CN104672327B - 一种蛋白质及编码该蛋白质的基因，其用于抗肿瘤的用途及作为抗肿瘤药物辅助药剂的应用 - Google Patents

一种蛋白质及编码该蛋白质的基因，其用于抗肿瘤的用途及作为抗肿瘤药物辅助药剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蛋白及其编码基因，进一步涉及一种蛋白质及编码该蛋白质的基因，及其用于抗肿瘤的用途及其作为治疗肿瘤药物辅助药剂的应用。为了解决现有治疗肿瘤、特别是胶质瘤治疗效果不理想的问题，本发明提供一种蛋白质及编码该蛋白质的基因。所述蛋白质包括或选自下面的氨基酸序列：(a)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或者(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抑制肿瘤细胞功能的由(a)衍生的蛋白质；所述蛋白质及编码该蛋白质的基因用于抗肿瘤，并作为治疗肿瘤药物辅助药剂应用。

Description

一种蛋白质及编码该蛋白质的基因，其用于抗肿瘤的用途及 作为抗肿瘤药物辅助药剂的应用
技术领域
本发明涉及蛋白及其编码基因，进一步涉及一种蛋白质及编码该蛋白质的基因，及其用于抗肿瘤的用途及其作为治疗肿瘤药物辅助药剂的应用，特别涉及KNG1-D5蛋白及其编码基因用于抗胶质瘤的用途，及作为TMZ辅助药剂的应用。
背景技术
激肽原1(KNG1)的英文名称是Kininogen 1(KNG1)。
KNG1属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族中家族3的成员，由644个氨基酸残基组成，是血浆中一类具有多个结构域的多功能糖蛋白，由6个结构域组成。
现有治疗胶质瘤的方式包括手术、放疗、化疗，以及传统的中医治疗方法等，但效果都不理想，40％～50％胶质瘤患者的生存期约为8-11个月。现有常用的化疗药物是替莫唑胺(TMZ)，贝伐珠单抗(Avastin)等，但治疗效果也不理想。
发明内容
为了解决现有肿瘤治疗、特别是胶质瘤治疗效果不理想的问题，本发明提供一种蛋白质及编码该蛋白质的基因，及其用于抗肿瘤的用途及其作为治疗肿瘤药物辅助药剂的应用。本发明进一步提供转KNG1基因及KNG1-D5蛋白用于抗胶质瘤的用途及其作为TMZ辅助药剂的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：
一种蛋白质，所述蛋白质包括或选自下面的氨基酸序列：
(a)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或者
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抑制肿瘤细胞功能的由(a)衍生的蛋白质；
所述蛋白质用于治疗肿瘤。进一步的，所述蛋白质用于治疗胶质瘤。
进一步的，所述蛋白质是KNG1-D5蛋白质。KNG1-D5蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，所述KNG1-D5蛋白质用于治疗肿瘤。进一步的，所述KNG1-D5蛋白质用于治疗胶质瘤。
一种编码权利要求1所述的蛋白质的基因，所述基因包括或选自下面的碱基序列：
(c)如SEQ ID NO：1所示的碱基序列；或者，
(d)编码权利要求1的(b)中所述蛋白质的基因碱基序列；
所述基因用于治疗肿瘤。进一步的，所述基因用于治疗胶质瘤。
进一步的，所述基因是编码KNG1-D5蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述基因用于治疗肿瘤。进一步的，所述编码KNG1-D5蛋白的基因用于治疗胶质瘤。
