为1:2000。

4、分装

取PBST缓冲液、TMB显色液、硫酸终止液、经标记的检测抗体，包被有捕获抗体的酶标板分别独立包装，即得。

实施例3：试剂盒最低检测限及检测范围的鉴定

取实施例2制得的试剂盒，配制梯度浓度的HKa标准品溶液为待测样品，HKa标准品的浓度为：0ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL、120ng/mL、150ng/mL。

取试剂盒中包被有捕获抗体的酶标板，分别加入不同浓度的HKa标准品溶液，每孔100μL，每一浓度重复3次。37℃静置孵育1.5小时；弃溶液，各孔用300μL试剂盒中PBST缓冲液清洗5次，拍干；

各孔加入100μL以HRP标记的检测抗体，37℃静置孵育40分钟；弃溶液，各孔用300μL试剂盒中PBST缓冲液清洗5次，拍干；

各孔加入100μL TMB显色液，37℃避光显色15分钟；加入50μL 2mol/L硫酸溶液，终止反应；用酶联检测仪测定OD₄₅₀值。

以HKa标准品溶液的浓度为横坐标，以相应浓度孔中的OD₄₅₀值的平均值为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图2所示。该标准曲线回归方程为y＝0.0146x+0.0043，R²＝0.9993。

如图2所示，本发明提供的试剂盒的检测范围为6ng/mL～120ng/mL，最低检测限为1.7ng/mL，

实施例4 试剂盒的使用

取实施例1制备的试剂盒，以肿瘤患者的血清为待测样品，以正常人血清为阴性对照样品，说明本发明提供试剂盒的使用方法。

实验设计如表1所示：

表1实验设计

分别取各组待测样品，每个血清样品以试剂盒中提供的PBST缓冲液按1:20稀释后，取100μL加入包被有捕获抗体的酶标板上，37℃静置孵育1.5小时；弃溶液，各孔用300μL试剂盒中PBST缓冲液清洗5次，拍干；各孔加入100μL以HRP标记的检测抗体，37℃静置孵育40分钟；弃溶液，各孔用300μL试剂盒中PBST缓冲液清洗5次，拍干；各孔加入100μL TMB显色液，37℃避光显色15分钟；加入50μL 2mol/L硫酸溶液，终止反应；用酶联检测仪测定OD₄₅₀值。根据实施例3绘制的标准曲线，确定各血清样品中“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的含量。

表2各组血清样品中“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的含量

另外，“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”在结直肠癌患者和正常人血清样品中的含量差异如图3所示。

结果显示：108例正常人血清中“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的平均含量为10.9mg/mL，检测值的标准偏差SD为8.78，以平均值+2SD作为其在正常人群的界定值，含量为28.4ng/mL，依据此界定值作为区分标准，则所检测的108例正常人样本中，有103例的检测值低于28.4ng/mL，与临床阴性符合率为95.37％。与正常样本相比，肠癌样本的标志物含量要显著升高(P<0.001)。

可见，采用本发明提供的试剂盒,通过检测“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”在血清中的含量，可以区分正常人与肠癌患者。正常人血清中“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的界定值不高于28.4ng/mL。

实施例5 试剂盒检测特异性和灵敏度检测

根据实施例4提供的检测结果，分别绘制肠癌患者血清样品的ROC曲线(受试者工作特征曲线)，结果表明：

检测结直肠肠癌和正常样本的灵敏度为93.7％，特异性为92.7％，如图4；

表明本发明的试剂盒能够显著区分结直肠癌患者样本和正常人样本，检测灵敏度和特异性高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种结直肠癌相关“多肽-蛋白组合式标志物”检测试剂盒，其特征在于，包括捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体与蛋白HKa特异性结合；所述检测抗体与多肽HKP15、多肽HKP09或蛋白HKa均特异性结合；

所述多肽HKP09的全长氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述多肽HKP15的全长氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述蛋白HKa的全长氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述捕获抗体由保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆细胞株2G6分泌；所述检测抗体由保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆细胞株3D11分泌。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括HKa标准品、碳酸盐包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、卵清蛋白封闭剂、底物液、硫酸终止液和96孔酶标板。

3.如权利要求1～2任一项所述的试剂盒在制备结直肠癌相关ELISA检测产品中的应用。