SEQ ID NO：2所示蛋白质是94个氨基酸的蛋白质亚基，简称为KNG1-D5-94aa。
进一步的，所述SEQ ID NO：2所示氨基酸序列(KNG1-D5-94aa)衍生的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，简称为KNG1-D5-102aa。
进一步的，编码所述KNG1-D5-102aa蛋白的基因序列如SEQ ID NO：6所示。
进一步的，所述蛋白质是KNG1蛋白，所述KNG1蛋白质用于治疗肿瘤。进一步的，所述KNG1蛋白质用于治疗胶质瘤。
进一步的，所述基因是转KNG1基因，所述转KNG1基因用于治疗肿瘤。进一步的，所述KNG1基因用于治疗胶质瘤。
一种治疗肿瘤的药物，所述药物中含有本发明所述的蛋白质和/或基因。
一种治疗胶质瘤的药物，所述药物中含有本发明所述的蛋白质和/或基因。
上述的蛋白质的应用，所述蛋白质用于治疗肿瘤药物的辅助药剂。
进一步的，所述肿瘤为胶质瘤。
上述基因的应用，所述基因用于治疗肿瘤药物的辅助药剂。进一步的，所述肿瘤为胶质瘤。
进一步的，本发明提供的基因作为替莫唑胺(TMZ)治疗胶质瘤的辅助药剂的应用，所述包装KNG1基因的慢病毒滴度为1.5×106TU/ml至1.6×106TU/ml。
进一步的，上述蛋白质作为治疗胶质瘤的辅助药剂的应用，所述的蛋白质作为替莫唑胺(TMZ)治疗胶质瘤的辅助药剂应用，所述KNG1蛋白质的浓度为0.1μM至6μM。进一步的，所述KNG1蛋白质的浓度为2μM至6μM。
转KNG1基因的碱基序列全长如SEQ ID NO：3所示。
所述KNG1蛋白质的氨基酸序列全长如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供一种制备所述KNG1-D5蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：
1载体构建
1.1以正常人外周血白细胞cDNA为模板，扩增KNG1-D5结构域，扩增产物带BamHI及XhoI酶切位点；
1.2将PCR扩增产物与pET30a载体分别用BamHI及XhoI双酶切；
1.3酶切片段回收、连接、转化E.coli DH5α；
1.4提取质粒，用T7promoter primer(T7启动子引物)及T7terminator primer(T7终止子引物)进行PCR鉴定，扩增得到约615bp左右片段；
1.5将鉴定正确的质粒测序验证，结果正确者为重组质粒pET30a-KNG1-D5；
2蛋白表达及纯化
2.1将pET30a-KNG1-D5质粒转化E.coli DH5α，扩大培养于5瓶400ml LB+Kan培养基中，37℃培养至OD6000.5-0.8左右；
2.2加入IPTG至终浓度为0.5mM，28℃诱导4h；
2.3菌液4000g离心5min，弃上清，重悬于100ml左右His-binding buffer(含10mMImidazole)中；
2.4 4000g离心5min，弃上清，重悬于50ml左右His-binding buffer中；
2.5高压破碎菌体，至菌液澄清；
2.6 15000g离心15min，吸取上清至新的离心管中；
2.7加入5μl Benzonase(核酸酶)，放置15min，15000g离心15min，吸取上清至新的离心管中；
2.8将HISTRAP HP纯化柱(GE)连入AKTA UPC100纯化系统；
2.9 20倍柱体积His-binding buffer(His-柱结合缓冲液)平衡系统及纯化柱；
2.10菌液上样；
2.11His-binding buffer洗涤至基线；
2.12His-elution buffer(His-柱洗脱缓冲液)(含250mM Imidazole)洗脱目的蛋白，收集流出组分；
2.13 5倍柱体积His-elution buffer(含500mM Imidazole(咪唑))再生纯化柱；
2.14 10倍柱体积His-binding buffer重新平衡纯化柱；
2.15将各收集组分进行SDS-PAGE电泳，D5-His目的条带约为17KD；
2.16将目的蛋白较纯的几支纯化组分合并，加入超滤管(3KD)中，4000g离心浓缩，加入PBS超滤2-3次，置换缓冲液为PBS(磷酸盐缓冲液)；
2.17BCA法进行蛋白定量，纯化得到的D5-His分装后保存于-80℃冰箱中。
本发明提供的蛋白质及编码该蛋白质的基因用于抗肿瘤，并作为治疗肿瘤药物的辅助药剂应用。本发明提供的蛋白质和基因具有抑制肿瘤的效果。本发明提供的蛋白质和基因可以作为辅助药剂治疗肿瘤。本发明提供的KNG1-D5蛋白、KNG1基因及KNG1蛋白可以作为TMZ的辅助药剂治疗胶质瘤，使TMZ的治疗效果更好。
附图说明
图1为KNG1-D5-94aa蛋白纯化图片；
图2为胶质瘤患者MRI检测图像；
图3正常人脑组织与不同恶性程度的胶质瘤病人脑组织中KNG1基因表达量的对比；
图4是激光共聚焦显微镜(40×)观察图像，转KNG1基因抗胶质瘤作用；
图5是激光共聚焦显微镜(20×)观察图像，血管内皮细胞小管生成实验；
图6是激光共聚焦荧光显微镜观察图像，将转KNG1基因U87细胞打入斑马鱼体节处，建立斑马鱼胶质瘤动物模型；
图7是KNG1-D5蛋白或生理盐水治疗大鼠胶质瘤动物模型后，使用免疫组化和Western Blot方法检测肿瘤包块中CD31及KNG1-D5蛋白的表达；
图8是CCK8检测U87细胞增殖实验的曲线图；
图9是U87细胞划痕实验的显微镜观察图像；
图10是U87细胞迁移实验的显微镜观察图像；
图11KNG1-D5蛋白联合TMZ对由U87细胞分选出的胶质瘤干细胞增殖的影响。
具体实施方式
下面实施例中所述的蛋白为KNG1-D5蛋白，所述的基因为KNG1全长基因。
如图1所示：本发明获得KNG1-D5蛋白质。
如图2所示：图2为胶质瘤患者MRI检测图像，图2A，图2C显示高血管生成密度组胶质瘤患者(High MVD)；图2B，图2D显示低血管生成密度组胶质瘤患者(Low MVD)。
如图3所示：在I,II级胶质瘤病人脑组织中KNG1基因表达量是正常人脑组织中该基因表达量的0.65倍，在III,IV级胶质瘤病人脑组织中KNG1基因表达量是正常人脑组织中该基因表达量的0.38倍。可以得出，在胶质瘤病人脑组织中KNG1基因表达水平明显低于正常样本。且随着恶性程度增高，KNG1基因表达水平降低。
如图4所示：图4是激光共聚焦显微镜(40×)观察图像，图4A，图4B显示：转KNG1基因诱导Ca2+超载，导致胶质瘤细胞凋亡，表明转KNG1基因具有抗胶质瘤作用。图4C、图4D显示：KNG1-D5蛋白诱导Ca2+超载，导致胶质瘤细胞凋亡，表明KNG1-D5蛋白具有抗胶质瘤作用。
如图5所示：图5是激光共聚焦显微镜(20×)观察图像，血管内皮细胞小管生成实验，图5A、图5B显示：转KNG1基因诱导Ca2+超载，导致胶质瘤血管内皮细胞凋亡，表明转KNG1基因具有抗胶质瘤血管内皮小管生成作用。图5C、图5D显示：KNG1-D5蛋白诱导Ca2+超载，导致胶质瘤血管内皮细胞凋亡，表明KNG1-D5蛋白具有抗胶质瘤血管内皮小管生成作用。
实施例1制备KNG1-D5蛋白质(KNG1-D5-94aa)
1载体构建
1.1以正常人外周血白细胞cDNA为模板，扩增KNG1-D5结构域，扩增产物带BamHI及XhoI酶切位点。
1.2将PCR扩增产物与pET30a载体分别用BamHI及XhoI双酶切。
1.3酶切片段回收、连接、转化E.coli DH5α。
1.4提取质粒，用T7 promoter primer及T7 terminator primer进行PCR鉴定，扩增得到约615bp左右片段。
1.5将鉴定正确的质粒测序验证，结果正确者为重组质粒pET30a-KNG1-D5。
2蛋白表达及纯化
2.1将pET30a-KNG1-D5质粒转化E.coli DH5α，扩大培养于5瓶400mlLB+Kan培养基中，37℃培养至OD6000.5-0.8左右。
2.2加入IPTG至终浓度为0.5mM，28℃诱导4h。
2.3菌液4000g离心5min，弃上清，重悬于100ml左右His-binding buffer(含10mMImidazole)中。
2.4 4000g离心5min，弃上清，重悬于50ml左右His-binding buffer中。
2.5高压破碎菌体，至菌液澄清。
2.6 15000g离心15min，吸取上清至新的离心管中。
2.7加入5μl Benzonase，放置15min，15000g离心15min，吸取上清至新的离心管中。
2.8将HISTRAP HP纯化柱(GE)连入AKTA UPC100纯化系统。
2.9 20倍柱体积His-binding buffer平衡系统及纯化柱。
2.10菌液上样。
2.11His-binding buffer洗涤至基线。
2.12His-elution buffer(含250mM Imidazole)洗脱目的蛋白，收集流出组分。
2.13 5倍柱体积His-elution buffer(含500mM Imidazole)再生纯化柱。
2.14 10倍柱体积His-binding buffer重新平衡纯化柱。
2.15将各收集组分进行SDS-PAGE电泳，D5-His目的条带约为17KD。
2.16将目的蛋白较纯的几支纯化组分合并，加入超滤管(3KD)中，4000g离心浓缩，加入PBS超滤2-3次，置换缓冲液为PBS。
2.17BCA法进行蛋白定量，纯化得到的D5-His分装后保存于-80℃冰箱中。
如图1所示，1表示诱导前，2表示诱导后，3表示破碎后上清，4表示破碎后沉淀，5表示纯化后的蛋白质。本实施例获得KNG1-D5-94aa蛋白质。
实施例2
使用实施例1得到的KNG1-D5-94aa蛋白质或过表达KNG1基因对建立的斑马鱼胶质瘤动物模型进行治疗。
(1)第一种治疗方式
分别将1μl(1微升)的生理盐水混合液注射入斑马鱼体节间。1微升的生理盐水混合液内含有D5蛋白和200-500个U87细胞，其中，D5蛋白的浓度分别为0.001μM，0.01μM，0.1μM，1μM。
实验结果显示，U87细胞可以使斑马鱼产生肿瘤包块，0.1μM D5蛋白能够有效抑制肿瘤包块的生长。
(2)第二种治疗方式
将过表达KNG1基因的U87细胞注射入斑马鱼体节间。
步骤如下：
1、包装KNG1基因的慢病毒载体，慢病毒转染前18-24h，将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。
2、第二天，用含6μg/ml polybrene(聚凝胺)的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育。
3、4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显绿色荧光GFP表达，72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96h进行。慢病毒含有NEO(新霉素)抗性基因，加G418800μg/ml进行筛选，换液一次后，在400μg/ml维持浓度中培养，筛选病毒感染的过表达KNG1基因的U87细胞。
6、离心分离上清后，PBS重悬细胞液，1×104个注射入斑马鱼体节间。
治疗结果，如图6所示。图6A(注射后第3天)和图6B(注射后第14天)，将过表达KNG1基因的U87细胞注射入斑马鱼体节处，建立斑马鱼胶质瘤KNG1治疗组动物模型。图6C(注射后第3天)和图6D(注射后第14天)，将转对照空载体U87细胞注射入斑马鱼体节处，建立斑马鱼胶质瘤对照组动物模型。图6B中的肿瘤包块小于图6A中的肿瘤包块，说明KNG1基因起到了抑制U87细胞形成胶质瘤的作用。
实施例3
使用实施例1得到的KNG1-D5-94aa蛋白质对裸鼠胶质瘤动物模型进行治疗，步骤如下：
(1)人胶质瘤细胞系U87细胞注射入裸鼠大脑尾状核，建立胶质瘤大鼠模型。分别采用实施例1得到的KNG1-D5蛋白质或生理盐水对建立的大鼠脑胶质瘤动物模型进行治疗。(2)KNG1-D5蛋白质或生理盐水治疗大鼠胶质瘤动物模型后，采用免疫组化和Western Blot方法检测肿瘤包块内CD31和KNG1的表达。
治疗结果，参照图7进行详细说明：
图7A1显示：免疫组化方法检测KNG1-D5蛋白或生理盐水治疗大鼠胶质瘤动物模型后，肿瘤包块中CD31的表达；由图7A1可以看出：KNG1-D5蛋白治疗组胶质瘤包块内CD31阳性细胞数目减少(褐色代表阳性，20倍显微镜观察)。
图7A2柱形图表示CD31的表达量。CD31表达水平代表胶质瘤内平均血管密度MVD。由图7A2可以看出，KNG1-D5蛋白治疗组胶质瘤包块周围的血管减少。
图7B1显示：Western Blot方法检测KNG1-D5蛋白或生理盐水治疗大鼠胶质瘤动物模型后，肿瘤包块中KNG1-D5蛋白的表达；由图7B1可以看出，KNG1-D5蛋白治疗组胶质瘤包块中KNG1-D5蛋白表达量高于生理盐水对照组。
图7B2柱形图表示不同治疗组胶质瘤包块内KNG1-D5蛋白的表达水平。由图7B2可以看出，KNG1-D5蛋白给药组胶质瘤包块内KNG1-D5蛋白表达量较高。
实施例4
利用实施例1提供的KNG1-D5-94aa蛋白，简称D5蛋白。
一、人胶质瘤U87细胞系给药(KNG1-D5-94aa)后细胞增殖实验
实验方法如下：
1、U87细胞接种于96孔板(10％血清DMEM)，5000-8000个细胞/孔(100μl)，4h贴壁后，分别加入0μM、1μM、1.5μM、2μM纯化后KNG1-D5蛋白；
2、分别于0、16、24、48h加入10μl CCK8，37℃温浴3h；
3、450nm读取吸光值(OD值)并绘制曲线。
测得的OD值如下表所示：
时间 空白对照组 1μM D5 1.5μM D5 2μM D5
0h 0.31 0.34 0.40 0.37
16h 0.59 0.57 0.54 0.51
24h 1.15 1.00 0.99 0.95
48h 2.19 2.11 1.93 1.94
如图8所示，加入KNG1-D5-94aa蛋白后，U87细胞在24h增殖受到明显抑制，48h受到抑制现象更为明显。实验结果表示KNG1-D5-94aa蛋白能够抑制U87细胞系的增殖能力。
二、人胶质瘤U87细胞系给药(KNG1-D5-94aa)后细胞迁移实验
实验过程如下：
划痕实验：取对数生长期U87细胞铺6孔板。用100μl枪头在细胞培养板各孔中央位置划出一条贯穿培养孔的划痕，加2ml培养基。此时，对刚刚划痕的细胞培养板拍照，作为0小时迁移图。给药组加入KNG1-D5蛋白，培养8-30小时，显微镜(10×)进行观察，并对划痕附近的细胞迁移情况拍照记录。
Transwell实验：使用无血清培养基制备U87单细胞悬液，细胞浓度为5×105/ml。Transwell上室加入100μl细胞悬液(5×104)，Transwell下室加入500μl10％FBS(胎牛血清)的完全培养基。给药组加入KNG1-D5蛋白，培养8-24小时后，用湿棉签轻轻擦去聚碳酯膜上表面的细胞，使用结晶紫染色，显微镜(20×)下随机选取6个视野计数，取平均值。
实验结果，如图9和图10所示：
划痕试验：对照组细胞迁移能力显著高于给药组(24h产生差异，30h差异最为明显)。
Transwell细胞迁移实验：对照组迁移能力显著高于给药组(24h)。
上述实验结果表示KNG1-D5-94aa蛋白能够抑制U87细胞系的迁移能力。
三、人胶质瘤A172细胞系给药(KNG1-D5-94aa)后细胞迁移实验
实验结果与上述人胶质瘤U87细胞系给药(KNG1-D5-94aa)后细胞迁移实验的结果相似。实验结果表示KNG1-D5-94aa蛋白能够抑制A172细胞系的迁移能力。
四、人胶质瘤U251细胞系给药(KNG1-D5-94aa)后细胞迁移实验
实验结果与上述人胶质瘤U87细胞系给药(KNG1-D5-94aa)后细胞迁移实验的结果相似。实验结果表示KNG1-D5-94aa蛋白能够抑制U251细胞系的迁移能力。
实施例5
将实施例1得到的KNG1-D5-94aa蛋白作为替莫唑胺(TMZ)辅助药剂的应用(即：利用本发明提供的KNG1-D5蛋白辅助TMZ治疗胶质瘤)。
实验过程如下：
取对数生长期的U87细胞系分离出的胶质瘤干细胞接种于96孔培养板，细胞密度2×104/ml，置37℃、5％CO2条件下培养4-6小时，分别加入TMZ、TMZ联合2μM D5蛋白、TMZ联合6μM D5蛋白；所述TMZ的终浓度是100μM，所述D5蛋白的浓度是指D5蛋白加入每个孔内的终浓度。每个药物浓度设5个复孔，同时设置空白对照组及阴性对照组。药物作用48小时后，每孔加入CCK8溶液10μl，37℃继续培养2小时，全自动酶标仪检测波长450nm的吸光度OD值。
实验结果如图11所示，KNG1-D5蛋白对U87细胞系分离出的胶质瘤干细胞具有抑制作用，并且，2μM D5蛋白和6μM D5蛋白联合TMZ药效好于单独TMZ。2μM D5蛋白联合TMZ药效最好。
实施例6制备KNG1-D5-102aa蛋白
如实施例1所述方法制备，其中，采用如SEQ ID NO：6所示基因。
实施例7
使用实施例6得到的KNG1-D5-102aa蛋白质对建立的斑马鱼胶质瘤动物模型进行治疗。
治疗方式如实施例2所示，治疗结果表明KNG1-D5-102aa蛋白质能够抑制斑马鱼体内的肿瘤生长。
实施例8
使用实施例6得到的KNG1-D5-102aa蛋白质对建立的裸鼠胶质瘤动物模型进行治疗。
治疗方式如实施例3所示，治疗结果表明KNG1-D5-102aa蛋白质能够抑制裸鼠体内肿瘤生长。
实施例9
U87细胞给药(KNG1-D5-102aa)后功能实验
实验过程如实施例4所示，实验结果表明KNG1-D5-102aa蛋白质能够抑制胶质瘤细胞的迁移或增殖能力。
实施例10
将实施例6得到的KNG1-D5-102aa蛋白作为替莫唑胺(TMZ)辅助药剂的应用(即：利用本发明提供的KNG1-D5蛋白辅助TMZ治疗胶质瘤)
实验过程如实施例5所示，实验结果表明KNG1-D5-102aa蛋白质联合TMZ药效好于单独TMZ。
实施例11
本发明提供一种制备KNG1全长基因真核表达载体的方法，所述方法包括下述步骤：
一、PCR扩增目的基因
PCR扩增KNG1cDNA全长，在引物中引入EcoRI和BamHI酶切位点.
按以下组分制备PCR反应体系：
按以下条件设置反应程序进行PCR反应：
琼脂糖凝胶回收目的条带，大小为1935bp。
二、真核表达载体的构建
1、载体质粒pLVX-mCMV-ZsRed-PGK-Puro及目的基因的EcoRI+BamHI双酶切，酶切反应在37℃水浴反应2h，载体质粒酶切体系如下：
组分 体积
质粒pLVX-mCMV-ZsRed-PGK-Puro 1μg
10×Buffer 2μl
10×BSA(牛血清白蛋白) 2μl
EcoRI 1μl
BamHI 1μl
dd H<sub>2</sub>O(双蒸水) 加至20μl
目的基因酶切体系如下：
组分 体积
PCR回收产物 14μl
10×Buffer 2μl
10×BSA 2μl
EcoRI 1μl
BamHI 1μl
分别回收质粒pLVX-mCMV-ZsRed-PGK-Puro酶切大片段和目的基因酶切产物。
2、质粒pLVX-mCMV-ZsRed-PGK-Puro EcoRI+BamHI回收大片段与目的基因连接，连接反应在22℃反应2h，连接反应体系如下：
组分 体积
KNG1 6μl
pLVX-mCMV-ZsRed-PGK-Puro 2μl
10×DNA Ligase Buffer 1μl
T4DNA Ligase(连接酶) 1μl
3、连接产物转化。取10μl上述连接产物与100μl JM109感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激45s，立即置冰上放置2min，加入预热至室温的400μl LB培养基，37℃恒温摇床培养1h，4000rpm离心1min，弃去400μl培养上清，剩余100μl用移液器混匀后均匀涂布于含100μg/ml Ampicillin(氨苄西林)抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜。
4、挑取1个单菌落接种于含5ml，100μg/ml Ampicillin(氨苄西林)抗性的LB培养液中，250rpm，37℃恒温摇床培养过夜，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，经质粒BamHI+EcoRI双酶切鉴定，阳性克隆可切出1935bp的条带。鉴定正确的重组克隆进行测序验证。
pLVX-mCMV-ZsRed-PGK-Puro-KNG1
本实施例中得到的KNG1全长基因的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。
实施例12
本发明提供一种制备编码KNG1全长基因的慢病毒包装及表达的方法，所述包装操作步骤如下：
1、在转染的前一天，传代准备细胞：用0.25％胰蛋白酶消化293T细胞，以含10％血清的DMEM培养基调整细胞密度后，按照每10cm细胞培养皿接种6-8×106cells(细胞)到10cm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，16h-24h后待细胞密度生长到80％-90％时即可用于转染。
2、第二天，在转染前2-4h，用5ml完全培养基换液(DMEM+5％FBS)。
3、按照以下实验步骤来进行转染：
A、加入500μl HET Buffer A到一支洁净的1.5ml EP管中(可标记为A管)
B、在另一支洁净的1.5ml EP管中(可标记为B管)，加入以下试剂，终体系为500μl。
试剂名称试剂数量：
Vector(pLVX-mCMV-ZsRed-PGK-Puro-KNG1)10μl(1.0μg/μl)
Lentiviral packaging mixture(慢病毒包装混合物)15μl(1.0μg/μl)
(3个质粒pGag/Pol,pRev,pVSV-G)
HET Buffer B 50μl
ddH2O 425μl
C、将B管中的DNA混合液缓缓逐滴加入到A管中，用移液器轻轻混匀10min。
D、将混匀后的混合物室温静置30min，然后将混合物逐滴均匀加入到10cm细胞培养皿中，轻微混匀。置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
4、第三天，即培养12-16h后弃去培养基，用10ml新鲜的完全培养基换液(DMEM+10％FBS+P/S(青/链霉素))。
5、第四天，即换液后24h，收集上清液，置于4℃冰箱保存，然后加入10ml新鲜的完全培养基(DMEM+10％FBS+P/S)至10cm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱继续培养。
6、第五天：再一次收集上清，与第一次收集的上清液混合，1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液以0.45μm PVDF(聚偏氟乙烯)滤器过滤至50ml圆底离心管中。
7、4℃，50000g高速离心2h，离心后可用记号笔对病毒沉淀做好标记。
8、小心弃去上清，晾干，按200μl/10cm培养皿的量加入DMEM(不含血清、双抗)或者PBS重悬病毒沉淀，室温静置2h，然后用移液器轻轻地吹匀(避免产生气泡)，继续室温放置30min，按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5ml EP管中，-80℃冰箱保存。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡是根据本发明内容所做的均等变化与修饰，均涵盖在本发明的专利范围内。

Claims (2)

1.一种蛋白质用于制备治疗胶质瘤的药物的用途，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：5所示。
2.一种治疗胶质瘤的药物，其特征在于：所述药物中含有权利要求1所述的蛋白质。
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野生型及突变型高分子激肽原D5H抑制肿瘤细胞转移的研究;陈丽娜等;《沈阳药科大学学报》;20150120;第32卷(第1期);第59页左栏第1段 *

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